專利名稱：檢測(cè)腸道病毒71型的專用引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)腸道病毒71型的專用引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(EV71)是1969年首次從加利福尼亞一名患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離而來的。不同亞型EV71感染人后的臨床癥狀不完全相同，通?？梢鸹颊呤肿憧诓?hand-foot-mouth disease,HFMD)和無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。該病致殘及病死率較高，尤其患兒發(fā)病時(shí)并發(fā)癥和死亡率較高。自20世紀(jì)60年代逐漸明確其病原體以來，手足口病已在全世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)或流行，累及地域廣泛、人口眾多。最近幾年來，我國(guó)腸道病毒EV71感染導(dǎo)致的手足口病流行日趨嚴(yán)重。傳統(tǒng)的普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法等常需要花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間或者需要特定的儀器，難以滿足暴發(fā)疫情快速診斷的需要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)法具有在等溫條件下即可高速、快速、高特異、高靈敏的擴(kuò)增靶序列的特點(diǎn)。該方法利用4條特異引物(F3，F(xiàn)IP，B3和BIP)在高活性鏈置換DNA聚合酶作用下，不斷復(fù)制擴(kuò)增核酸。在反應(yīng)體系中可添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，周而復(fù)始。 擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)腸道病毒71型的專用引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的專用引物包括序列表的序列1至序列4所示的DNA。所述專用引物還可包括序列表的序列5所示DNA和/或序列表的序列6所示DNA。所述專用引物優(yōu)選由序列表的序列1至序列6所示DNA組成。F3(序列 1) :5，-CTTCCCGGTCTCAGCACA-3，；B3(序列 2) :5，-GCGGTGTATAGGCTATGAGC-3，；FIP(序列 3) :5，-TGACCCAGCAAGGTGGATTGCTTTTAGCAGGGAAAGGTGAGCT-3，；BIP (序列 4) 5，-TGCGGGTACTACACCCAATGGTTTTTAGCCATGAAGGACCCAGTA-3，；LF(序列 5) :5，-CGGCTCTGAACACCGCACAC-3，；LB (序列 6) 5，-GGATCATTAGAAGTCACCTTCATGT-3，。所述專用引物中，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LF、LB的5’端和/或3’端還可根據(jù)靶序列進(jìn)行延長(zhǎng)；所述專用引物中，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LF、LB還可進(jìn)行堿基的替換和/或取代和/或插入，保持85%的同源性即可；所述專用引物物還可由？3』3、？1 、81 、1^、1^的反向互補(bǔ)序列組成。本發(fā)明還保護(hù)所述專用引物在輔助鑒定腸道病毒71型中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定腸道病毒71型的方法，包括如下步驟(1)提取待測(cè)病毒的RNA ；
(2)用所述的專用引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)；(3)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物確定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件可為60 65°C反應(yīng)30 60min，然后75°C 2min 終止反應(yīng)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件具體可為63°C反應(yīng)35-60min，然后75°C ^iin終止反應(yīng)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中，F(xiàn)3和B3的濃度均為5pmol/L，BIP和FIP的濃度均為40pmol/L，LB和LF的濃度均為20pmol/L。所述腸道病毒71型具體可為BrCr毒株或F8-Henan-08毒株。本發(fā)明還保護(hù)所述專用引物在制備輔助鑒定腸道病毒71型的試劑盒中的應(yīng)用。RNA提取可采用常規(guī)方法，如使用Qiagen RNeasy Mini kit或其他同類試劑盒。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析判定的方法如下(1)通過反應(yīng)液的濁度進(jìn)行判定核酸大量合成時(shí)，dNTP會(huì)析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應(yīng)液的濁度變化；基于該原理，可以根據(jù)反應(yīng)液的濁度變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列； 可以采用實(shí)時(shí)濁度儀及其配套程序軟件實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液的濁度變化，如果實(shí)時(shí)濁度儀上觀察到典型的擴(kuò)增曲線，則表明待測(cè)樣本來自腸道病毒71型。