專利名稱：蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種法夫酵母的利用技術(shù)，尤其是利用法夫酵母生產(chǎn)蝦青素與低聚果 糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法。其技術(shù)領(lǐng)域?qū)儆谏镝t(yī)藥領(lǐng)域，該技術(shù)的發(fā)明的目的主要是降低蝦青素 的生產(chǎn)成本，促進(jìn)天然蝦青素的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵技術(shù)的推廣應(yīng)用。
背景技術(shù)：
法夫酵母是一種重要的天然蝦青素資源，利用法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素具有產(chǎn)品 安全性高、生產(chǎn)效率高、不受氣候條件限制、占地小、工藝條件容易滿足等優(yōu)點(diǎn)，是蝦青素生 產(chǎn)的高新技術(shù)發(fā)展方向。經(jīng)過國內(nèi)科研工作者的長期研究，蝦青素的發(fā)酵生產(chǎn)水平得到了大幅度提高，少 數(shù)企業(yè)，如Igene Biotechnology Inc，廈門匯盛生物有限公司實(shí)現(xiàn)了用法夫酵母產(chǎn)業(yè)化 發(fā)酵生產(chǎn)天然蝦青素，但由于存在“①菌種的產(chǎn)量水平還較低；②蝦青素是胞內(nèi)脂溶性產(chǎn) 物，要獲得高產(chǎn)，不僅要有高產(chǎn)菌株，還要有高密度培養(yǎng)技術(shù)，而菌體生長、蝦青素合成及脂 肪合成在代謝流的分配上又是相矛盾的；”等局限，蝦青素的發(fā)酵生產(chǎn)成本還高于化學(xué)合 成蝦青素的生產(chǎn)成本，降低了其產(chǎn)品的市場競爭力，推廣應(yīng)用尚存在困難。相關(guān)研究表明，法夫酵母不僅能合成蝦青素，還可以合成豐富的酶類及多糖，如果 能建立蝦青素及其他活性物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)，就有可能實(shí)現(xiàn)在同一批次的發(fā)酵過程中同時 獲得蝦青素及其他活性物質(zhì)的高產(chǎn)，從而降低蝦青素的生產(chǎn)成本，提高蝦青素產(chǎn)品的市場 競爭力。目前，雖然有研究涉及了利用法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素及低聚果糖，但都是針對 單獨(dú)發(fā)酵蝦青素或單獨(dú)發(fā)酵低聚果糖所進(jìn)行的研究，其工藝流程都包括配制培養(yǎng)基一接 種一發(fā)酵一收集菌體或發(fā)酵液；所用的培養(yǎng)基濃度低、發(fā)酵產(chǎn)量低、時間長，且每一個批次 的發(fā)酵只生產(chǎn)一種產(chǎn)品，不能同時生產(chǎn)蝦青素和低聚果糖，因此，成本高。如，目前所報導(dǎo)的 利用法夫酵母發(fā)酵蝦青素的生物量為50-60g/L干菌體、蝦青素的產(chǎn)量為30-60mg/L發(fā)酵 液、發(fā)酵液中不含低聚果糖；利用法夫酵母發(fā)酵低聚果糖的發(fā)酵液中生物量為10g/L左右， 蝦青素含量為5-6mg/L左右，發(fā)酵周期為48h以上，雖然能高產(chǎn)低聚果糖(60g/L)，但蝦青素 含量太低而無回收價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，該方法實(shí)現(xiàn)蝦青素 及低聚果糖的同時發(fā)酵，只需要進(jìn)行一次培養(yǎng)，就可同時高產(chǎn)蝦青素和低聚果糖，克服了傳 統(tǒng)蝦青素發(fā)酵及低聚果糖發(fā)酵的不足，同時回收其中的低聚果糖及蝦青素，降低法夫酵母 生產(chǎn)蝦青素的成本，節(jié)省了發(fā)酵成本及發(fā)酵時間，提高了生產(chǎn)效率。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是先通過控制發(fā)酵條件、利用補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)提高蝦青素的產(chǎn)量，當(dāng)蝦青素的臨近結(jié) 束時，添加高濃度的蔗糖及果葡萄糖的混合物，利用法夫酵母的轉(zhuǎn)糖酶活性轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚果糖。