專利名稱：一個(gè)控制番茄茸毛發(fā)生的關(guān)鍵基因Wo的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)控制番茄茸毛發(fā)生的關(guān)鍵基因 Wo的克隆，功能鑒定及應(yīng)用。該基因在調(diào)節(jié)番茄茸毛的數(shù)量和類型等方面具有顯著的功能， 可以在番茄抗蟲，抗病毒等方面進(jìn)行應(yīng)用。該基因純合后可以導(dǎo)致胚胎致死，也是番茄胚胎 發(fā)育的關(guān)鍵基因。
背景技術(shù)：
利用植物體表皮茸毛組織結(jié)構(gòu)作為植物抵抗、驅(qū)逐植食性害蟲是植物進(jìn)化過程中 形成的防御機(jī)制之一。植物表皮毛是一種特化的單細(xì)胞或多細(xì)胞表皮結(jié)構(gòu)，包括腺體茸毛 和非腺體茸毛，是研究植物細(xì)胞分化調(diào)控的一種模式材料。表皮茸毛作為植物防御的第一 道屏障，通過空間障礙和分泌次生代謝物，可延緩、驅(qū)逐、毒殺植食性害蟲危害，同時(shí)間接防 止害蟲攜帶的病毒的侵染。番茄多茸毛突變體(Wo)具有這樣的一些功能，同時(shí)該基因純合 (Woffo)后導(dǎo)致胚胎致死，其雜合子(Wowo)則能正常發(fā)育。在植物中這種自發(fā)形成的半顯性 致死基因相當(dāng)少見，因此番茄茸毛基因的研究既具有揭示茸毛基因與胚胎發(fā)育內(nèi)在關(guān)系的 理論意義，又有對(duì)番茄遺傳育種的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。番茄中的表皮茸毛分為7種類型其中I、IV、VI、VII型屬于有腺體類型；11、111、 V型屬于無腺體類型(Luckwill，1943)。Serna等(2006)認(rèn)為番茄7種類型的茸毛可能具 有不同的調(diào)控途徑。番茄單基因(Woolly，Wo)突變體導(dǎo)致多種類型的茸毛密度增加，這說 明不同類型茸毛的發(fā)育調(diào)控具有共同的調(diào)控因子。番茄多茸毛突變體最先在美國(guó)的新澤 西州發(fā)現(xiàn)，Porte獲得這一突變體并將這一性狀命名為Angora，Young和Arthur (1947)從 Porte處獲得這一材料并將這一多茸毛性狀更名為Woolly (Wo)。目前為止，在番茄遺傳資 源中心(TGRC)收集了 17種有關(guān)Wo基因的突變體材料(共有4個(gè)位點(diǎn)突變?cè)斐?，包括純 合致死和純合可育兩種類型，其中，W0__、Wov、Womz為純合致死突變，Wom為純合可育突變。這 為我們研究該基因的功能提供了豐富的種質(zhì)資源。在番茄種質(zhì)材料中，普通番茄品種體表茸毛稀少，而多毛突變體植株體表茸毛密 集，從而具有抗蟲防病毒的特性(圖1)。在番茄育種中已成功利用了多茸毛對(duì)蚜蟲和黃瓜 花葉病毒(CMV)的抵抗特性，培育出多個(gè)抗性品種。例如，我國(guó)目前栽培面積較大的番茄Fl 品種-毛粉802，總呈現(xiàn)多毛和少毛兩種表型植株(呈1 1分離)，在生產(chǎn)上我們只需要 保留多茸毛植株，而汰除不具備抗蚜蟲特性的少茸毛植株(占50%)，就可以達(dá)到抗蟲防病 毒的效果。Rick和Butler(1956)利用形態(tài)標(biāo)記將Wo基因定位于第二條染色體長(zhǎng)臂的中間區(qū) 段。Tanksley (1992)繪制的番茄遺傳圖譜顯示，Wo基因位于基因prx_2下部，prx-2與標(biāo) 記CT38處于相同的染色體位置，即Wo基因位于標(biāo)記CT38下部。番茄第二條染色體上CT38 下部共有161個(gè)分子標(biāo)記，包括8個(gè)SSR標(biāo)記、65個(gè)CAPs標(biāo)記、87個(gè)AFLP標(biāo)記和1個(gè)SNP 標(biāo)記(Tomato-EXPEN2000)。從番茄第二條染色體ILs圖譜可以看出標(biāo)記CT38位于IL2-3 上。由此推斷Wo基因位于IL2-3和IL2-5上。至于番茄茸毛基因Wo的精細(xì)定位、分離和克隆，茸毛分化發(fā)育的調(diào)控途徑以及導(dǎo)致純合胚胎致死的原因還沒有進(jìn)行過深入的研究報(bào)道。目前，關(guān)于植物茸毛發(fā)育的研究有很多，主要集中在擬南芥和棉花兩種植物。擬 南芥(Arabidopsisthaliana)表皮毛是一種單細(xì)胞非腺體茸毛，廣泛分布于葉片、莖、葉、 花瓣和根的表面，是研究植物細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的一種模式植物。大量茸毛相關(guān)突變體的獲 得及相關(guān)基因的定位克隆及功能分析，其茸毛分化發(fā)育的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)了解得比較清楚。 Kryvych等(2008)對(duì)擬南芥的茸毛表達(dá)基因進(jìn)行了 EST分析。