專利名稱：用于油田微生物增產(chǎn)或環(huán)保的微生物菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物采油技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種用于油氣田微生物增產(chǎn)或環(huán)保用 途的微生物菌粉產(chǎn)品的制備方法，更具體地說是針對用于油田增產(chǎn)或環(huán)保的微生物，利用 三種不同的保護(hù)劑，來制備微生物固體菌劑的技術(shù)，并涉及其應(yīng)用范圍。
背景技術(shù)：
微生物提高原油采收率技術(shù)(ME0R技術(shù))，是一種將微生物及營養(yǎng)液注入地層中， 通過微生物在地層中生長代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑、氣體、聚合物、有機(jī)酸、有機(jī)酮、有機(jī) 酯等物質(zhì)來提高原油采收率的方法。自1926年Beckman提出細(xì)菌能夠采油至今，微生物清 蠟和降低重油粘度、微生物選擇性封堵地層、微生物吞吐、微生物強(qiáng)化水驅(qū)等技術(shù)已成為繼 傳統(tǒng)的熱驅(qū)、化學(xué)驅(qū)、氣驅(qū)之后的第四種提高采收率的方法。為提高微生物的性能及增產(chǎn)效果，傳統(tǒng)的微生物驅(qū)工藝建議在注入井附近建立適 當(dāng)?shù)奈⑸锱囵B(yǎng)設(shè)備和存儲設(shè)備，以保證微生物的濃度和活性。這種工藝不僅提高了微生 物采油的成本，在實際應(yīng)用中也是難以實現(xiàn)的。但如果將事先生產(chǎn)好的微生物發(fā)酵液或菌 泥運(yùn)輸?shù)接吞镞M(jìn)行施工，由于運(yùn)輸過程中溫度、溶氧等條件難以控制，微生物的活性將難以 保證，且由于注入量較大，液體發(fā)酵液的運(yùn)輸成本也將大大提高。因此使用保護(hù)劑對微生物 制劑進(jìn)行處理，將微生物發(fā)酵液制成固體菌劑的形式，具有體積小、運(yùn)輸方便、室溫下可貯 存、活化率高、水溶性好，保質(zhì)期長，可提高產(chǎn)品性能等優(yōu)點(diǎn)，是解決上述問題的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將油田增產(chǎn)或環(huán)保用微生物制備成固體菌劑的新方法， 具有活化率較高，活化后代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較高，保質(zhì)期較長，運(yùn)輸方便的微生物菌劑制備方 法。其具有使用范圍廣泛、操作簡單、成本低、活化率高等優(yōu)點(diǎn)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明微生物菌劑的制備方法采用冷凍干燥和低溫烘干兩種 方法，包括如下步驟1.培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基，121°C高壓滅菌20min，備用；用于培養(yǎng)微生物的LB培 養(yǎng)基按重量百分比由0. 2-3%蛋白胨、0. 1-2%酵母粉、0. 1-3%氯化鈉，余量為水組成，自然 PH值。2.搖瓶培養(yǎng)將目的菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，條件為溫度 37-60°C，轉(zhuǎn)速100-160rpm，三角瓶裝液量20-40%，培養(yǎng)時間12_48h ；3.種子罐發(fā)酵，按1-3%的接種量將目的菌的搖瓶菌液移入種子罐，進(jìn)行發(fā)酵 培養(yǎng)，條件為罐溫37-60°C，罐壓0.02-0. 08MPa，通氣量1 1. 0-1. 5v/v/min，攪拌速度 300-400rpm、發(fā)酵時間 12_24h ；4.發(fā)酵罐發(fā)酵按1-15 %的接種量將目的菌種子液移至發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)，條件為罐溫37-60°C，罐壓0.02-0. 08MPa，通氣量1 1. 0-1. 5v/v/min，攪拌速度 300-400rpm、發(fā)酵時間16_24h，使發(fā)酵液中菌濃度為1 X IO10-I X IO14個/mL ；
