專利名稱：一種醛脫氫酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脫氫酶 基因及其重組表達(dá)載體、基因工程菌，及其在制備重組醛脫氫酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
醛脫氫酶能催化3-羥基丙醛、丙醛和乙醛分別生成3-羥基丙酸、丙酸和乙酸，在 化工領(lǐng)域及人體乙醛代謝中發(fā)揮著重要作用。醛脫氫酶廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物中， 其微生物來源主要有釀酒酵母及大腸桿菌。醛脫氫酶是一種復(fù)合體，含有三個(gè)亞基，分子量 分別為 54KD、49KD 和 12KD。目前不同來源的醛脫氫酶基因已經(jīng)被克隆和測(cè)序，并且實(shí)現(xiàn)了在不同宿主中的表 達(dá)。然而野生型醛脫氫酶活力較低，限制了其大規(guī)模的生產(chǎn)，因此，構(gòu)建具有工業(yè)用途的醛 脫氫酶基因工程菌意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種醛脫氫酶基因及其重組表達(dá)載體、基因工程菌，及其在制 備重組醛脫氫酶中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醛脫氫酶基因，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。該序列由如下方法獲得利用PCR 技術(shù)，在弓丨物 1 (ATGTCACACCTTCCTATGACAGTGCC)、弓丨物 2 (GTCCAATTTGGCACGGACCGC)的作用下，以來源于釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) 菌株中的總基因組DNA為模板，克隆得到約1.5kb的醛脫氫酶的基因片段。將該片段連接 到pMD18-T載體上獲得克隆載體pMD18-T-aldH和轉(zhuǎn)化了 pMD18-T_aldH的重組大腸桿菌 JM109/pMD18-T-aldH。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并利用軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，分析表明該序列含有一 個(gè)長(zhǎng)為1488bp的開發(fā)閱讀框。該基因核苷酸序列為(SEQ IDN0!)1ATGTCACACC TTCCTATGAC AGTGCCTATC AAGCTGCCCA ATGGGTTGGA ATATGAGCAA
61CCAACGGGGT TGTTCATCAA CAACAAGTTT GTTCCTTCTA AACAGAACAA GACCTTCGAA
121GTCATTAACC CTTCCAOGGA AGAAGAAATA TGTCATATTT ATGAAGGTAG AGAGGACGAT
181GTGGAAGAGG CCGTGCAGGC CGCOGACCGT GCCTTCTCTA ATGGGTCTTG GAA0GGTATC
241GACCCTATTG ACAGGGGTAA GGCTTTGTAC AGGTTAGCCG AATTAATTGA ACAGGACAAG
301GATGTCATTG CTTCCATOGA GACTTTGGAT AAOGGTAAAG CTATCTCTTC CT0GAGAGGA
361GATGTTGATT TAGTCATCAA CTATTTGAAA TCTTCTGCTG GCTTTGCTGA TAAAATTGAT
421GGTAGAATGA TTGATACTGG TAGAACCCAT TTTTCTTACA CTAAGAGACA GCCTTTGGGT
481GTTTGTGGGC AGATTATTCC TTGGAATTTC CCACTGTTGA TGTGGGCCTG GAAGATTGCC
541CCTGCTTTGGTCAC0GGTAACACOGTCGTG TTGAGGACTGCCGAATCCACCCCATTGTCC
601GCTTTGTATGTGTCTAAATACATCCCACAG G0GGGTATTCCACCTGGTGTGATCAACATT
661GTATC0GGGTTTGGTAAGATTGTGGGTGAG GCCATTACAAACCATCCAAAMTCAMMG
721GTTGCCTTCACAGGGTCCACGGCTAOGGGT AGACACATTTACCAGTCCGCAGC0GCAGGC
781TTGMMMGTGACTTTGGAGCTGGGTGGT AAATCACCAAACATTGTCTTCGCGGACGCC
841GAGTTGAAAAAAGC0GTGCAAAACATTATC CTTGGTATCTACTACAATTCTGGTGAGGTC
901TGTTGTG0GGGTTCAAGGGTGTATGTTGAAGAATCTATTTACGACAAATTCATTGAAGAG
961TTCAAAGCCGCTTCTGAATCCATCAAGGTGGGCGACCCATTCGATGAATCTACTTTCCAA
1021GGTGCACAAACCTCTCAAATGCAACTAAACAAAATCTTGAAATA0GTTGACATTGGTAAG
1081AATGAAGGTGCTACTTTGATTAC0GGTGGTGAAAGATTAGGTAGCAAGGGTTACTTCATT
1141AAGCCAACTGTCTTTGGTGACGTTAAGGAAGACATGAGAATTGTCAAAGAGGAAATCTTT
1201GGCCCTGTTGTCACTGTAACCAAATTCAAATCTGC0GACGAAGTCATTAACATGG0GAAC
1261GATTCTGAATACGGGTTGGCTGCTGGTATTCACACCTCTAATATTAATACCGCCTTAAAA
1321GTGGCTGATAGAGTTAATGCGGGTA0GGTCTGGATAAACACTTATAACGATTTCCACCAC
1381GCAGTTCCTTTCGGTGGGTTCAATGCATCTGGTTTGGGCAGGGAAATGTC TGTTGATGCT
1441TTACAAAACT ACTTGCAAGT TAAAGCGGTC CGTGCCAAAT TGGACATT 利用軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行分析，并推知其編碼的氨基酸序列為(SEQ ID NO 2)MSHLPMTVPIKLPNGLEYEQPTGLFINNKFVPSKQNKTFEVINPSTEEEICHIYEGREDD
VEEAVQAADRAFSNGSffNGIDPIDRGKALYRLAELIEQDKDVIASIETLDNGKAISSSRG
DVDLVINYLKSSAGFADKIDGRMIDTGRTHFSYTKRQPLGVCGQIIPffNFPLLMWAffKIA
PALVTGNTVVLRTAESTPLSALYVSKYIPQAGIPPGVINIVSGFGKIVGEAITNHPKIKK
VAFTGSTATGRHIYQSAAAGLKKVTLELGGKSPNIVFADAELKKAVQNIILGIYYNSGEV
CCAGSRVYVEESIYDKFIEEFKAASESIKVGDPFDESTFQGAQTSQMQLNKILKYVDIGK