GLl是擬南芥中最早克隆到 的控制表皮毛發(fā)育的關(guān)鍵基因，它編碼一種R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，由228個(gè)氨基酸組成，含有 3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，3'端存在一段增強(qiáng)子序列，MYB結(jié)構(gòu)域與HLH蛋白GLABRA3 (GL3) 和EGL3的N端相接合。TRANSPARENT TESTA GLABRA 1 (TTGl)是另外一個(gè)調(diào)控茸毛發(fā)育的 關(guān)鍵基因，它編碼一個(gè)具有四個(gè)保守WD重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白，也能與HLH蛋白GLABRA3(GL3) 和EGL3相接合進(jìn)而與MYB蛋白發(fā)生作用。GLl、GL3、EGL3和TTGl形成復(fù)合物共同調(diào)節(jié)茸 毛的發(fā)育。四個(gè)單重復(fù) MYB 蛋白 CAI3RICE(CPC)、TRIPTYCHON(TRY)、ENHANCER OF TRY AND CPCl (ETCl)和ETC2影響GLl蛋白的活性，其中CPC和TRY與bHLH蛋白(GL3和EGL3)的 N端相互作用，ETCl與EGL3相互作用。TRY、CPC和ETCl與GLl競(jìng)爭(zhēng)bHLH蛋白，抑制GLl、 GL3、EGL3、TTG1復(fù)合物的形成，從而阻止該細(xì)胞選擇茸毛的命運(yùn)(圖2)。另一個(gè)研究較多的是棉花(Gossypium arboretum)，棉花的棉纖維是一種單細(xì)胞 非腺體茸毛。Wang等(2004)克隆到一個(gè)在纖維細(xì)胞發(fā)育早期高度表達(dá)的基因一 GaMYB2，它 屬于R2R3MYB家族。該基因在GLl基因啟動(dòng)子的作用下能夠恢復(fù)gll突變體的表型，在35S 啟動(dòng)子的作用下能誘導(dǎo)擬南芥的種子生成茸毛。另外一個(gè)在發(fā)育中的棉纖維細(xì)胞高度表達(dá) 的基因GhMYB109，也是屬于R2R3 MYB家族。GaMYB2和GhMYB109均含有與bHLH蛋白相結(jié) 合的模體。后來，在棉花中已克隆到兩個(gè)編碼WD重復(fù)蛋白，并且具有與擬南芥中TTGl相似 的功能，能夠恢復(fù)突變體(ttgl)的表型。棉花也可能是通過與擬南芥相似的復(fù)合物一MYB、 bHLH和WD來調(diào)控棉纖維細(xì)胞的發(fā)育。Serna等(2006)將這些調(diào)控茸毛分化的MYB相關(guān)基因進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)擬南 芥茸毛調(diào)控基因GLl、AtMYB23與棉花纖維調(diào)控基因GhMYB 109、GaMYB2屬于同一進(jìn)化分支， 這兩種植物均為Rosids ；而金魚草茸毛調(diào)控基因MIXTA、AmMYBMLl和矮牽牛茸毛調(diào)控基因 PhMYBl屬于同一進(jìn)化分支，這兩種植物包括番茄均為Asterids。可見，Asteroids類植物 與Rosids類植物具有不同的茸毛調(diào)控途徑。茸毛作為植物體與環(huán)境直接接觸的組織結(jié)構(gòu)，它的防蟲抗蟲作用已經(jīng)被越來越多 的人認(rèn)識(shí)到。Chu等(1999)的茸毛密度-白粉虱相關(guān)性研究表明，高密度茸毛植株上的 蟲卵和幼蟲明顯少于低密度植株。Gurr等(2002)用乙醇溶液去除腺體表面次級(jí)分泌物， 降低了馬鈴薯夜蛾的死亡率。番茄中的次生代謝物姜烯對(duì)節(jié)肢動(dòng)物有明顯的抗性，Maluf 等(2001)的研究表明，茸毛密度與姜烯的含量高低密切相關(guān)?，F(xiàn)在以植物的茸毛結(jié)構(gòu)作 為生物反應(yīng)器，利用基因工程技術(shù)提高或抑制次生代謝物生物途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)量，從 而獲得高含次生代謝物的轉(zhuǎn)基因植株。但是，由于次級(jí)代謝物的調(diào)控途徑非常復(fù)雜，其在 植物體內(nèi)的含量不僅受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，而且轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)水平以及轉(zhuǎn)運(yùn)過程都對(duì) 其含量有很大的影響。另外，次級(jí)代謝物在不同物種中、不同的環(huán)境條件下，其含量均會(huì) 受到影響(Verpoorte R.，2002)。單獨(dú)改變一個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá)量往往不會(huì)提高目的次級(jí)代謝物的含量。