(2)通過熒光染料的顏色變化進(jìn)行判定應(yīng)用本方法進(jìn)行判定時(shí)，LAMP體系中需要有鈣黃綠素、Mg2+和Mn2+ ；反應(yīng)初始時(shí)鈣黃綠素與Mg2+結(jié)合，反應(yīng)液顯示透明的橙色，核酸大量合成時(shí)，會(huì)生成副產(chǎn)物焦磷酸根，焦磷酸根離子的存在，使得Mg2+游離出來，鈣黃綠素和Mn2+結(jié)合，反應(yīng)液顯示微濁的黃綠色； 基于該原理，可以根據(jù)反應(yīng)液的顏色變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列；自然光下，如果反應(yīng)液由透明橙色變?yōu)槲岬狞S綠色，則表明待測(cè)樣本來自腸道病毒71型；紫外光下，如果反應(yīng)液顯示強(qiáng)熒光則表明待測(cè)樣本來自腸道病毒71型。本發(fā)明適用于對(duì)腸道病毒71型(EV71)進(jìn)行特異性檢測(cè)和定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在60分鐘內(nèi)即可完成(如用6條引物僅需35分鐘)；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡(jiǎn)單。本發(fā)明特別適用于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)。


圖1為實(shí)施例3中在自然光㈧和紫外燈⑶下各個(gè)樣本的顏色比較結(jié)果；1至6 依次為樣本1至樣本6。圖2為實(shí)施例3的實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線。圖3為實(shí)施例4的實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線。圖4為實(shí)施例6的實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線。圖5為實(shí)施例7的實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下列實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。所用無機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)試劑均符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。引物由上海英駿技術(shù)公司合成，RT-LAMP 試劑盒RNA Amplification Kit (RT-LAMP),日本榮研公司，CodeNo: LMP244。LAMP 熒光檢測(cè)試劑 fluorescent Detection Reagent，日本榮研公司，CodeNo LMP221。RNA 提取試劑盒Rneasy Mini Kit，QIAgen 公司產(chǎn)品，Cat No. 74014。RNA 酶抑制劑(Ribonuclease inhibitor)大連寶生物(TAKARA)公司產(chǎn)品，CatNo. D2310。LA-320C 實(shí)時(shí)濁度儀，日本榮研公司產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量?？滤_奇病毒A16、柯薩奇病毒B3、脊髓灰質(zhì)炎病毒均獲自中國(guó)藥品生物制品檢定所。腸道病毒71型FS-Henan-os毒株中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保證可在符合國(guó)家和軍隊(duì)有關(guān)規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)后向公眾提供；參考文獻(xiàn)韓劍鋒，安康，等.河南新鄉(xiāng)2008年手足口病病原分離鑒定及病毒基因組特征.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32 (6) :523-524.。腸道病毒71型brcr毒株中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保證可在符合國(guó)家和軍隊(duì)有關(guān)規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門批準(zhǔn)后向公眾提供；參考文獻(xiàn)Arita M, Shimizu H，Nagata N，et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 7lshow attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005. 86(PT 5) :1391_1401o實(shí)施例1、專用引物的設(shè)計(jì)以及各個(gè)專用引物的制備根據(jù)腸道病毒71型(EV71)中國(guó)流行株VP3蛋白設(shè)計(jì)特異性引物序列如下F3(序列 1) :5，-CTTCCCGGTCTCAGCACA-3，；B3(序列⑴5，-GCGGTGTATAGGCTATGAGC-3，；FTP(序列；3) :5，-TGACCCAGCAAGGTGGATTGCTTTTAGCAGGGAAAGGTGAGCT-3，；BIP(序列 4) :5，-TGCGGGTACTACACCCAATGGTTTTTAGCCATGAAGGACCCAGTA-3，；LF(序列 5) 5' -CGGCTCTGAACACCGCACAC—3，；LB (序列 6) :5，-GGATCATTAGAAGTCACCTTCATGT-3，。引物卩3、83、卩1 、81 、1^和1^組成專用引物甲。引物？3、83、？1 、81卩和1^組成專用引物乙。引物？3、83、？1 、81卩和1^組成專用引物丙。引物F3、B3、FIP和BIP組成專用引物丁。
用于實(shí)施例3至實(shí)施例6的檢測(cè)。實(shí)施例2、病毒樣本的制備腸道病毒71型FS-Henan-OS毒株的病毒液，通過蝕斑形成單位計(jì)算感染性滴度 (PFU/ml)。使用DMEM培養(yǎng)基將病毒液進(jìn)行梯度稀釋，得到5種不同濃度的病毒液(濃度分別為 3X 102PFU/ml,3X lO'PFU/ml,3PFU/ml,0. 3PFU/ml、0. 03PFU/ml)。將得到的 5 種病毒液和DMEM培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)作為六個(gè)樣本，分別進(jìn)行實(shí)施例3和實(shí)施例4的檢測(cè)。樣本1 濃度為 3X 102PFU/ml 的 F8-Henan_08 病毒液。樣本2 濃度為 3 X Io1PFUAiI 的 F8-Henan_08 病毒液。樣本3 濃度為3PFU/ml的F8-Henan_08病毒液。