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步驟3和4中微生物發(fā)酵培養(yǎng)液按重量比由1-5%葡萄糖、0. 1-2%酵母粉、 0. 1-3%的1(2朋04、0· 05-0. 5% MgSO4 ·5Η20、0. 01-0. 5% CaCl2 · 5Η20、余量為蒸餾水組成，并 調(diào)節(jié)PH為7.0。5.菌泥的制備將發(fā)酵好的發(fā)酵液在室溫，5000-10000rpm的條件下離心 10-15min，將離心沉淀物用無菌水洗滌兩次，再次離心，即得到菌泥。6.保護(hù)劑配制與滅菌1)基于保護(hù)劑配方1的保護(hù)劑配制與滅菌保護(hù)劑配方1 按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比(g/L)脫脂乳粉質(zhì)量濃度 0. 5-2. 5，蔗糖質(zhì)量濃度0. 1-1 ；滅菌方法脫脂乳紫外滅菌30min ；蔗糖121°C高壓蒸汽滅菌15min。滅菌后將 二者在無菌條件下混合均勻；2)基于保護(hù)劑配方2的保護(hù)劑配制與滅菌保護(hù)劑配方2 按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比(g/L)地瓜淀粉質(zhì)量濃度 0. 5-2. 5，甘油質(zhì)量濃度0. 1-1，碳酸鈣質(zhì)量濃度0.01-0. 2 ；滅菌方法121°C高壓蒸汽滅菌15min ；3)基于保護(hù)劑配方3的保護(hù)劑配制與滅菌保護(hù)劑配方3 按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比(g/L)麩皮質(zhì)量濃度0. 1-1， 蔗糖質(zhì)量濃度0.2-1，甘油質(zhì)量濃度0. 05-1 ；滅菌方法121°C高壓蒸汽滅菌15min ；7.微生物菌劑的制備1)基于保護(hù)劑配方1的微生物菌劑制備將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌 器勻速攪拌混合均勻，然后在-10--80°C的環(huán)境中預(yù)凍2-3h，再在無菌條件下真空冷凍干 燥6-48h即可得到微生物凍干菌劑。2)基于保護(hù)劑配方2的微生物菌劑制備將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌 器勻速攪拌混合均勻，然后在-10--80°C的環(huán)境中預(yù)凍2-3h，再在無菌條件下真空冷凍干 燥6-48h即可得到微生物凍干菌劑。3)基于保護(hù)劑配方3的微生物菌劑制備將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌 器勻速攪拌混合均勻，然后將其放置于15-50°C的無菌通風(fēng)室中通風(fēng)干燥6-48h，即可得到 微生物菌劑。所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，ATCC NO. 21332)、地衣芽 孢桿菌(Bacillus licheniformis, ATCC NO. 39307)、節(jié)桿菌屬石賭菌(Arthrobacter paraffineus, ATCC NO. 19558)、球型芽孢桿菌(Bacillus circulans, ATCC NO. 21783)、 腸膜明 串球菌(Leuconostoc mesenteroides, ATCCN0. 14935)、Lactobacillas Confusus (ATCC N0. 10881)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus, ATCC NO. 10987)、銅綠 fiUfi (Pseudomonas aeruginosa, ATCCN0. 9027)、乙■ 丐f 云力木干胃(Acinetobacter calcoaceticus, ATCC N0. 23055)中的一種及多種微生物的混合物。8.產(chǎn)品質(zhì)量檢驗合格產(chǎn)品中活菌數(shù)彡IX IOltl個/克?；罹鷶?shù)的檢測方法為稀釋平板計數(shù)法。具體操作過程如下①稱取微生物菌劑 l.Og，加入盛有99mL裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，按微生物適合的溫度不同，于37-60°C
5振蕩培養(yǎng)30min，使菌體均勻分散，制成10_2的稀釋液；②按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋取盛有 0. 9mL無菌生理鹽水的1. 5mL離心管8支，并依次編號10_3_10_1(1，用無菌移液器吸取0. ImL 稀釋液到編號為10_3的離心管中，用漩渦混合器振蕩lmin，使菌體均勻分散，制成10_3稀釋 液，用相同的方法制備10_3_10_1(1稀釋液；③用無菌移液器分別吸取0. ImL IO-8UO-9UO-10H 個稀釋液于相應(yīng)編號已制備好的LB培養(yǎng)基平板上(每個稀釋度做三個平行)，用無菌玻璃 涂布棒將平板表面的菌液均勻向四周涂布擴(kuò)散，至菌液全部被平板吸收，靜置30min，將平 板倒置于37°C的恒溫箱中培養(yǎng)；④12-18h后每一個活菌細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個 肉眼可見的菌落，根據(jù)平板上菌落的數(shù)目，計算每克混合菌劑中所含的活菌總數(shù)，計算公式 如下每克菌劑中活菌數(shù)=(同一稀釋度的3個平板上菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù))/微生 物菌劑克數(shù)。