這種方法很難用于植物的抗性育種。目前僅見到Wagner等(2001) 有過相關(guān)的報(bào)道，他們通過抑制茸毛特異基因一P450羥化酶基因的表達(dá)，顯著提高了 Cembratriene-ol (CBT-ol)的含量，減少了蚜蟲的危害。如果我們能夠在番茄中克隆到調(diào)節(jié) 茸毛分化發(fā)育的關(guān)鍵基因，像擬南芥中的GLl和TTG1，通過增加番茄體表茸毛密度來增加 抗性則是一種更加有效的方法。番茄多茸毛突變體給我們提供了這樣的材料。在番茄生產(chǎn)實(shí)踐中，由于多茸毛突變體材料存在著純合子胚致死效應(yīng)而使其難以 育成純合穩(wěn)定的親本株系，而少毛植株的自交后代少毛性狀不再發(fā)生分離。這顯示番茄茸 毛發(fā)生與胚胎致死存在一定的因果關(guān)系，表明多茸毛基因不僅具有調(diào)控多細(xì)胞茸毛發(fā)育的 功能，而且純合(WoWo)后會(huì)導(dǎo)致番茄胚胎的死亡。已有的研究報(bào)道均表明多茸毛基因Wo與 導(dǎo)致胚胎純合致死的是同一基因。Wo基因純合會(huì)導(dǎo)致番茄胚胎敗育的現(xiàn)象引起了很多研究 人員的關(guān)注。研究人員對(duì)多茸毛植株的種子作了發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，大約有25%的種子不能發(fā)芽，并 對(duì)這些不發(fā)芽的種子作了解剖學(xué)上的觀察，發(fā)現(xiàn)這些種子均含有正常發(fā)育的胚乳和敗育的 胚胎。這說明致死作用不是由胚乳發(fā)育不良引起的(Shilling，1959)。后來研究人員對(duì)這 種番茄胚胎做了石蠟切片的觀察，發(fā)現(xiàn)在敗育的胚胎組織中沒有維管束的分化，這說明Wo 基因可能影響維管束的分化，并報(bào)道這種致死作用發(fā)生在花后22天之前(Huang，1960)。在植物上，胚胎發(fā)育的基因調(diào)控已經(jīng)有了比較深入的研究，如擬南芥，發(fā)現(xiàn)了很 多胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因。Xu等(2003)報(bào)道了 AtCPSF73-II基因的Ds插入突變的 純合植株LGT1922會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，而雜合體植株會(huì)表現(xiàn)正常。Sparkes等(2003)報(bào)道了 PEXlO的Ds插入所獲得的雜合突變體在適宜的生長(zhǎng)環(huán)境中表現(xiàn)正常的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但會(huì)產(chǎn)生 約20%敗育的種子。Kim和Huang(2004)報(bào)道了 LPAATl的T-DNA插入純合突變體產(chǎn)生皺 縮的種子，種子里面的胚胎在心形胚向魚雷形胚過渡的時(shí)期發(fā)生了敗育。同樣，Kandasamy 等(2005)發(fā)現(xiàn)APR7基因?qū)е录兒献优咧滤?，也影響植株生長(zhǎng)和發(fā)育，包括茸毛的發(fā)育。 Apuyal等(2002)報(bào)道了 RASPBERRY3編碼一種參與胚胎發(fā)育的新型蛋白，相關(guān)的突變體 會(huì)導(dǎo)致胚胎在球形胚時(shí)期發(fā)生敗育。Uwer等(1998)報(bào)道了 EDDl的突變體產(chǎn)生胚胎致死 的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在球形胚向心形胚過渡的時(shí)期。AtCSLA7、EMB506、RAPT0R/K0G1、 schlepperless(slp)等這些基因的突變體都在心形胚之前發(fā)生了致死現(xiàn)象。但還沒有基因 具有番茄茸毛基因Wo這樣的特點(diǎn)既調(diào)節(jié)體表茸毛的分化發(fā)育，又參與胚胎的生長(zhǎng)調(diào)控。茸毛基因Wo的研究既具有理論價(jià)值，又具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。植物中自發(fā)突變所 形成的致死基因非常少見，對(duì)植物胚胎致死的研究也不多。本發(fā)明以番茄茸毛自發(fā)突變體 和茸毛基因所在區(qū)段的ILs系為親本材料構(gòu)建遺傳作圖群體，采用已知分子標(biāo)記和新開發(fā) 的分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行精細(xì)定位，利用生物信息學(xué)分析確定候選基因，首次成功克隆了 Wo基 因，并且通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該基因的功能。