樣本4 濃度為 0. 3PFU/ml 的 F8-Henan_08 病毒液。樣本5 濃度為 0. 03PFU/ml 的 F8-Henan_08 病毒液。樣本6 =DMEM培養(yǎng)基。實(shí)施例3、專用引物甲的應(yīng)用(檢測(cè)F8-Henan-08毒株)用專用引物甲對(duì)實(shí)施例2制備的6種病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、病毒基因組RNA的提取(采用RNA提取試劑盒)將210 μ 1樣本轉(zhuǎn)至新的1. 5ml離心管中，補(bǔ)加700 μ 1 RLT溶液和7 μ 1 β _巰基乙醇，振蕩混勻后加入490μ 1無水乙醇，劇烈振蕩后分兩次加至硅膠柱中，進(jìn)行硅膠柱過
濾ο硅膠柱過濾將加樣后的硅膠柱10，OOOg離心15s ；加700 μ 1 Rffl緩沖液， 10，OOOg離心15s ；用RPE緩沖液離心洗硅膠柱兩次(每次500 μ 1)；將硅膠柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，10，OOOg離心2min ；將硅膠柱轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入50 μ 1無核酸酶水，室溫靜置 2min，然后10，OOOg離心2min，收集洗脫液；在洗脫液中加入1 μ 1 RNA酶抑制劑，-70°C保存，即為待測(cè)RNA。待測(cè)RNA用于步驟2或步驟3的檢測(cè)。二、應(yīng)用專用引物甲檢測(cè)(采用RT-LAMP試劑盒)用實(shí)施例1中的專用引物甲檢測(cè)步驟1得到的待測(cè)RNA，在試管中進(jìn)行反應(yīng)。LAMP反應(yīng)體系(25 μ 1) :F3和B3的濃度均為5pmol/L，BIP和FIP的濃度均為 40pmol/L, LB 和 LF 的濃度均為 20pmol/L，2XEnzyme Buffer 12. 5ul (含 Mg2+和 Mn2+)， Enzyme Iul ,Fluorecent Detection Reagent Iul (含鈣黃綠素)，1 μ 1 待測(cè) RNA，無核酸酶和脫氧核酶的去離子水定容；以上濃度均為體系中的終濃度。LAMP反應(yīng)體系在63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后，自然光下試管的照片見圖1A，終止反應(yīng)后紫外燈照射下試管的照片見圖1B。圖IA中，樣本1至樣本3為陽性，樣本4至樣本6為陰性。圖IB中，樣本1至樣本3為陽性，樣本4至樣本6為陰性。采用肉眼觀察，檢測(cè)方法的靈敏度為3PFU/ml。待測(cè)RNA中病毒RNA的濃度= 3PFU/mlX210X10_3ml + 50y 1 ^ 0. OlPFU/μ 1。每個(gè) LAMP 反應(yīng)體系中病毒 RNA 的含量= 0. OlPFU/μ ΙΧΙμ 1 = 0. OlPFU。即靈敏度為 0. OlPFU/反應(yīng)體系。采用紫外燈照射下觀察，檢測(cè)方法的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。三、用專用引物甲檢測(cè)EV71病毒(實(shí)時(shí)濁度儀)LAMP反應(yīng)體系中不含有Fluorecent Detection Reagent，其它同步驟二的LAMP 反應(yīng)體系。將LAMP反應(yīng)體系置于LA320C實(shí)時(shí)濁度儀，63°C反應(yīng)35min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線見圖2。樣本1至樣本3為陽性，樣本4至樣本6為陰性。濁度儀觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。實(shí)施例4、專用引物乙、專用引物丙和專用引物丁的應(yīng)用(檢測(cè)FS-Henan-OS毒株)分別用專用引物乙和專用引物丙對(duì)實(shí)施例2制備的6種病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，方法同實(shí)施例3。用專用引物丁對(duì)實(shí)施例2制備的6種病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)濁度儀中，反應(yīng)時(shí)間為60min，其它同實(shí)施例3。采用專用引物乙肉眼觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系，紫外燈照射下觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。濁度儀觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。采用專用引物丙肉眼觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系，紫外燈照射下觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。用濁度儀觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。采用專用引物丁 肉眼觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系，紫外燈照射下觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。用濁度儀觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線見圖3。結(jié)果表明專用引物乙、專用引物丙、專用引物丁與專用引物甲僅在使用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)判斷時(shí)，反應(yīng)時(shí)間有差異(采用專用引物甲反應(yīng)僅需35分鐘，采用專用引物丁約需 35分鐘)；專用引物乙、專用引物丙、專用引物丁與專用引物甲在應(yīng)用時(shí)，檢測(cè)靈敏度沒有差異；各組專用引物在應(yīng)用不同的檢測(cè)判斷方法(使用實(shí)時(shí)濁度儀、肉眼觀察或紫外燈觀察)時(shí)，檢測(cè)靈敏度沒有差異。