剛剛制備后的每克微生物菌劑中活菌總數(shù)為IX IOICIIXIOici個，室溫下保存1_2 個月每克微生物菌劑中活菌總數(shù)為1XIO9-I X IO11個。本發(fā)明公開了一種新型微生物粉劑的制備方法，所制備的微生物菌劑可用于油田 微生物增產(chǎn)或環(huán)保，所制備菌劑利用三種不同組成的保護(hù)劑配方，兩種不同的生產(chǎn)方式，將 單一微生物或復(fù)合微生物制備成具有較高活化率的粉劑，以達(dá)到增加產(chǎn)品貯存時間，節(jié)約 運(yùn)輸成本，簡化使用方法的目的。該菌劑的制備方法具備操作簡單、使用方便、對微生物適 用范圍廣、成本低廉的特點(diǎn)，適合于實驗室和規(guī)模化生產(chǎn)。


圖1凍干前后發(fā)酵液中表面活性劑成分高效液相色譜法(HPLC)分析；圖2活化后復(fù)合菌降解黃原膠能力曲線；圖3活化后復(fù)合菌產(chǎn)生物多糖能力與時間的關(guān)系曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖對本方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1 基于單一菌種的微生物菌劑的制備本實施例所選目的微生物為一株產(chǎn)生物表面活性劑的枯草芽孢桿菌(ATCC No. 21332)，采油工程上可用于微生物驅(qū)油。1、培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基，121 °C高壓滅菌20min，備用；LB培養(yǎng)基按重量百分比由蛋白胨、0.5%酵母粉、0.5%氯化鈉，余量為水組 成，自然PH值。2、搖瓶培養(yǎng)將目的菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，條件為溫度 50°C，轉(zhuǎn)速150rpm，三角瓶裝液量30%，培養(yǎng)時間12h ；3、種子罐發(fā)酵，按2%的接種量將目的菌的搖瓶菌液移入種子罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 條件為罐溫50°C，罐壓0.06MPa，通氣量1 1. 5v/v/min，攪拌速度400rpm、發(fā)酵時間 24h ；培養(yǎng)基按重量百分比由蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 5%氯化鈉，余量為水組成，自 然PH值。
4、發(fā)酵罐發(fā)酵按5 %的接種量將目的菌種子液移至發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件 為罐溫50°C，罐壓0. 06MPa，通氣量1 1. 5v/v/min，攪拌速度400rpm、發(fā)酵時間24h，使 發(fā)酵液中菌濃度為1 X IO11個/ml ；發(fā)酵罐培養(yǎng)液按重量比由3%葡萄糖、0.5%酵母粉、0.5%的1(2朋04、0. 3% MgSO4. 5Η20、0. 3% CaCl2. 5Η20、余量為水組成，并調(diào)節(jié) ρΗ 為 7. 0。5、菌泥的制備將發(fā)酵好的發(fā)酵液在室溫，SOOOrpm的條件下離心15min，將離心 沉淀物用無菌水洗滌兩次，再次離心，即得到菌泥。6.保護(hù)劑配制與滅菌保護(hù)劑配方1 按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比(g/L)脫脂乳粉質(zhì)量濃度1， 蔗糖質(zhì)量濃度0. 5 ；滅菌方法脫脂乳紫外滅菌30min ；蔗糖121 °C高壓蒸汽滅菌15min ；7.微生物菌劑的制備將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌器勻速攪拌混合均勻，然后在_40°C的環(huán)境 中預(yù)凍2h，再在無菌條件下真空冷凍干燥12h即可得到微生物凍干菌劑。8.產(chǎn)品質(zhì)量檢驗合格產(chǎn)品中活菌數(shù)>3. 5X101(I個/克，活化后發(fā)酵液表面張力 ^ 30. 17mN/m。將按實施例1中方法凍干保存的菌粉0. Ig,接種于裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶中，371，16011)111振蕩培養(yǎng)2411，轉(zhuǎn)入種子罐中，按實例一2.3.中所述條件進(jìn)行發(fā) 酵，采用HPLC法對發(fā)酵液中的生物表面活性劑成分進(jìn)行分析，分析方法為乙腈水= 40 60，流速0.5mL/min，紫外檢測波長213nm，柱溫30°C。