其主要步驟包括(1)種子制備；(2)初始培養(yǎng)基的配制；(3)蝦青素的高產(chǎn)發(fā)酵；(4) 低聚果糖的發(fā)酵；(5)蝦青素和低聚果糖的提取。首先，配制初始培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖1_3%，酵母膏1-2.5%，硫酸銨 1.5-2. 4 %，磷酸氫二鈉0. 1-0. 4 %，磷酸二氫鉀0. 1_0.4%，硫酸鎂0. 1-0. 2 %，氯化鈣 0.04-0. 08%，水91. 02-96. 16%。發(fā)酵為按5% _10%的接種量接種，發(fā)酵的pH值控制 在6. 0士0. 5、溶解氧30士 10%的范圍內(nèi)，溶氧與轉(zhuǎn)速聯(lián)動控制，pH用自動流加氨水反饋調(diào) 節(jié)，當(dāng)葡萄糖消耗至以下時，補(bǔ)充濃度為50%的糖液使糖濃度上升至3-4%之間，當(dāng)葡 萄糖再次下降至以下時，再次補(bǔ)充濃度為50%的葡萄糖液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度上升 到3-4%之間，這樣不斷補(bǔ)充糖液，提高發(fā)酵液中菌體及蝦青素濃度，當(dāng)總耗糖量達(dá)到24% 時，菌體濃度達(dá)到7士 1%，蝦青素濃度達(dá)到0.6士0. 時，不再補(bǔ)充葡萄糖，蝦青素的發(fā)酵 臨近終點(diǎn)。其次，當(dāng)蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，停止葡萄糖的補(bǔ)充，一次性加入添加高濃度的蔗 糖及葡萄糖漿的混合物，使蔗糖濃度達(dá)到8% -18%，總糖濃度達(dá)到11% -20%，控制溫度 16-30C、pH 4-7. 0、溶氧30士 10%繼續(xù)發(fā)酵2_36h，利用法夫酵母的轉(zhuǎn)糖酶活性，將果糖轉(zhuǎn) 移到蔗糖上合成低聚果糖(6-蔗果三糖，1-蔗果三糖)。采用上述技術(shù)方案后，實(shí)現(xiàn)了蝦青素與低聚果糖的聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵，在同一批次的發(fā)酵 中，可同時獲得蝦青素和低聚果糖的高產(chǎn)，蝦青素的產(chǎn)量達(dá)到500mg/L以上，生物達(dá)到60g/ L以上，低聚果糖的含量達(dá)到130g/L以上，蔗糖的轉(zhuǎn)化超過70%。與目前蝦青素的發(fā)酵及低聚果糖的發(fā)酵技術(shù)相比，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)及先進(jìn)性主要 體現(xiàn)在①采用高濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)法夫酵母，提高其生物量；通過補(bǔ)料使蝦青素的產(chǎn)量 獲得了突破性的提高，其產(chǎn)量水平可達(dá)500mg/L以上。②在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時添加高 濃度的蔗糖或混合糖漿，在較短的時間內(nèi)(24h以內(nèi))就產(chǎn)生了大量的低聚果糖(130g/L)。 ③實(shí)現(xiàn)了蝦青素及低聚果糖的同時生產(chǎn)，在發(fā)酵結(jié)束時，離心收集菌體就可提取其中的蝦 青素，收集上清就可提取其中的低聚果糖，這樣節(jié)省了發(fā)酵成本，縮短了發(fā)酵周期，提高了 勞動生產(chǎn)率，降低了生產(chǎn)成本。因此，本發(fā)明具有效率高、成本低、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。


圖1法夫酵母發(fā)酵過程的蝦青素含量變化曲線圖；圖2法夫酵母發(fā)酵過程的低聚果糖含量變化曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是一種蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，它包括以下步驟(1)菌種制備； (2)初始培養(yǎng)基的配制；(3)蝦青素的高產(chǎn)發(fā)酵蝦青素發(fā)酵過程中，控制糖濃度為1_4%， 補(bǔ)加高濃度的糖液，蝦青素發(fā)酵總耗糖量為24% ； (4)低聚果糖的發(fā)酵；(5)蝦青素和低聚 果糖的提取當(dāng)蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性加入添加高濃度的蔗糖及葡萄糖漿的混合 物，使蔗糖濃度達(dá)到8% -18%，總糖濃度達(dá)到11% -20%，產(chǎn)生高濃度的低聚果糖。1、步驟⑵、(3)蝦青素的發(fā)酵實(shí)施例1