NEGATLITGGERLGSKGYFIKPTVFGDVKEDMRIVKEEIFGPVVTVTKFKSADEVINMAN
DSEYGLAAGIHTSNINTALKVADRVNAGTVWINTYNDFHHAVPFGGFNASGLGREMSVDA
LQNYLQVKAVRAKLDI本發(fā)明還涉及含有所述醛脫氫酶基因的重組載體，以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化得 到的重組基因工程菌。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)表達(dá)引物3 (GTTGTCGACTCACACCTTCCTATGACAGTGCC,下劃線部分 為 Sal I 酶切位點(diǎn))和引物 4 (GTTAAGCTTGTCCAATTTGGCACGGACCGC,下劃線部分為 Hind III 酶切位點(diǎn))，以重組質(zhì)粒pMD18-T-aldH為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了用于表達(dá)的醛脫氫酶基 因。本發(fā)明將醛脫氫酶基因同表達(dá)載體pET28b連接，構(gòu)建了含有醛脫氫酶基因的表達(dá)重組 質(zhì)粒pET28b-aldH。將表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中，獲得含有 表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH的重組大腸桿菌BL21/pET28b-aldH，以重組菌為酶源，進(jìn)行生 物催化與轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還涉及所述的醛脫氫酶基因在制備重組醛脫氫酶中的應(yīng)用。具體的，所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述醛脫氫酶基因的重組載體，將所述重組載體 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組醛脫 氫酶的菌體細(xì)胞。
所述重組醛脫氫酶作為轉(zhuǎn)化用酶，可分別以乙醛、丙醛或3-羥基丙醛為底物，進(jìn) 行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的乙酸、丙酸或3-羥基丙酸。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛 脫氫酶基因核苷酸序列；并將該基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建的到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒 pET28b-aldH,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得含有表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH的重組大腸 桿菌BL21/pET28b-aldH?？蓱?yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化， 將乙醛、丙醛或3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙酸、丙酸或3-羥基丙酸。


圖1為克隆載體pMD18-T_aldH物理圖譜；圖2為pET28b_aldH重組質(zhì)粒物理圖譜；圖3為酸脫氫酶基因PCR擴(kuò)增argrose電泳圖；1 :DL2000DNAMarker ；2 5 利 用引物1和引物2擴(kuò)增得到的醛脫氫酶基因片段；圖4陽性重組質(zhì)粒pET28b-aldH的酶 切結(jié)構(gòu)圖；1 :DL2000DNA Marker ；2 醛脫氫酶基因片段；3 :pET28b_aldH/Sal I 樣品；4 pET28b-aldH/HindIII 樣品；5 :pET28b_aldH/Sal I and Hind III 樣品；6 λ DNA/HindIII DNAMarker0圖5為醛脫氫酶酶SDS-PAGE圖；1 蛋白分子量Marker ;2 :E. coli BL21;3:未 誘導(dǎo)的 E.coli BL21/pET28b-aldH ；4 0. ImM IPTG 誘導(dǎo)的 E. coli BL21/pET28b_aldH ； 5 0. 5mM IPTG 誘導(dǎo)的 E. coli BL21/pET28b_aldH ；6 =ImM IPTG 誘導(dǎo)的 E. coli BL21/ pET28b-aldH。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 用核酸快速提取儀提取釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株(中國(guó)普 通微生物保藏管理中心(北京)，編號(hào)2. 1543)的總基因組DNA，以該基因組DNA為模板， 在引物 1 (ATGTCACACCTTCCTATGACAGTGCC)、引物 2(GTCCAATTTGGCACGGACCGC)的作用下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系各組分加入量(總體積50 μ L) =IOXPfu DNAPolymerase Buffer 5μ L, IOmM dNTP mixture 1 μ L (20mM)，克隆引物 1、引物 2 各 1 μ L (50 μ Μ)，基因組 DNA 1 μ L，Pfu DNAPolymerase 1 μ L，無核酸水 40 μ L。采用 Biorad 的 PCR 儀，PCR 反應(yīng)條件為 預(yù)變性94°C 5min,然后進(jìn)入溫度循環(huán)94°C 30s, 55°C 1. 5min, 72°C 2min,共35個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin，終止溫度為8°C。取5 μ L用0. 9%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。切膠回收該片段 并純化，利用Taq DNA聚合酶向片段5，端引入堿基Α。在T4DNA連接酶作用下將該片段同 T載體進(jìn)行連接，得到克隆重組質(zhì)粒pMD18-T-aldH見圖1。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌JM109中，利用籃白斑篩選系統(tǒng)進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取白色克隆測(cè)序，利用軟件分析測(cè)序結(jié) 果，結(jié)果表明利用引物1、引物2擴(kuò)增得到得片段含有一個(gè)開放閱讀框，長(zhǎng)度為1488bp。實(shí)施例2 根據(jù)實(shí)施例1分析結(jié)果設(shè)計(jì)表達(dá)引物3和引物4，并分別在引物3和引物4中引入了 Sal I 和 Hind III 限制性酶切位點(diǎn)。