該發(fā)明中克隆的基因?qū)ρ芯咳酌陌l(fā) 育途徑和機(jī)理，以及與胚胎致死之間的關(guān)系有重要意義，同時(shí)該基因還在番茄的抗蟲和抗 病毒育種中有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一個(gè)控制番茄茸毛發(fā)生的關(guān)鍵基因Wo的克隆及應(yīng)用。本發(fā)明 通過圖位克隆獲得的一個(gè)控制番茄茸毛發(fā)生的關(guān)鍵基因(Wo)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)該基因 在番茄茸毛發(fā)生方面的功能進(jìn)行驗(yàn)證與應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明通過利用番茄茸毛突變體和IL系構(gòu)建F2分離群體(具體步驟見實(shí)施例 1)，采用圖位克隆技術(shù)，從番茄中克隆獲得了 Wo基因，它屬于同源異型家族，它不同于目前 報(bào)道的在擬南芥和棉花中所克隆茸毛調(diào)控關(guān)鍵基因，不屬于這個(gè)基因家族，而是一個(gè)新分 離的基因，申請(qǐng)人將這個(gè)新分離的基因仍然命名為Wo基因，該基因的cDNA序列如序列表 SEQ ID NO :1所示，它包括2193個(gè)堿基對(duì)，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，它編 碼731個(gè)氨基酸。與此同時(shí)本發(fā)明克隆得到Wo基因的等位基因-1，它的cDNA序列如序列 表SEQ ID NO :3所示，它包括2193個(gè)堿基對(duì)，該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如序列表SEQID NO: 4所示，它編碼731個(gè)氨基酸，在序列表SEQ ID NO 3的1700bp處有一個(gè)G1700-T1700的 堿基突變。克隆得到Wo基因的另一個(gè)等位基因-2，它的cDNA序列如SEQ ID NO :5所示， 它包括2193個(gè)堿基對(duì)，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示，編碼731個(gè)氨基 酸，在序列表SEQ ID NO 5的2075bp處有一個(gè)T2075-C2070的堿基突變。本發(fā)明還獲得的 Wo基因的啟動(dòng)子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 7所示，它包括3883個(gè)堿基對(duì)。本 發(fā)明利用克隆的Wo基因在番茄中超量表達(dá)，可顯著提高番茄的表皮毛數(shù)量，增強(qiáng)番茄的抗 蟲性和增強(qiáng)抗病毒的能力。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQIDNO:1是Wo基因的cDNA序列O
序列表SEQIDNO:2是Wo基因?qū)?yīng)的氨基畫I序列。
序列表SEQIDNO:3是Wo基因的等位基因--1的cDNA序列O
序列表SEQIDNO:4是Wo基因的等位基因-1對(duì)應(yīng)的氨基畫I序列。
序列表SEQIDNO:5是Wo基因的等位基因--2的cDNA序列O
序列表SEQIDNO:6是Wo基因的等位基因--2對(duì)應(yīng)的氨基畫i序列。
序列表SEQIDNO7是Wo基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列。圖1 是番茄多茸毛的突變體和正常茸毛的野生型的植株表型。圖中圖IA是番 茄多茸毛的突變體；圖IB是正常茸毛的野生型。圖2 是擬南芥茸毛的形成機(jī)制模式圖。圖3 是基于IL2-3XLA3186雜交的F2群體對(duì)Wo基因的精細(xì)定位(a)Wo基因位 于番茄第2條染色體的分子標(biāo)記W124和C2_At5g64670之間。(b)分子標(biāo)記W124和C2_ At5g64670在滲入系IL 2-3和IL 2-5的相對(duì)位置。(C)Wo與分子標(biāo)記STS4共分離·。(d) Wo所在的兩個(gè)BAC的示意圖。(e)包含Wo基因的BAC19個(gè)候選基因信息，紅色箭頭所示的 位置為候選的Wo基因。圖4:是Wo基因的cDNA序列比對(duì)結(jié)果。圖中1_7基因序列來自于番茄種質(zhì)多茸 毛突變體LA3186的Wo基因的cDNA不同克隆，8是少毛基因型wo的cDNA序列。在多茸毛 突變體Wo基因cDNA序列第1904位點(diǎn)處，大約有一半(50% )由C突變?yōu)镚。圖5 是Wo基因的gDNA序列比對(duì)結(jié)果。圖中基因序列來自于番茄種質(zhì)多茸毛突變 體LA3186的Wo基因的gDNA不同克隆，在基因gDNA序列3113位點(diǎn)處，大約有一半(50% ) 由C突變?yōu)镚。
