專利名稱：一種用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒。
背景技術：
我國每年因重大動物疾病造成的直接經濟損失達到了 300多億元人民幣，重大動物疾病給畜牧生產帶來了嚴重影響。動物抗病育種研究進展緩慢，易感個體數量增加，重大傳染性疾病時有發(fā)生。特別是人畜共患病(如禽流感等)的出現，給人類的社會生活也造成了巨大影響。單核細胞是動物外周血中的一類多能干細胞。單核細胞核大，常呈腎形或馬蹄形， 胞質豐富，在瑞氏染色血涂片中，胞質為極弱嗜堿性，呈淺灰藍色，細胞形狀不一，有圓形， 多角形等。單核細胞具有趨化作用和吞噬作用，可以吞噬、消化與消滅侵入機體的病原體， 也可以將特異性抗原呈遞給T細胞引發(fā)體液免疫。同時單核細胞還具有其他功能識別和清除變性的血漿蛋白、脂類等大分子物質；識別和殺傷腫瘤細胞；清除衰老與損傷的細胞和細胞碎片；在吞噬衰老的紅細胞和溶血時逸出的血紅蛋白后，參與鐵和膽色素代謝；參與調節(jié)粒系造血祖細胞的增殖和分化。動物外周血中的單核細胞在特異性免疫與非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，既具有吞噬、消化與消滅侵入機體的病原體的功能，又具有將特異性抗原呈遞給T細胞引發(fā)體液免疫的雙重功能。單核細胞吞噬能力具有良好的遺傳基礎、 在品種間差異較大、且經過幾代選育能夠穩(wěn)定遺傳，因此可以作為一個重要的標記用于動物的抗病育種?，F有技術已經能夠從外周血液中快速分離單核細胞以及單核細胞的鑒定，且充分證明了單核細胞吞噬特性同動物機體的抗病能力、病原體清除能力，以及攻毒后抗體產生水平有著顯著的相關性，可以很好地反映機體的免疫能力。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒，包括經染料染色的腫瘤細胞。經染料染色的腫瘤細胞在制備用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述試劑盒或上述應用中，所述試劑盒包括細胞儲存液，所述經染料染色的腫瘤細胞混合于所述細胞儲存液中；所述細胞儲存液組成由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和水組成，磷酸二氫鈉在所述細胞儲存液中的濃度為1. 14g/L，磷酸氫二鈉在所述細胞儲存液中的濃度為0. 2g/L，氯化鈉在所述細胞儲存液中的濃度為8g/L。上述試劑盒或上述應用中，所述試劑盒包括單核細胞培養(yǎng)液和二甲基亞砜；所述單核細胞培養(yǎng)液為添加胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清在所述單核細胞培養(yǎng)液中的濃度為10% (體積百分含量)。
上述試劑盒或上述應用中，所述試劑盒由所述經染料染色的腫瘤細胞、所述細胞儲存液、單核細胞培養(yǎng)液和二甲基亞砜組成；所述經染料染色的腫瘤細胞混合于所述細胞儲存液中。 上述試劑盒或上述應用中，所述試劑盒中，所述染料染色的腫瘤細胞在所述細胞儲存液中的濃度為1000個細胞/ml、2000個細胞/ml、4000個細胞/ml、6000個細胞/ml、 8000個細胞/ml、10000個細胞/ml或12000個細胞/ml。上述試劑盒或上述應用中，所述經染料染色的腫瘤細胞是按照包括如下步驟的方法制備得到的將所述腫瘤細胞預培養(yǎng)，得到預培養(yǎng)后的腫瘤細胞，將所述預培養(yǎng)后的腫瘤細胞與染料溶液混合，培養(yǎng)10h-12h，得到經染料染色的腫瘤細胞。此過程中，一般培養(yǎng)IOh 后貼壁細胞容易被移液槍吹起。上述試劑盒或上述應用中，所述預培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述腫瘤細胞以 IO6個/ml密度接種于腫瘤細胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至所述腫瘤細胞匯合至60% -70%，得到所述預培養(yǎng)后的腫瘤細胞；所述將所述預培養(yǎng)后的腫瘤細胞與染料溶液混合，培養(yǎng)12小時中，所述培養(yǎng)的方式為37°C、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述試劑盒或上述應用中，所述腫瘤細胞為結直腸癌HCT-8細胞或細胞；上述試劑盒或上述應用中，所述染料為3- (4，5- 