實(shí)施例5、應(yīng)用各種專用引物檢測(cè)BrCr毒株一、病毒樣本的制備用腸道病毒71型BrCr毒株代替腸道病毒71型F8-Henan-08毒株，其它同實(shí)施例 2。二、應(yīng)用各種專用引物檢測(cè)BrCr毒株分別用專用引物甲、專用引物乙、專用引物丙和專用引物丁對(duì)步驟一制備的6種病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，方法同實(shí)施例3。采用專用引物丙肉眼觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系，紫外燈照射下觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。用濁度儀觀察的靈敏度為0. OlPFU/反應(yīng)體系。采用專用引物甲、專用引物乙、專用引物丙和專用引物丁肉眼觀察的靈敏度均為 0. OlPFU/反應(yīng)體系，紫外燈照射下觀察的靈敏度均為0. OlPFU/反應(yīng)體系。用濁度儀觀察的靈敏度均為0. OlPFU/反應(yīng)體系。專用引物乙、專用引物丙、專用引物丁與專用引物甲僅在使用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)判斷時(shí)，反應(yīng)時(shí)間有差異(采用專用引物甲反應(yīng)僅需35分鐘，采用專用引物丁約需60分鐘)。實(shí)施例6、特異性檢測(cè)采用專用引物甲分別對(duì)腸道病毒71型BrCr毒株和相似癥候群毒株柯薩奇病毒 A16、柯薩奇病毒B3、脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行檢測(cè)(待測(cè)病毒液的濃度均為3X 102PFU/ml)。方法同實(shí)施例3。柯薩奇病毒A16、柯薩奇病毒B5、脊髓灰質(zhì)炎病毒均為陰性結(jié)果， 腸道病毒71型BrCr毒株為陽性結(jié)果，說明本發(fā)明方法具有良好特異性。實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線見圖4。實(shí)施例7、待檢樣品(患者糞便)LAMP反應(yīng)檢測(cè)檢測(cè)25位志愿者的糞便，將糞便溶解后作為樣本用專用引物甲進(jìn)行檢測(cè)，方法同實(shí)施例3。其中18位為陽性結(jié)果(有擴(kuò)增曲線)，7位為陰性結(jié)果(沒有擴(kuò)增曲線)。實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線見圖5。說明LAMP方法能用于檢測(cè)臨床病例標(biāo)本中包含的EV71病毒。
權(quán)利要求
1.專用引物，包括序列表的序列1至序列4所示的DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于所述專用引物還包括序列表的序列5 所示DNA和/或序列表的序列6所示DNA。
3.如權(quán)利要求2所述的專用引物，其特征在于所述專用引物由序列表的序列1至序列6所示DNA組成。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物在輔助鑒定腸道病毒71型中的應(yīng)用。
5.輔助鑒定腸道病毒71型的方法，包括如下步驟(1)提取待測(cè)病毒的RNA；(2)用權(quán)利要求1至3中任一所述的專用引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；(3)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物確定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為60 65°C反應(yīng)30 60min，然后75°C 2min終止反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為63°C反應(yīng) ;35-60min，然后 75°C 2min 終止反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中，F(xiàn)3 和B3的濃度均為5pmol/L，BIP和FIP的濃度均為40pmol/L，LB和LF的濃度均為20pmol/ L0
9.如權(quán)利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述腸道病毒71型為BrCr毒株或F8-Henan-08毒株。
10.權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物在制備輔助鑒定腸道病毒71型的試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)腸道病毒71型的專用引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的專用引物，包括序列表的序列1至序列4所示的DNA，優(yōu)選由序列表的序列1至序列6所示DNA組成。本發(fā)明的專用引物適用于對(duì)腸道病毒71型(EV71)進(jìn)行特異性檢測(cè)和定量分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)只需在恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴(kuò)增反應(yīng)在60分鐘內(nèi)即可完成(如用6條引物僅需35分鐘)；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡(jiǎn)單。本發(fā)明特別適用于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102296064SQ20101021583
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者劉娟, 姜濤, 秦成峰, 秦鄂德, 韓劍峰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所