(1)培養(yǎng)基成分為葡萄糖1%，酵母膏1%，硫酸銨1.5%，磷酸氫二鈉0. 1%，磷 酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂0. 1%，氯化鈣0. 04%，水96. 16%。(2)培養(yǎng)成分的計算成稱量以用10噸罐發(fā)酵為例，初始發(fā)酵體積4m3則配制發(fā)酵 初始培養(yǎng)需要葡萄糖=1% X1000L/m3X4m3X 1000g/L = 40kg，酵母膏=1% X 1000L/ m3X4m3X 1000g/L = 40kg, (NH4)2SO4 = 1. 5% X 1000L/m3X4m3X lOOOg/L = 60kg, Na2HPO4 =0. 1 % X 1000L/m3X 4m3 X lOOOg/L = 4kg, KH2PO4 = 0. 1 % X 1000L/m3X4m3X IOOOg/ L = 4kg, MgSO4 = 0. 1 % X 1000L/m3X 4m3 X lOOOg/L = 4kg, CaCl2 = 0. 04 % X 1000L/ m3X4m3X lOOOg/L = 1.6kg，水=96. 16% X 1000L/m3X4m3X lOOOg/L = 3966. 4kg。(3)初始培養(yǎng)基的配制及滅菌將以上成分稱好混合均勻，加水3. 7m3混合均勻， 調(diào)pH至6. 0，用泵打入發(fā)酵罐，滅菌、冷卻就制得發(fā)酵培養(yǎng)基。(4)配制補(bǔ)料液配制50%的葡萄糖漿，打入補(bǔ)料罐，滅菌備用。(5)接種發(fā)酵按5% -10%的接種量接種，用氨水流加法反饋調(diào)節(jié)控制pH值為 6.0士0.5、用轉(zhuǎn)速聯(lián)動控制溶解氧為30士 10%，用冷熱水控制溫度為18-24°C進(jìn)行發(fā)酵，每 隔12h取樣一次，檢測葡萄糖濃度、生物量及污染情況。(6)補(bǔ)料當(dāng)葡萄糖降低至?xí)r，第一次補(bǔ)加濃度為50%的葡萄糖，使發(fā)酵液中 葡萄糖濃度增加至3-4%，繼續(xù)發(fā)酵，當(dāng)糖度下降至1 %時，第二次補(bǔ)加葡萄糖至葡萄糖濃 度增加至3-4%，如此不斷循環(huán)，至蝦青素發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液的總耗糖量為24%，菌體濃度 可達(dá)菌體濃度達(dá)到70g/L，蝦青素濃度達(dá)到540mg/L。實(shí)施例2 (1)培養(yǎng)基成分為葡萄糖3%，酵母膏2.5%，硫酸銨2.4%，磷酸氫二鈉0.4%， 磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0. 08 %，水91. 02 %。(2)培養(yǎng)基的稱量、配制、滅菌、接種及發(fā)酵過程控制與實(shí)施例1相同。(3)補(bǔ)料補(bǔ)料的操作與實(shí)施例1相同，在補(bǔ)料結(jié)束時，發(fā)酵液共耗糖240g/L，菌體 濃度為65g/L，蝦青素為630mg/L。實(shí)施例3 (1)培養(yǎng)基成分為葡萄糖2%，酵母膏1.75%，硫酸銨1.95%，磷酸氫二鈉 0. 25%,磷酸二氫鉀0.25%，硫酸鎂0.15%，氯化鈣0. 06%，水93. 59%。(2)培養(yǎng)基的稱量、配制、滅菌、接種及發(fā)酵過程控制與實(shí)施例1相同。(3)補(bǔ)料補(bǔ)料的操作與實(shí)施例1相同，在補(bǔ)料結(jié)束時，發(fā)酵液共耗糖240g/L菌體 量為75g/L，蝦青素為690mg/L。實(shí)施例4 (1)培養(yǎng)基成分為葡萄糖3%，酵母膏2.5%，硫酸銨2%，磷酸氫二鈉0. 17%，磷 酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0. 07 %，水91. 76 %。(2)培養(yǎng)基的稱量、配制、滅菌、接種及發(fā)酵過程控制與實(shí)施例1相同。(3)補(bǔ)料補(bǔ)料的操作與實(shí)施例1相同，在補(bǔ)料結(jié)束時，發(fā)酵液共耗糖240g/L，菌體 濃度68g/L，蝦青素710mg/L。2、步驟(4)低聚果糖的發(fā)酵實(shí)施例1 (1)補(bǔ)加糖液的組成60%的蔗糖溶液；