圖6 :Wo基因幾個(gè)等位基因的cDNA序列比對(duì)結(jié)果。圖中1_3為L(zhǎng)A0258不同的cDNA 克隆序列，4-6為L(zhǎng)A1531不同的cDNA克隆序列，7_9為L(zhǎng)A1908不同的cDNA克隆序列，10為 LA3186cDNA克隆序列。圖7 石蠟切片觀察番茄正常胚胎(1-5)與LA3186突變體胚胎(6_10)的發(fā)育過程。圖8 :pMV2-ffo超量表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖9 是轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR-CAPS檢測(cè)結(jié)果。利用Wo特異全長(zhǎng)引物首先將基因擴(kuò)增 出來，然后利用酶切鑒定，對(duì)照酶切后的大小為1868kb和1534，而轉(zhuǎn)基因酶切后的片段除 對(duì)照的兩個(gè)片段外，還有大小為1035kb、866kb和292kb的三條帶。CK 少毛番茄對(duì)照；1，2 超量的轉(zhuǎn)基因植株1和2。圖10 是轉(zhuǎn)Wo基因的番茄植株與對(duì)照葉片上茸毛表型。圖IOA是轉(zhuǎn)空載體的對(duì) 照；圖IOB是轉(zhuǎn)基因植株1 ；圖IOC是轉(zhuǎn)基因植株2。圖11 是掃描電鏡觀察轉(zhuǎn)Wo基因番茄植株與對(duì)照葉片的表面。圖IlA是對(duì)照葉 片；圖IlB是轉(zhuǎn)基因植株葉片。圖12 是轉(zhuǎn)Wo基因番茄植株的茸毛簇生現(xiàn)象(包含圖12A和圖12B)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出更詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況 下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例1 本發(fā)明Wo基因的精確定位通過對(duì)現(xiàn)有經(jīng)典番茄遺傳圖譜Tomato-EXPEN 2000、Tomato-ILs和整合圖譜(參 見=Tanksley, 1992, http //sgn. cornell.edu/)分析知道番茄茸毛調(diào)控基因(Woolly, Wo, 該基因未被克隆)位于IL2-3和IL2-5(引自美國(guó)番茄遺傳資源中心(TGRC)，http //tgrc. ucdavis. edu/)的滲入片段所在的區(qū)間內(nèi)。在本發(fā)明中，申請(qǐng)人首先以IL2-5為母本，以茸 毛突變體LA3186(引自美國(guó)番茄遺傳資源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)為父本進(jìn)行 雜交，拔除F1中少茸毛植株，讓多茸毛植株自交并收獲F2代種子，隨后播種F2群體，隨機(jī)挑 取其中106株少毛植株作為作圖群體，采用已經(jīng)報(bào)道的分子標(biāo)記U237440，C2_At5g64670, HBa44016SP6, SSR287, W124 和 SSRD69，(上述報(bào)道的分子標(biāo)記 U237440，C2_At5g64670, HBa44016SP6, SSR287, W124 和 SSRD69 已由 http://sgn. Cornell, edu/ 公布)進(jìn)行初步定 位，將Wo基因定位在分子標(biāo)記Wl24和C2_At5g64670之間，其包含的遺傳距離為5. 8cM(見 圖3a，b)。隨后以IL2-3為母本，以茸毛突變體LA3186為父本雜交，同時(shí)拔除F1中少茸毛 植株，讓多茸毛植株自交并收獲F2代種子，隨后播種F2群體，將群體擴(kuò)大至1031株，利用 BAC 序列開發(fā)新的分子標(biāo)記 WY42，STS64, STS64, STS62 和 STS4(上述 WY42，STS64, STS64, STS62和STS4標(biāo)記的引物序列及相應(yīng)內(nèi)切酶見表1所示)進(jìn)行精細(xì)定位。將Wo基因定位 于STS64和STS62之間，并于STS4共分離(見圖3c)。利用精細(xì)定位的結(jié)果，采用與目的基因Wo兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記為探針，篩選 茸毛基因Wo所在的BACs，將Wo基因定位在第2條染色體的兩個(gè)BAC :C02HBa0006L05和 C02HBa0204D01 (http://sgn. Cornell, edu/)上(見圖 3d)，將這兩個(gè) BAC 末端進(jìn)行序列分
7析拼接后，獲得了一個(gè)包含200kb的序列，通過生物信息學(xué)分析，推測(cè)該覆蓋目的基因(Wo) 的序列含有19個(gè)ORFs (見圖3e)，通過對(duì)各ORFs可能具有的功能預(yù)測(cè)，分析其中一個(gè)基因 H0ME0D0MAIN GLABROUS 2為Wo基因的候選基因。