所得結(jié)果如圖1所示，凍干保 存對菌種發(fā)酵液中的生物表面活性劑的性質(zhì)和含量影響不大。實施例2 基于混合菌種的微生物菌劑的制備本實施例所選目的微生物為枯草芽孢桿菌(ATCC No. 21332)、地衣芽孢桿菌(ATCC No. 39307)、銅綠假單胞菌(ATCC No. 9027)的復(fù)合物，這種復(fù)合菌具有一定的降解黃原膠能 力。1、培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基，121 °C高壓滅菌20min，備用；LB培養(yǎng)基按重量百分比由0.8%蛋白胨、0.3%酵母粉、0.5%氯化鈉，余量為水組 成，自然PH值。2、搖瓶培養(yǎng)將目的菌接種到裝有LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，條件為溫度 37°C，轉(zhuǎn)速160rpm，三角瓶裝液量20%，培養(yǎng)時間12h ；3、種子罐發(fā)酵，按3 %的接種量將目的菌的搖瓶菌液移入種子罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 條件為罐溫37°C，罐壓0.08MPa，通氣量1.0 2. Ov/v/min，攪拌速度300rpm、發(fā)酵時間 24h ；培養(yǎng)基按重量百分比由0. 8%蛋白胨、0. 3%酵母粉、0. 5%氯化鈉，余量為水組成， 自然PH值。4、發(fā)酵罐發(fā)酵按5 %的接種量將目的菌種子液移至發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件 為罐溫37°C，罐壓0. 08MPa，通氣量1.0 2. Ov/v/min，攪拌速度300rpm、發(fā)酵時間120h， 使發(fā)酵液中菌濃度為1 X IO11個/mL ；發(fā)酵罐培養(yǎng)液按重量比由3%葡萄糖、0.5%酵母粉、0.5%的1(2朋04、0. 3%MgSO4. 5H20、0. 3% CaCl2. 5H20、余量為水組成，并調(diào)節(jié) pH 為 7. 0。5、菌泥的制備將發(fā)酵好的發(fā)酵液在室溫，40000rpm的條件下離心20min，將離心 沉淀物用無菌水洗滌兩次，再次離心，即得到菌泥。6.保護(hù)劑配制與滅菌保護(hù)劑配方二 按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比(g/L)地瓜淀粉質(zhì)量濃度 1，甘油質(zhì)量濃度0. 2，碳酸鈣質(zhì)量濃度0. 05 ；滅菌方法121°C高壓蒸汽滅菌15min ；7.微生物菌劑的制備將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌器勻速攪拌混合均勻，然后在_40°C的環(huán)境 中預(yù)凍2h，再在無菌條件下真空冷凍干燥12h即可得到微生物凍干菌劑。8.產(chǎn)品質(zhì)量檢驗合格產(chǎn)品中活菌數(shù)>2. SXlOici個/克，活化后發(fā)酵液表面張力 ^ 31. 29mN/m,發(fā)酵120h黃原膠降粘率可達(dá)80%。將按實施例2中方法凍干保存的菌粉0. Ig,接種于裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶中，370C，160rpm振蕩培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)入種子罐中，按實例二 2. 3.中所述條件進(jìn)行發(fā)酵， 檢測復(fù)合菌降解黃原膠的能力，結(jié)果如圖2所示。由圖可見，發(fā)酵120h，黃原膠的降粘率可 達(dá)80%，發(fā)酵液中菌濃度為4X109cfu/mL，說明這種菌劑制備方法對菌種活性影響不大。實施例3 基于混合菌種的微生物菌劑的制備本實施例所選目的微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis, ATCCN0. 21332)、 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis, ATCC NO. 39307)、節(jié)桿菌屬石賭菌 (Arthrobacter paraffineus,ATCC NO. 19558)的復(fù)合物，這種復(fù)合菌具有一定的產(chǎn)生生物 聚合物能力，在石油開采過程中可用于調(diào)剖堵水。1、培養(yǎng)基選用葡萄糖2% +基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基，115°C高壓滅菌15min，備用；LB培養(yǎng)基按重量百分比由蛋白胨、0.5%酵母粉、0.5%氯化鈉，余量為水組 成，pH 值 6.0。