(2)補(bǔ)加方法在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性補(bǔ)加蔗糖至總濃度為18% ；(3)發(fā)酵條件在溫度控制在16-30°C、pH 4-7. 0的條件下發(fā)酵224h。具體又可分 成幾種情況①，在溫度為16°C，pH4. 0的條件下發(fā)酵24h ；②，在溫度為30°C，pH值7. 0的 條件下培養(yǎng)5h ；③，在溫度為23°C，pH為5. 5的條件下培養(yǎng)13h ；④，在溫度為22°C，pH值 為6.0條件下培養(yǎng)2h。實(shí)施例2 (1)補(bǔ)加糖液的組成60%的蔗糖溶液；(2)補(bǔ)加方法在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性補(bǔ)加蔗糖至總濃度為8% ；(3)發(fā)酵條件在溫度控制在16_30°C、pH 4-7. 0的條件下發(fā)酵2_12h。具體又可 分成幾種情況①，在溫度為16°C，pH4. 0的條件下發(fā)酵12h ；②，在溫度為30°C，pH值7. 0 的條件下培養(yǎng)3h ；③，在溫度為23°C，pH為5. 5的條件下培養(yǎng)6h ；④，在溫度為22°C，pH值 為6.0條件下培養(yǎng)2h。實(shí)施例3 (1)補(bǔ)加糖液的組成60%的蔗糖溶液；(2)補(bǔ)加方法在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性補(bǔ)加蔗糖至總濃度為13% ；(3)發(fā)酵條件在溫度控制在16_30°C、pH 4-7. 0的條件下發(fā)酵2_18h。具體又可 分成幾種情況①，在溫度為16°C，PH4.0的條件下發(fā)酵18h ；②，在溫度為30°C，pH值7. 0 的條件下培養(yǎng)4h ；③，在溫度為23°C，pH為5. 5的條件下培養(yǎng)8h ；④，在溫度為22°C，pH值 為6.0條件下培養(yǎng)2h。實(shí)施例4 (1)補(bǔ)加糖液的組成60%的蔗糖及果葡萄糖漿的混合溶液，其中蔗糖的濃度為 32%，葡萄糖的濃度為12%，果糖的濃度為16% ；(2)補(bǔ)加方法在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性補(bǔ)加混合糖液至總糖濃度為 15%，其中，蔗糖濃度為8% Og/L，葡萄糖濃度為3%，果糖濃度為4%。(3)發(fā)酵條件在溫度控制在16_30°C、pH 4-7. 0的條件下發(fā)酵2_12h。具體又可 分成幾種情況①，在溫度為16°C，PH4.0的條件下發(fā)酵14h ；②，在溫度為30°C，pH值7. 0 的條件下培養(yǎng)6h ；③，在溫度為23°C，pH為5. 5的條件下培養(yǎng)7h ；④，在溫度為22°C，pH值 為6.0條件下培養(yǎng)2h。實(shí)施例5 (1)補(bǔ)加糖液的組成60%的蔗糖及果葡萄糖漿的混合溶液，其中蔗糖的濃度為 32%，葡萄糖的濃度為12%，果糖的濃度為16% ；(2)補(bǔ)加方法在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性補(bǔ)加混合糖液至總糖濃度為 20%，其中蔗糖為10. 7%，葡萄糖的濃度為4%，果糖的濃度為5.3% ；(3)發(fā)酵條件在溫度控制在16_30°C、pH 4-7. 0的條件下發(fā)酵2_12h。具體又可 分成幾種情況①，在溫度為16°C，PH4.0的條件下發(fā)酵IOh ；②，在溫度為30°C，pH值7. 0 的條件下培養(yǎng)2h ；③，在溫度為23°C，pH為5. 5的條件下培養(yǎng)4h ；④，在溫度為22°C，pH值 為6.0條件下培養(yǎng)2h。實(shí)施例6 (1)補(bǔ)加糖液的組成60%的蔗糖及果葡萄糖漿的混合溶液，其中蔗糖的濃度為32%，葡萄糖的濃度為12%，果糖的濃度為16% ；(2)補(bǔ)加方法在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性補(bǔ)加混合糖液至總糖濃度為 18%，其中蔗糖的濃度為9. 6%，葡萄糖的濃度為3. 6%，果糖的濃度為4. 8% ；(3)發(fā)酵條件在溫度控制在16-30°C、pH 4-7. 0的條件下發(fā)酵2_18h。具體又可 分成幾種情況①，在溫度為16°C，pH4. 0的條件下發(fā)酵9h ；②，在溫度為30°C，pH值7. 0的 條件下培養(yǎng)3h ；③，在溫度為23°C，pH為5. 5的條件下培養(yǎng)4h ；④，在溫度為22°C，pH值為 6.0條件下培養(yǎng)2h。附(1)蝦青素的發(fā)酵發(fā)酵過程中蝦青素及生物呈不斷上升趨勢，如圖1所示，至發(fā)酵結(jié)束時，蝦青素含 量超過500mg/L。(2)低聚果糖的轉(zhuǎn)化發(fā)酵過程中低聚呈現(xiàn)先增加，后減少的趨勢，如圖2所示，發(fā)酵過程中，低聚果糖 提最大值超過130g/L，新科斯糖超過120g/L，6-蔗果三糖超過19g/L。