表1本發(fā)明用于Wo基因定位的分子標(biāo)記引物及內(nèi)切酶標(biāo)記標(biāo)記名正向引物(5' -3')反向引物(5' -3')內(nèi)切酶
類型稱
SSRWY42GGTTTCGCCAGCATAAAATGCAACAAGAGTCCCAAGCAAA
STSSTS33GCATCGGAGCTTGCTAAAAGACTTTGGTGGAGGCAAAATG
STSSTS64TTACGGGTGTAATCGCACAAAGGGAGCAGCATGGTTAAAA
CAPSSTS4ATTTGAGGCCGGTTTAGCTTTGCCTGCAGTTCCCTTTCTADral
CAPSSTS62TTTGACTGGGCAAGAACCTTTTGGGACTTTCCAGTTGAGGAvail實(shí)施例2 =Wo基因的克隆與序列分析依據(jù)候選的Wo基因信息，設(shè)計(jì)出可擴(kuò)增出該基因全長(zhǎng)的PCR引物正向引物 5，-TTCAAGATGTTTAATAACCACCAGC-3，，反向引物5，-ACCTTTCATGCATTTGCGGAAGTTAC-3，。提 取番茄葉片基因組RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(參照 J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)，通 過PCR擴(kuò)增得到Wo全長(zhǎng)基因產(chǎn)物，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，用回收試劑盒(購(gòu)自Axgen公 司)回收目的片段，用PMD18-T載體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)克隆，取5yL 連接產(chǎn)物進(jìn)行熱擊處理，具體方法參照J(rèn).薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指 南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布于含有氨芐青霉素/異丙 基-β -D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB 固體平板上，37°C培養(yǎng)過夜，挑選藍(lán)斑1個(gè)和白斑若干，于含Amp 50mg/L的液體LB培養(yǎng)基 中，于37°C 200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，用小量法提取質(zhì)粒(小量法提取質(zhì)粒的試劑盒購(gòu)自 北京普博欣公司，具體程序見該試劑盒的說明書)。將該質(zhì)粒用Wo基因特異引物，正向引 物5，-TTCMGATGTTTAATAACCACCAGC-3，，反向引物5，-ACCTTTCATGCATTTGCGGAAGTTAC-3， 進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)經(jīng)檢測(cè)正確的陽(yáng)性重組克隆進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù) 有限公司完成。本實(shí)施例獲得的Wo基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO :1所示。序 列同源性分析采用GenBank的BLAST程序，氨基酸序列比對(duì)分析采用Clustal W程 序。另外根據(jù)基因的上游序列信息設(shè)計(jì)擴(kuò)增Wo基因的啟動(dòng)子的引物，其正向引物 5，-CCATCCTATTAGCCATAAGTGTGA-3，)，反向引物5，-AATACCTTCTCGATCTTCTTCAAAA-3，。提 取番茄葉片基因組DNA，利用上述啟動(dòng)子特異引物擴(kuò)增得到啟動(dòng)子基因產(chǎn)物，克隆后進(jìn)行測(cè) 序，方法同上該啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。挑選了茸毛突變體LA3186材料中多茸毛植株，利用上述Wo的特異引物對(duì)Wo基因 進(jìn)行了擴(kuò)增，隨后將PCR產(chǎn)物克隆到PMD-18T載體，隨機(jī)挑選了多個(gè)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。同 時(shí)，對(duì)少毛植株(基因型為wowo)中wo基因進(jìn)行了測(cè)定，序列比對(duì)結(jié)果表明，與少毛的WO 基因相比，多茸毛材料中有一半的克隆在第1904位點(diǎn)處發(fā)生了變異，其堿基序列由C突變 為G，所以多茸毛的LA3186突變體Wo位點(diǎn)是處于雜合狀態(tài)(基因型為Wowo)，這個(gè)位點(diǎn)正 好是一個(gè)Xho I的酶切位點(diǎn)，本發(fā)明可以利用Xho I酶切來鑒定番茄多毛突變體和番茄少毛的野生型(圖4)。