專利名稱:一種產(chǎn)pva脫氫酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種產(chǎn) PVA 脫氫酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase, ECl. 1. 99. 23,簡稱PVADH)的基因工程菌及其構(gòu)建方法,特別是一種高產(chǎn)PVA脫氫酶的基因 工程菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用,屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù):
PVA (全稱polyvinyl alcohol),即聚乙烯醇,是一種人工合成的水溶性的高分子 化合物,具有如下優(yōu)良理化特性溶解性好PVA溶于水,水溫越高則溶解度越大,但幾乎不 溶于有機溶劑;成膜性強PVA易成膜,其膜的機械性能優(yōu)良,膜的拉伸強度隨聚合度、醇解 度升高而增強;粘接性好PVA與親水性的纖維素有很好的粘接力,一般情況,聚合度、醇解 度越高,粘接強度越強;熱穩(wěn)定性好PVA粉末加熱到100°C左右時,外觀逐漸發(fā)生變化。由 于其特殊的理化性能,目前主要用于紡織行業(yè)漿料、織物整理劑、維尼綸纖維原料;建筑裝 潢行業(yè)的107膠、內(nèi)外墻涂料、粘合劑;化工行業(yè)用作聚合乳化劑、分散劑及聚乙烯醇縮甲 醛、縮乙醛、縮丁醛樹脂;造紙行業(yè)用作紙品粘合劑;農(nóng)業(yè)方面用于土壤改良劑、農(nóng)藥粘附 增效劑和聚乙烯醇薄膜;還可用于日用化妝品及高頻淬火劑等方面。紡織工業(yè)中的漿料,以PVA為主要成分,紡織品經(jīng)過上漿處理,其理化性能更好、 手感更佳。但是,上漿工藝也帶來了污染的問題,紡織品經(jīng)過上漿后,還需要進行退漿處理, 去除紡織品上未結(jié)合的PVA,傳統(tǒng)的退漿過程是用高溫加酸/堿或是用氧化劑來破壞PVA的 長鏈結(jié)構(gòu)使其降解,但是化學方法會對織物纖維結(jié)構(gòu)造成了較大的損傷,同時退漿廢水的 排放會對環(huán)境造成極大的污染,如果對污水進行處理,后續(xù)處理的費用高昂,又會增加企業(yè) 的負擔。近年來人們尋求通過生物法降解PVA,提高了紡織品的質(zhì)量,避免了化學法降解 PVA對植物纖維造成的損傷。目前,國內(nèi)外嘗試通過PVA降解酶降解PVA。PVA降解酶是一 個酶系,它們作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式報道的PVA降解酶主要包含三個種 類PVA脫氫酶(EC1. 1. 99. 23)、PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1. 1. 3. 30)和氧化型PVA 水解酶(β -雙酮水解酶)(EC3. 7. 1. 7)。目前對于PVA降解的研究主要集中在三個方面 1.篩選能夠降解PVA的微生物;2.純化PVA降解酶;3.克隆與PVA降解相關(guān)的基因。PVA脫氫酶(EC1. 1. 99. 23)以PQQ為電子受體的情況下,將PVA脫氫氧化為酮 基化合物。目前,關(guān)于PVA脫氫酶基因的報道不多,1996年Siimao等人在大腸桿菌中用載體 Pucl8構(gòu)建了 PVA降解菌/ ^ domonas spl VM15C的基因文庫。編碼PVA脫氫酶基因的蛋 白有639個氨基酸殘基,發(fā)現(xiàn)有一個血紅素結(jié)合位點和一個PQQ結(jié)合位點,氨基酸序列 表明與其它醌蛋白脫氫酶有較低的相似性(^iimao M et, Cloning and characterization of the gene encoding pyrroloquinoline quinonone- dependent poly (vinyl alcohol) dehydrogenase of Pseudomonas sp . st rain VM15C) ;Mamoto *艮據(jù)純化的 PVA 脫氧酶氨 基酸的N端序列,克隆出PVA脫氫酶的全基因,全長196^p,共655個氨基酸,重組酶與/ ^/ domonas spl VM15C產(chǎn)的PVA脫氫酶有51%的同源性,該酶除了能夠降解PVA外,還能夠降解二醇類,如聚丙烯醇、1. 3- 丁醇、2. 4-戊二醇等,但該酶不能作用仲醇和叔醇。目前,國外對PVA脫氫酶的研究主要側(cè)重于其基因報道和降解機理上,關(guān)于PVA脫 氫酶基因工程菌的研究報道很少,關(guān)于高產(chǎn)PVA脫氫酶基因工程菌的報道則更少。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)PVA脫氫酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase, ECl. 1. 99. 23,簡稱 PVADH)的酵母工程菌。所述酵母工程菌染色體上攜帶有PVA脫氫酶的基因、PVADH\所述PVA脫氫酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述PVA脫氫酶基因位于表達載體PPIC9K上。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種PVA脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題提供如下具體步驟 第一步PVA脫氫酶基因設(shè)計