權(quán)利要求
一種蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，它包括以下步驟(1)菌種制備；(2)初始培養(yǎng)基的配制；(3)蝦青素的高產(chǎn)發(fā)酵；(4)低聚果糖的發(fā)酵；(5)蝦青素和低聚果糖的提取；其特征在于步驟(3)蝦青素發(fā)酵過程中，控制糖濃度為1-4％，補(bǔ)加高濃度的糖液，蝦青素發(fā)酵總耗糖量為24％；步驟(4)當(dāng)蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，一次性加入添加高濃度的蔗糖及葡萄糖漿的混合物，使蔗糖濃度達(dá)到8％-18％，總糖濃度達(dá)到11％-20％，產(chǎn)生高濃度的低聚果糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，其特征在于步驟(1) 中采用的菌種為法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 0
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，其特征在于步驟(2) 的發(fā)酵初始培養(yǎng)基含有豐富的氮源及磷源，其配方為葡萄糖1-3 %，酵母膏1-2. 5 %，硫酸 銨1.5-2. 4%，磷酸氫二鈉0. 1-0. 4%，磷酸二氫鉀0. 1-0. 4%，硫酸鎂0. 1-0. 2%，氯化鈣 0. 04-0. 08%，其余為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，其特征在于步驟(3) 在接種法夫酵母后，控制發(fā)酵溶氧為30士 10%，pH值為6士0. 5，當(dāng)糖消耗至1 %以下時，補(bǔ) 充濃度為50%的葡萄糖或淀粉轉(zhuǎn)化糖液使糖濃度上升至3-4%之間，這樣不斷補(bǔ)充糖液， 提高發(fā)酵液中菌體及蝦青素濃度，當(dāng)總耗糖量達(dá)到24%時，菌體濃度達(dá)到7士 1 %，蝦青素 濃度達(dá)到0.6士0. 時，不再補(bǔ)充葡萄糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的蝦青素與低聚果糖聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵方法，其特征在于步驟(4)， 當(dāng)蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，停止葡萄糖的補(bǔ)充，一次性加入添加高濃度的蔗糖及葡萄糖漿 的混合物，使蔗糖濃度達(dá)到8% -18%，總糖濃度達(dá)到11% -20%，控制溫度為16-30°C、pH 為4-7.0、溶氧30士 10%繼續(xù)發(fā)酵2-36h，利用法夫酵母的轉(zhuǎn)糖酶活性，將果糖轉(zhuǎn)移到蔗糖 上合成低聚果糖(6-蔗果三糖，1-蔗果三糖)，離心分別收集菌體和發(fā)酵清液，菌體用于提 取蝦青素，發(fā)酵清液用于提取低聚糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用法夫酵母聯(lián)產(chǎn)蝦青素與低聚果糖的發(fā)酵方法，其主要技術(shù)流程包括菌種的培養(yǎng)→蝦青素的高產(chǎn)發(fā)酵→補(bǔ)加高濃度的蔗糖及果葡萄糖漿→控制條件轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚果糖。該發(fā)明的主要特點(diǎn)是在蝦青素發(fā)酵臨近結(jié)束時，補(bǔ)加高濃度的蔗糖及果葡萄糖漿的混合物，轉(zhuǎn)化獲得低聚果糖。采用該方法，利用同一批次培養(yǎng)的法夫酵母，可同時高產(chǎn)蝦青素及低聚果糖，可以大大降低培養(yǎng)法夫酵母生產(chǎn)蝦青素的成本。
文檔編號C12P19/00GK101886108SQ201010219089
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者倪輝, 曾琪, 李麗君, 楊遠(yuǎn)帆, 肖安風(fēng), 蔡慧農(nóng), 黃高凌 申請人:集美大學(xué)