為了驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，對(duì)多茸毛材料Wo基因的多個(gè)gDNA克隆也進(jìn)行了 測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在gDNA序列的第3113位點(diǎn)(即cDNA的1904位點(diǎn))處發(fā)生了 50%相同的突變 (見圖5)。此結(jié)果進(jìn)一步說明材料LA3186的Wo位點(diǎn)是雜合的，這與LA3186具有純合致死 的特點(diǎn)正好相符。分析Wo基因的序列結(jié)構(gòu)表明，Wo基因由730個(gè)氨基酸殘基組成，自序列 表SEQ ID NO :2的第58位至第117位是同源異型結(jié)構(gòu)域，第126位至第203位是亮氨酸拉 鏈結(jié)構(gòu)域，第250位到469位是蛋白質(zhì)的START保守結(jié)構(gòu)域。同時(shí)對(duì)幾個(gè)茸毛等位突變體的Wo基因cDNA序列進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)同樣具有純合 致死特性的材料LA0053(引自美國(guó)番茄遺傳資源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)和毛 粉802 (購(gòu)自中國(guó)陜西省西安市蔬菜研究所，商業(yè)品種)在Wo基因第1904位點(diǎn)處堿基也由C 突變?yōu)镚。而純合不致死材料LA0258，LA1531(引自美國(guó)番茄遺傳資源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)在Wo基因cDNA序列第1700位點(diǎn)處由G突變?yōu)門 (圖6)，另外一個(gè)純合不致 死材料LA1908(引自美國(guó)番茄遺傳資源中心，http://tgrc. ucdavis. edu/)在第2075位點(diǎn) 處由T變?yōu)镃(圖6)。對(duì)比擬南芥、玉米、楊樹等不同的作物中Wo基因編碼的蛋白質(zhì)序列， 發(fā)現(xiàn)茸毛突變體堿基突變的位置正好是氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，其變異對(duì)氨基酸編碼的蛋白 質(zhì)的功能有很大的影響。實(shí)施例3 茸毛突變體植株中胚胎敗育時(shí)期的確定茸毛突變體LA3186有純合導(dǎo)致胚胎致死的特性，申請(qǐng)人以LA3186為材料，對(duì)其胚 胎致死的時(shí)期進(jìn)行了顯微觀察。采集授粉花后第4天到第40天的番茄果實(shí)中的種子(番 茄植株生長(zhǎng)一致，均采第3薹果)進(jìn)行固定、染色、脫水等步驟制作石蠟切片(方法參照，王 灶安，1992)，觀察統(tǒng)計(jì)花授粉后各個(gè)時(shí)期番茄胚胎發(fā)育的情況，發(fā)現(xiàn)授粉后7天胚胎的發(fā) 育程度差異不大，到第9天，正常胚胎和敗育胚胎的發(fā)育開始出現(xiàn)不同，正常胚胎隨著時(shí)間 的增加，胚柄開始降解，胚胎出現(xiàn)明顯的分化，隨后經(jīng)過球形胚，魚雷形胚，子葉形胚逐漸成 熟。而敗育胚胎始終停滯在球形胚時(shí)期，沒有繼續(xù)分化，胚柄也沒有降解(圖7)。實(shí)施例4 與茸毛發(fā)生相關(guān)的Wo基因的功能互補(bǔ)驗(yàn)證利用設(shè)計(jì)的Wo基因的特異引物(引物序列見本發(fā)明的實(shí)施例2)，用fastPfu酶 (購(gòu)自Transgen公司)，從多茸毛的突變體材料LA3186中擴(kuò)增Wo基因的全長(zhǎng)cDNA序列， 將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收(回收試劑盒購(gòu)自Axgen公司)后，連接到pEASY-Blimt載體(購(gòu)自 Transgen公司)上，測(cè)序后確認(rèn)在Wo基因第1904位點(diǎn)處堿基為G，以XbaI和KpnI雙酶切 帶有目的基因Wo全長(zhǎng)片段的克隆pEASY-Blunt載體，同時(shí)以XbaI和KpnI雙酶切pMV2載 體，回收連接后得到含Wo基因的重組超量表達(dá)載體pMV2-Wo，構(gòu)建流程見圖8，該載體由35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，選擇標(biāo)記基因?yàn)閴延^霉素(Spec)。將Wo基因的超量表達(dá)載體pMV2-Wo轉(zhuǎn)入少 毛材料AilsaCraig(引自美國(guó)番茄遺傳資源中心，http//tgrc. ucdavis. edu/)，轉(zhuǎn)化程序 參照張俊紅報(bào)道的方法(張俊紅，2006)，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。