2、搖瓶培養(yǎng)將目的菌接種到事先配好的液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，條件為 溫度60°C，轉(zhuǎn)速160rpm，三角瓶裝液量20%，培養(yǎng)時間12h ；3、種子罐發(fā)酵，按5 %的接種量將目的菌的搖瓶菌液移入種子罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 條件為罐溫60°C，罐壓0.06MPa，通氣量1 1. 5v/v/min，攪拌速度400rpm、發(fā)酵時間 16h ；培養(yǎng)基按重量百分比由蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 5%氯化鈉，余量為水組成，pH 值 6.0。4、發(fā)酵罐發(fā)酵按3 %的接種量將目的菌種子液移至發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件 為罐溫60°C，罐壓0. 06MPa，通氣量1 1. 5v/v/min，攪拌速度400rpm、發(fā)酵時間30h，使 發(fā)酵液中菌濃度為1 X IO11個/mL ；發(fā)酵罐培養(yǎng)液按重量比由3%葡萄糖、0.5%酵母粉、0.5%的1(2朋04、0. 3% MgSO4. 5Η20、0. 3% CaCl2. 5Η20、余量為水組成，并調(diào)節(jié) pH 為 7. 0。5、菌泥的制備將發(fā)酵好的發(fā)酵液在室溫，4000rpm的條件下離心15min，將離心 沉淀物用無菌水洗滌兩次，再次離心，即得到菌泥。6.保護(hù)劑配制與滅菌
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保護(hù)劑配方3 按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比(g/L)麩皮質(zhì)量濃度0. 5，蔗 糖質(zhì)量濃度0. 5，甘油質(zhì)量濃度0. 1 ；滅菌方法121°C高壓蒸汽滅菌15min ；7.微生物菌劑的制備將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌器勻速攪拌混合均勻，然后將其放置于 40°C的無菌通風(fēng)室中通風(fēng)干燥12h，即可得到微生物菌劑。8.產(chǎn)品質(zhì)量檢驗合格產(chǎn)品中活菌數(shù)彡2. OX IO10個/克。多糖產(chǎn)量大于2. 5mg/ L0將按實施例2中方法凍干保存的菌粉0. Ig,按實施例3中1. 2. 3.中所述條件進(jìn) 行發(fā)酵，檢測保護(hù)劑中微生物發(fā)酵產(chǎn)多糖的能力，結(jié)果如圖3所示。發(fā)酵23h，多糖產(chǎn)量最 高，可達(dá)到3. Omg/L，菌濃度可達(dá)1. OX liTcfu/mL，說明這種菌劑制備方法對菌種活性及性 能影響不大。
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權(quán)利要求
用于油田微生物增產(chǎn)或環(huán)保的微生物菌劑的制備方法，其特征在于復(fù)合菌劑由微生物發(fā)酵液離心沉淀的菌泥和保護(hù)劑復(fù)配后干燥而成；每克微生物菌劑中活菌總數(shù)為1×109 1×1011個；所述保護(hù)劑配方為下述三種配方之一保護(hù)劑配方一按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比g/L脫脂乳粉質(zhì)量體積濃度0.5 2.5，蔗糖質(zhì)量體積濃度0.1 1；保護(hù)劑配方二按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比g/L地瓜淀粉質(zhì)量體積濃度0.5 2.5，甘油質(zhì)量體積濃度0.1 1，碳酸鈣質(zhì)量體積濃度0.01 0.2；保護(hù)劑配方三按與菌泥所對應(yīng)的發(fā)酵液重量體積比g/L麩皮質(zhì)量體積濃度0.1 1，蔗糖質(zhì)量體積濃度0.2 1，甘油質(zhì)量體積濃度0.05 1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述微生物為枯草芽 孢桿菌(Bacillus subtilis, ATCC NO. 21332)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis, ATCC NO. 39307)、節(jié)桿菌屬石賭菌(Arthrobacter paraffineus, ATCC NO. 19558)、 球型芽孢桿菌(Bacillus circulans, ATCCN0. 21783)、腸膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides, ATCC N0. 