畢赤酵母O0ZcAia pastoris^的表達系統(tǒng)有著特殊的密碼子偏好性,如果不對廣權(quán)所 基因要表達的密碼子的進行一定的修飾,畢赤酵母G0ZcAia pastor!S^可能無法正確翻譯 /VJi擬基因,且通過軟件SignalP 3. 0 Server的分析,/VJi擬基因的前75個堿基為自身的 信號肽。切掉序列的信號肽并根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性新設(shè)計的/VA //基因其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明設(shè)計的/VJi擬基因合成工作委托上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司完成。第二步PVA脫氫酶QPVADm重組質(zhì)粒的構(gòu)建
為了使/VA擬基因能在酵母中的可控高效表達,選用帶有乙醇氧化酶基因(AOX)的啟 動子AOXI的畢赤酵母表達載體(例如pPIC9K,美國hvitrogen公司),利用合成的廣權(quán)所 基因序列5'端的I限制性內(nèi)切酶位點與3'端的I限制性內(nèi)切酶位點,將合成 的/VJi擬基因克隆入載體pPIC9K。由于在AOXI強啟動子后面有一段α-因子信號肽序列, 這也為PVA脫氫酶基因在酵母中的正確分泌表達奠定了基礎(chǔ);另外,由于PPIC9K載體中含 有氨芐青霉素、遺傳霉素抗性基因,在篩選重組菌時較為方便。將含有/VJi擬基因的載體與要連接的表達載體pPIC9K進行I和Λ^ I酶切, 連接得到含有/VJi擬基因的重組質(zhì)粒PPIC9K-P權(quán)所。第三步PVA脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建
將重組質(zhì)粒pPIC9K-/VJi擬電擊轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母GSl 15,構(gòu)建高效表達PVA脫氫酶的 組成型畢赤酵母重組菌株。本步驟采用的含PVA脫氫酶合成基因的重組表達質(zhì)粒PPIC9K+權(quán)i擬可轉(zhuǎn)化畢赤 酵母O0ZcAia pas tor is GS115, hvitrogen),成為能分泌表達外源PVA脫氫酶的功能酵母 菌由于含合成基因的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-/VJi擬上有畢赤酵母AOX基因的部分序列,當 重組表達質(zhì)粒進入酵母細胞后,通過體內(nèi)同源重組,PPIC9K+權(quán)愿可以定向整合到畢赤酵 母染色體DNA上。在外源誘導物甲醇存在的情況下,AOXI啟動子啟動外源/VJi擬基因,信 號肽指導表達產(chǎn)物進入畢赤酵母的分泌途徑,正確切割成具有生物活性的外源蛋白表達產(chǎn) 物,最終將產(chǎn)物分泌至胞外。畢赤酵母的轉(zhuǎn)化常采用電激法或化學轉(zhuǎn)化法首先接種活化后的畢赤酵母GS115一環(huán)于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28 °C-30 °C振蕩培養(yǎng)過夜,然后將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100 mL YPD (500 mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中,28 °C-30 !振蕩培養(yǎng),每隔1 h測定,培養(yǎng)直至菌 體濃度OD6tw為1. 3-1. 5,在冰水中冷卻10 min以上,然后在4°C環(huán)境下,8000 r/min離心 收集菌體,用40 mL預冷的無菌水懸浮細胞,在冷水中放置10 min,如此重復步驟4三次, 即無菌水洗滌3次,用300 4 1^預冷1 mol/L山梨醇懸浮細胞,從而獲得受體菌。然后取 50 80 μ L受體菌和5 90 μ g線性化重組表達質(zhì)粒DNA混勻,電激(電壓1500V 電容 25 μ F ;電阻200 Ω )處理,然后涂布于遺傳霉素(10ug/ml)抗性平板篩選重組子。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種PVA脫氫酶基因工程菌的應(yīng)用方法。為解決上述技術(shù)問題,提供如下技術(shù)方案 第一步重組菌株的篩選