利用突變體與野生型材料的 單核苷酸突變導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)XhoI的變化，對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行了 PCR-CAPS鑒定(方 法是以上述轉(zhuǎn)基因番茄植株的DNA為模板，先進(jìn)行PCR擴(kuò)增(采用如上實(shí)施例2所述的Wo 基因的特異引物)，然后用XhoI酶切PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，非轉(zhuǎn)基因番茄植株 酶切后電泳條帶大小為1868bp和1534bp，由于TO代轉(zhuǎn)基因植株Wo位點(diǎn)為雜合的，所以該 轉(zhuǎn)基因番茄材料PCR產(chǎn)物應(yīng)包含Wo和wo基因序列，所以酶切后的片段除對(duì)照的兩個(gè)片段 外，還有大小為1035bp、866bp和292bp的三條帶。確認(rèn)有2株為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株(見圖9)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄植株的葉片和莖桿上茸毛明顯增多，變 得更加濃密，恢復(fù)了多茸毛突變體的表型(圖10)，利用掃描電鏡(型號(hào)，JSM-6390/LV)對(duì) 轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因)植株的茸毛進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因番茄植 株葉片上茸毛密度明顯增加(圖11)，并且葉片上有些茸毛簇生在一起，與一般番茄的茸毛 有明顯的區(qū)別(圖12)。主要參考文獻(xiàn)1.王灶安.植物顯微技術(shù).北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，19922.張俊紅.番茄Aux/IAA基因的克降與功能分析，博士論文，中國(guó)知網(wǎng)httD Il epub3. cnki. net3. 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權(quán)利要求
一種調(diào)控番茄茸毛的Wo基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的基因，它的蛋白質(zhì)序列如SEQID N0:2所示。
3.權(quán)利要求1所述的Wo基因的等位基因-1，它的cDNA序列如序列表SEQID N0:3所 示，在序列表SEQ ID NO 3的1700bp處有一個(gè)G1700-T1700的堿基突變。
4.權(quán)利要求1所述的Wo基因的等位基因-2，它的cDNA序列如SEQID NO 5所示，它 的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO :6所示，在序列表SEQ ID NO :5的2075bp處有一個(gè) T2075-C2075的堿基突變。
5.權(quán)利要求1所述的Wo基因的啟動(dòng)子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:7所示。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的基因在番茄遺傳改良中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求5所述的啟動(dòng)子在控制基因在番茄中表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)與番茄茸毛發(fā)生相關(guān)的Wo基因的克隆及應(yīng)用。本發(fā)明克隆的Wo基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，它編碼731個(gè)氨基酸。本發(fā)明的還涉及Wo基因的啟動(dòng)子以及Wo基因的兩個(gè)等位基因的克隆。本發(fā)明Wo基因在番茄中超量表達(dá)，可提高番茄的表皮毛數(shù)量，顯著增強(qiáng)番茄的抗蟲性和增強(qiáng)抗病毒的能力。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101985623SQ20101023422
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者盧永恩, 葉志彪, 張余洋, 張俊紅, 李漢霞, 楊長(zhǎng)憲, 王濤濤 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)