在引物 3 (GTTGTCGACTCACACCTTCCTATGACAGTGCC ，下劃線部分為Sal I酶切位點(diǎn))和引物4 (GTTAAGCTTGTCCAATTTGGCACGGACCGC,下劃線部 分為Hind III酶切位點(diǎn))的引發(fā)下，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)為 1488bp的醛脫氫酶基因片段(SEQ ID NO 1)，測(cè)序后利用Sal I和Hind III限制性內(nèi)切酶 對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行處理，并利用T4DNA連接酶將該片段同用相同的限制性內(nèi)切酶處理的表達(dá) 載體pET28b進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET28b-aldH。將構(gòu)建的表達(dá)載體pET28b-aldH電轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21中，涂平板37°C下培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取克隆抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒 定結(jié)果見圖4。實(shí)施例3:將實(shí)施例2驗(yàn)證后的含有表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH的重組大腸桿菌BL21/ pET28b-aldH用含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，再以接種量接 種到新鮮的含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌體濃度0D_約0. 6 左右，再向LB液體培養(yǎng)基加入終濃度為0. 5mM的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)8h后，4°C、9000rpm離心 8min,收集含有重組醛脫氫酶的菌體細(xì)胞。實(shí)施例4 以實(shí)施例3中獲得的含有表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH的重組大腸桿菌BL21/ pET28b-aldH濕菌體超聲破碎后(350W，破碎2s，間隔2s，共80次)作為轉(zhuǎn)化用酶，以乙醛 為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備乙酸。轉(zhuǎn)化體系及轉(zhuǎn)化操作如下在50ml轉(zhuǎn)化瓶中加入超聲破 碎后的菌體和底物濃度為1 %的IOml反應(yīng)液，30°C下，150r/min轉(zhuǎn)化lOmin，離心去除菌體， 上清液中即含有乙酸。在340nm處測(cè)定醛脫氫酶催化乙醛生成乙酸所用的酶量，酶活定義30°C、每分鐘 A340處吸光度值增加0. OOl為1個(gè)活力單位(U)。表1 以重組大腸桿菌BL21/pET28b-aldH為酶源測(cè)定的醛脫氫酶酶活力測(cè)定結(jié)果
菌林/質(zhì)粒酶活(U/mg)
^JpfWBL21O 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，將本發(fā)明醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組大腸桿菌具 有較強(qiáng)產(chǎn)醛脫氫酶能力，可直接以含酶的菌體細(xì)胞為酶源進(jìn)行生物催化或轉(zhuǎn)化反應(yīng)。醛脫 氫酶酶作為轉(zhuǎn)化用酶，可以分別以乙醛、丙醛或3-羥基丙醛等為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備 相應(yīng)的乙酸、丙酸或3-羥基丙酸等。
權(quán)利要求
一種來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醛脫氫酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的醛脫氫酶基因，其特征在于所述醛脫氫酶基因編碼SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種含有權(quán)利要求1所述醛脫氫酶基因的重組載體。
4.一種用權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
5.如權(quán)利要求1所述的醛脫氫酶基因在制備重組醛脫氫酶中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述醛脫氫酶基因 的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培 養(yǎng)液分離得到含有重組醛脫氫酶的菌體細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組醛脫氫酶作為轉(zhuǎn)化用酶，分別以乙 醛、丙醛或3-羥基丙醛為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)的乙酸、丙酸或3-羥基丙酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來源于釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的醛脫氫酶基因及其重組表達(dá)載體、基因工程菌，及其在制備重組醛脫氫酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于釀酒酵母菌株中的醛脫氫酶基因核苷酸序列；并將該基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建的到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得含有表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-aldH的重組大腸桿菌BL21/pET28b-aldH?？蓱?yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化，將乙醛、丙醛或3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙酸、丙酸或3-羥基丙酸。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101921785SQ20101021757
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者平立英, 柳志強(qiáng), 沈寅初, 鄭裕國(guó) 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)