所述重組表達質(zhì)粒pPIC9K-/VJi擬上含有遺傳霉素抗性基因,如果重組質(zhì)粒已經(jīng)整合 到染色體上,重組菌株具有遺傳霉素抗性,可在含有遺傳霉素的平板上生長;涂布含遺傳霉 素抗性平板,挑取陽性轉(zhuǎn)化子,即為產(chǎn)PVA脫氫酶酵母工程菌GS115-/VJI。第二步菌株經(jīng)培養(yǎng)分泌PVA脫氫酶 培養(yǎng)基組成(g/L):
種子培養(yǎng)基蛋白胨10-20,酵母提取物5-10,葡萄糖10-20,氯化鈉5_15 ; 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15,生物素0. 0002-0. 0005,甲醇10-50 ;微量元 素溶液,MnSO4 ·4Η20 100,ZnCl2 70,Na2MoO4 ·2Η20 35,H3BO3 60,CoCl2 ·6Η20 200,CuSO4 · 5Η20 29,NiCl2 · 6Η20 25,37% 鹽酸 0. 9 mL。優(yōu)選培養(yǎng)基組成(g/L) 種子培養(yǎng)基
蛋白胨15 g/L,酵母提取物8 g/L,葡萄糖15 g/L,氯化鈉10 g/L; 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15 g/L,生物素0. 0002-0. 0005 g/L,甲醇10-50 g/L ;微量元素溶液,MnSO4 ·4Η20 100 g/L, ZnCl2 70 g/L,Na2MoO4 · 2H20 35 g/L, H3BO3 60 g/ L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g/L, NiCl2 · 6H20 25 g/L, 37% 鹽酸 0. 9 mL。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng),250mL三角瓶,裝液量50mL,培養(yǎng)溫度-30°C,搖床轉(zhuǎn)速 200r/min,培養(yǎng)Mh ;發(fā)酵培養(yǎng),離心,收集種子,用無菌生理鹽水洗滌兩次,按10%的接種量 接入裝液量為50mL的三角瓶(500 mL)中,發(fā)酵溫度30°C,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,發(fā)酵時 間3-4天。PVA脫氫酶酶活測定方法
在37°C條件下,反應(yīng)液體系中有200 μ 1 PVA1799(10g/L),1 mM吩嗪乙基硫酸鹽,0.2 mM 2. 6-二氯靛酚,ImM 氰化鉀,1 mM CaCl2, 3 μ M PQQ, 50 mM 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2), 反應(yīng)體系1 ml。酶活定義為在該條件下,每降低1 ymol PQQ所需要的酶量,單位為mg protein 1O本發(fā)明的優(yōu)點在于構(gòu)建了一株高效分泌表達PVA脫氫酶的畢赤酵母基因工程菌, 解決了 PVA脫氫酶產(chǎn)量低的問題;應(yīng)用該菌種生產(chǎn)PVA脫氫酶,產(chǎn)量高、工藝簡單、便于工業(yè) 化應(yīng)用,該菌株生產(chǎn)的目的蛋白直接分泌到胞外,提取過程簡單,產(chǎn)品純度高,發(fā)酵結(jié)束后 PVA脫氫酶Gd權(quán)D活力可達110U/mL。本發(fā)明為生物法降解PVA的研究、開發(fā)、生產(chǎn)工作 奠定了基礎(chǔ),有利于早日實現(xiàn)紡織品退漿工藝的清潔生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例1 :PVA脫氫酶基因的合成
PVA脫氫酶0°權(quán)D的基因來源于Sphingopyxis. sp. 113P中含PVA脫氫酶(/VJD基 因的操縱子(GenBank No. AB190288),其中第3177位到第5141位是編碼/VJi擬的基因。在 切掉基因自身信號肽,并對其進行密碼子偏好性等修飾,在其5'端及3'端分別加上feo/P I和Λ^ I酶切位點,新設(shè)計的/VJi擬基因其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,由上海生工 生物工程有限公司合成。實施例2 重組質(zhì)粒pPIC9K- /VJi擬的構(gòu)建
帶有/VJi擬基因的載體和表達載體pPIC9K分別進行Λ^ I和I雙酶切,試劑盒 回收后,使用Τ4連接酶進行連接。連接反應(yīng)體系為(10 yL):目的基因片斷2 yL,載體 DNA 2 μ L,IOX T4 連接酶 Buffer 1 μ L,T4DNA 連接酶 1 μ L, ddH20 4 μ L。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下
(1)無菌狀態(tài)下取感受態(tài)細胞200μ L置于無菌的微量離心管中;