14935)、Lactobacillas Confusus (ATCC NO. 10881)、賭狀芽(Bacillus cereus, ATCC NO. 10987)、f同參錄fiHfi胃(Pseudomonas aeruginosa, ATCCN0. 9027)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus, ATCC N0. 23055)中的一 種或多種微生物的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述微生物菌劑按以 下步驟進(jìn)行制備，①對目的微生物進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；②種子罐發(fā)酵；③將微生物轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)至菌濃度為1X IO10-I X IO14個/ml ；④按保護(hù)劑配方1或保護(hù)劑配方2配制保護(hù)劑，并將其滅菌；⑤菌泥的制備將發(fā)酵好的發(fā)酵液在室溫，5000-10000rpm的條件下離心10-15min，將 離心沉淀物用無菌水洗滌兩次，離心沉淀物即為菌泥；將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌器勻速攪拌混合均勻，然后在-10--80°C的環(huán)境 中預(yù)凍2-3h，再在無菌條件下真空冷凍干燥6-48h即可得到微生物凍干菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述微生物菌劑按以 下步驟進(jìn)行制備，①對目的微生物進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；②種子罐發(fā)酵；③將微生物轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)至菌 濃度為 IX IOici-I X IO14 個/mL ；④按保護(hù)劑配方3配制保護(hù)劑，并將其滅菌；⑤菌泥的制備將發(fā)酵好的發(fā)酵液在室溫，5000-10000rpm的條件下離心10-15min，將 離心沉淀物用無菌水洗滌1-5次，再次離心，離心沉淀物即為菌泥；將菌泥放入滅菌好的保護(hù)劑中，用攪拌器勻速攪拌混合均勻，然后將其放置于15-50°C 的無菌通風(fēng)室中通風(fēng)干燥6-48h，即可得到微生物菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于步驟①中所述微 生物在37-60°C、100-160rpm的條件下用LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12_48h ；用于培養(yǎng)微生物的LB培養(yǎng)基按重量百分比由0. 2-3%蛋白胨、0. 1-2%酵母粉、0. 1-3%氯化鈉，余量為水組成，自 然PH值。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于步驟②和③中微 生物發(fā)酵培養(yǎng)液按重量比由1-5%葡萄糖、0. 1-2%酵母粉、0. 1-3%&Κ2ΗΡ04、0. 05-0.5% MgSO4 · 5Η20、0. 01-0. 5% CaCl2 · 5Η20、余量為蒸餾水組成，并調(diào)節(jié) ρΗ 為 7. 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于步驟④中的滅菌 方法為，保護(hù)劑2和保護(hù)劑3采用121°C，15min高壓蒸汽滅菌的方法；保護(hù)劑1中的脫脂乳 采用紫外燈照射30-60min的滅菌方法，其它組分采用121°C，15min高壓蒸汽滅菌的方法， 分別滅菌后將各組分在無菌環(huán)境下混合均勻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于油田微生物增產(chǎn)或環(huán)保的微生物菌劑的制備方法，復(fù)合菌劑由微生物發(fā)醇液離心沉淀的菌泥和保護(hù)劑復(fù)配后干燥而成；每克微生物菌劑中活菌總數(shù)為1×109-1×1011個；本發(fā)明將單一微生物或復(fù)合微生物制備成具有較高活化率的粉劑，以達(dá)到增加產(chǎn)品貯存時間，節(jié)約運(yùn)輸成本，簡化使用方法的目的。該菌劑的制備方法具備操作簡單、使用方便、對微生物適用范圍廣、成本低廉的特點(diǎn)，適合于實驗室和規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK101914439SQ20101021599
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者付步飛, 劉文靜, 劉潤海, 劉瀅, 杜國豐, 楊平, 梅曉丹, 王平, 趙靜, 陳琛, 魏子超 申請人:大連百奧泰科技有限公司