(2)每管加入1-2μ L重組質(zhì)粒,輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物,在冰上放置30 min;
(3)42°C熱休克90 s (準確),不要搖動離心管;
(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中,使細胞冷卻1-2min;
(5)每管加入無抗生素的普通LB培養(yǎng)液800uL;
(6)用無菌鋪菌器將200μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板,37°C平放20 min直 至液體被吸收,然后倒置培養(yǎng)過夜,觀察。挑選陽性轉(zhuǎn)化子,測序驗證,結(jié)果表明連接成功。實施例3 =PVA脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建
將表達載體PPIC9K- PVADHm Sal I酶切線形化。酶切體系(50 μ L體系)重組質(zhì) 粒 10 μ L,Buffer 5 μ L, Sal I 3 μ L, ddH20 32 μ L。37 °C水浴 3 h,用 PCR 產(chǎn)物純化 試劑盒對線形化產(chǎn)物進行純化回收,電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,具體方法如下
(1)接種活化后的畢赤酵母GS115—環(huán)于25mL YPD液體培養(yǎng)基中,28 °C-30 °C振蕩 培養(yǎng)過夜;
(2)將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100mL YPD (500 mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中,28 °C-30 °C振蕩 培養(yǎng),每隔1 h測定,培養(yǎng)直至菌體濃度0D_為1. 3-1. 5 ;
(3)在冰水中冷卻10min以上;
(4)48000 r/min離心收集菌體,用40 mL預冷的無菌水懸浮細胞,在冷水中放置 10 min ;
(5)重復步驟4三次,即無菌水洗滌3次;
(6)用300μ L預冷1 mol/L山梨醇懸浮細胞;
(7)加入10μ L線形化質(zhì)粒,在冰水中混勻5 min ;
(8)放入冰預冷的無菌電轉(zhuǎn)化杯(0.2 cm)中,在1500 V,電擊1_2次;
(9)加入1mL預冷的1 mol/L的山梨醇溶液;
(10)取上述100-200μ L涂布YNB平板(或離心涂布100 μ L);
(11)28 0C -30 °〇倒置培養(yǎng)1-2天,挑選白色菌落。
實施例4 酵母工程菌的篩選 1、酵母工程菌的G418篩選
接種畢赤酵母GS115轉(zhuǎn)化子于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28°C _30°C振蕩培養(yǎng)過夜,離 心收集菌體,無菌水懸浮,取100 μ L分別涂布于含G418終濃度為0. 5、1、2 mg/mL的YPD 平板培養(yǎng)基上,篩選陽性轉(zhuǎn)化子。2、陽性重組質(zhì)粒PCR驗證(25 μ L體系)
體系重組質(zhì)粒 0. 1 μ L,Buffer 2. 5 μ L,引物(20 mmol/L)各 2 μ L,dNTP (各 2. 5 mmol/L) 2 μ L,TagOM 聚合酶 0· 4 μ L, ddH20 18 μ L。反應(yīng)條件94°C預變性4 min,變性94 °C 1 min、退火55°C 1 min、延伸 72°C Imin 35個循環(huán),最后72°C延伸10 min。凝膠電泳驗證。3、雙酶切驗證提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,進行EcoR I和Afco I雙酶切,對產(chǎn)物進行電泳驗 證。4、酵母工程菌的培養(yǎng)及誘導表達
(1)陽性轉(zhuǎn)化子和空載體PPIC9K轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115分別接種于20mL YPD液體 培養(yǎng)基,30°C振蕩培養(yǎng)過夜(穩(wěn)定期);
(2)離心收集菌體,生理鹽水洗滌2次,轉(zhuǎn)入100mL MGY培養(yǎng)基(加入1 mLlOOX生 物素)中;30°C,200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h ;
(3)離心收集菌體,生理鹽水洗滌2次,轉(zhuǎn)入30mL匪液體培養(yǎng)基(加入300 yL甲 醇,300 μ L100X生物素)中;30°C,200 r/min振蕩培養(yǎng)7天;定時進行酶活測定。產(chǎn)物用 SDS-PAGE蛋白電泳分析。實施例5 發(fā)酵生產(chǎn)PVA脫氫酶
培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基,蛋白胨15 g/L,酵母提取物8 g/L,葡萄糖15 g/L,氯化鈉10 g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基,酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15 g/L,生物素0. 0002-0. 0005 g/L,甲醇10-50 g/L ;微量元素溶液,MnSO4 ·4Η20 100 g/L, ZnCl2 70 g/L,Na2MoO4 · 2H20 35 g/L, H3BO3 60 g/ L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g/L, NiCl2 · 6H20 25 g/L, 37% 鹽酸 0. 9 mL。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng),250mL三角瓶,裝液量50mL,培養(yǎng)溫度-30°C,搖床轉(zhuǎn)速 200r/min,培養(yǎng)Mh ;發(fā)酵培養(yǎng),離心,收集種子,用無菌生理鹽水洗滌兩次,按10%的接種量 接入裝液量為50mL的三角瓶(500 mL)中,發(fā)酵溫度30°C,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,發(fā)酵時 間3-4天,PVA脫氫酶0°權(quán)D活力可達110U/mL。實施例6 =PVA水溶液處理 種子培養(yǎng)基同實施例5。酵母工程菌接種于250mL三角瓶,裝液量50mL的種子培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度 280C -30°C,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)Mh。按5-10%的比例接入以PVA為唯一碳源的培養(yǎng) 基90小時,能將lg/L的PVA完全降解。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上,但其并非用以限定本發(fā)明,任何熟悉此技 術(shù)的人,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi),都可做各種的改動與修飾,因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
序 列 表<110> <120> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223>
江南大學
一種產(chǎn)PVA脫氫酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用 1
PatentIn version 3. 3 1
1901 DNA
人工合成序列
根據(jù)基因序列設(shè)計,用于基因表達。
〈400〉 1gaattctccggtaccgtggccgaaactgctcctcaatccggtcacgcagtaccagcagac60cagctggacggcgagactctgtacaaggcaCgttgtgCCgcttgccatgataacgctgaa120ggtcgtactccttctcgtgaggtactgtccaagaatccagcctccttcatcctggcttct180atgcgtactggcgctatggtcccaatggccgaaggtctgacgctggaagagatgactgct240attgcccgtgcagtcggcaaggcagatgctaaaactgacgatggtattgatctgcgtcgt300atttggggtaattccgtggaaggcactccactggacgctcctcagtgttcttctgcacct360acgcctgttgacctgggcgctgctaatcaatggaatggttggtctaccgaaaaggataat420ggccgttttcagcgtaaaccagccctggacgttgccgatatccctaagctgaaactgaag480tgggccttccaatacccaggttccaaaaacggtcaggccacggttatcggcgatcgtctg540ttcaccacttccacctctggtgctgtttacgccctgaacgcaaagactggttgtgtgtac600tggcgtcacgcagctgaaggtgccactcgtacttctccagtaatcgctgccctgcctgaa660ggcgccccagcaaaaactgcactgttcttttctgatttcaccaaggccgccgtagccctg720gatgctgaaacgggtaagcaactgtggaagactgttgtcgatgatcagccagctctgcaa780atgactggctctatcacctattgggatggcaaaatctatgtgcctatctcttccggtact840gaggccttcgctcaaattccaacttgggagtgttgcaaatttcgtggcgctctggttgct900ctggatgctgcaaccggcaagattctgtggaagcgttacactaccgagcaagagccacgt960ccttttaaactgaacaaagctggccgtcaaatgtggggtccatctggcggtgctatttgg1020gtcactccaacggtggacgaggcacgtcgtctgatttatgtcggcacgtccaactcctac1080actgacgttccatacgataattctgactccgtcatggccattgacgccgatactggtgct1140gttcgttggactgtccaactgctggctgacgacaactatattgacggttgttggcagaaa1200ggtaaagaacatgccaactgtccaaatcctctgggtcctgatttttccattggcgctgca1260ccaatttatcgtaaaatggctgatggtaaggagttcctgctggtgggtcaaaaatccggt1320atgatctacgctctggaccctgctaacaagggtgctaaaatttgggagcgtcagctgtct1380ctgggttctgCCCtgggtggcatcgaatttggtactgcagcagacgacggtaaagtttat1440gctggtgtctctgatattgcttctcaagctaaggatcgtggcaaacctggtctgtgggct1500ctggacatccgtactggtgaggtcgcttggaactttctgaacgctcctgacaccaagtgt1560cgttggaataactggtggtgccacggcgcattttcccaagctatttctgttattcctggt1620gcaatcttcg ccggttctta cgatggccat ttccgtgcct ttgacaccgc tactggtaag1680
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tctggttacg ctggtcgttc ttccgaatct ggtggccgtg atctgcgtgg cactgatggt1860
aatatcctga tggccttttc tgttgatggt aaggcggccg c190權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)PVA脫氫酶的酵母工程菌,其特征在于染色體上攜帶有PVA脫氫酶基因。
2.權(quán)利要求1所述的酵母工程菌,其特征在于,所述PVA脫氫酶基因根據(jù)畢赤酵母密碼 子偏好設(shè)計,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.權(quán)利要求1或2任一所述的酵母工程菌,其特在在于所述PVA脫氫酶基因位于表達 載體PPIC9K上。
4.一種權(quán)利要求1-3任一所述酵母工程菌的構(gòu)建方法,其特征在于包括如下步驟 第一步根據(jù)酵母密碼子偏好型設(shè)計PVA脫氫酶基因,克隆到中間載體;第二步克隆設(shè)計的PVA脫氫酶基因到表達載體PPIC9K ;第三步將所得的表達載體電擊轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母O0ZcAia pastor is GS115),構(gòu)建高 效表達PVA脫氫酶的組成型畢赤酵母工程菌。
5.權(quán)利要求1所述酵母工程菌在PVA脫氫酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述酵母工程菌處理PVA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)PVA脫氫酶(polyvinylalcoholdehydrogenase,EC1.1.99.23,簡稱PVADH)的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用,屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過將優(yōu)化后的PVA脫氫酶基因連接到畢赤酵母GS115(Pichiapastoris)染色體上,構(gòu)建了一株高效分泌表達PVA脫氫酶的基因工程菌,解決了PVA脫氫酶產(chǎn)量低的問題。應(yīng)用該菌種生產(chǎn)PVA脫氫酶,產(chǎn)量高達110U/mL,工藝簡單、便于工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號C02F3/00GK102080054SQ20101058133
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者堵國成, 張東旭, 賈東旭, 陳堅 申請人:江南大學