二甲基噻唑- -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽或熒光染料；所述熒光染料為PI、DAPI、Hoechst 33342, Hoechst 33258, EB, cy3或 cy5 ；所述染料溶液由3- (4，5- 二甲基噻唑- -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽和水組成3_ (4， 5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽在染料溶液中的濃度0. 5% (質量百分比)。上述試劑盒或上述應用中，所述用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒為用于檢測雞單核細胞吞噬能力或羊單核細胞吞噬能力的試劑盒；所述雞為矮小雞，所述羊為薩?？搜?。傳統(tǒng)檢測單核細胞吞噬能力是利用異種紅細胞為吞噬物，在顯微鏡下觀察單核細胞吞噬、消化的紅細胞數量，此方法耗時長、準確率低、成本高、人為因素也很多，且檢測量比較少，不利于規(guī)?；爱a業(yè)推廣。本發(fā)明針對傳統(tǒng)紅細胞檢測方法的缺陷與不足，改進工藝技術，實現快速、準確穩(wěn)定、高通量、自動化、低成本檢測單核細胞吞噬能力。本發(fā)明中不以紅細胞為特異吞噬物，而是以經染色的腫瘤細胞系為吞噬物，腫瘤細胞系可從商業(yè)途徑得到，使吞噬物的來源更加廣泛，易于獲得，降低成本。實驗證明，本發(fā)明的試劑盒中的吞噬物(即經染料染色的腫瘤細胞)性能穩(wěn)定，在4°C條件下保存2周、3 周、1個月或二個月，其中經染料染色的腫瘤細胞混合于所述細胞儲存液中形成的混合物的 OD57tl值均無顯著差異，不影響單核細胞吞噬能力的檢測結果。實驗證明，相同條件下，用本發(fā)明試劑盒檢測的結果與用傳統(tǒng)方法檢測的結果無顯著差異，表明用本發(fā)明試劑盒檢測單核細胞吞噬能力的結果可靠。本發(fā)明試劑盒制備簡單，成本低廉。用本發(fā)明試劑盒實現了單核細胞的高通量快速檢測。用本發(fā)明試劑盒進行檢測時，可以在96孔板中進行，將樣品及試劑盒中的試劑加入96孔板中，使其相互作用一定時間后，用酶標儀或熒光分光光度計檢測各孔的OD值，再根據OD值計算出各孔中檢測的單核細胞的吞噬能力。采用酶標儀等儀器進行讀數，人為顯微鏡下讀數相比，既節(jié)省時間，又避免了人為誤差，提高了檢測準確性和檢測效率。傳統(tǒng)方法每天僅可檢測30只個體，而本發(fā)明每天可以檢測2-300個樣品、150-300只個體，大大提高了檢測效率。實踐中，一般通過檢測單核細胞吞噬能力，來評估待測動物機體的抗病能力、病原體清除能力等免疫能力，然后將動物個體的免疫能力作為重要指標用于動物的抗病育種。 用本發(fā)明試劑盒加快了動物個體單核細胞吞噬能力的檢測速度，有利于短期內大規(guī)模判定禽類的免疫能力，為加快動物抗病育種進程提供了有力的保障，因此本發(fā)明試劑盒對動物育種及畜牧業(yè)發(fā)展起到了巨大的推動作用。


圖1為經MTT處理的腫瘤細胞HCT8的形態(tài)QOO X)。圖2為染色后不同保存時間HCT8 OD值變化。圖3為雞外周血單核細胞鑒定。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒的組成及應用結直腸癌HCT-8細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，產品目錄號為TCHu 18。MTT (化學名稱為3-G，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名稱為噻唑藍，)購自amresco，產品目錄號為0793。一、試劑盒組成1、經噻唑藍染液(MTT染液)染色的HCT-8細胞和細胞儲存液的混合物(細胞保存在細胞儲存液中)；細胞在細胞儲存液中的濃度為IxlO6個/ml。細胞儲存液組成由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和水組成，磷酸二氫鈉在細胞儲存液中的濃度為1. 14g/L，磷酸氫二鈉在細胞儲存液中的濃度為0. 2g/L，氯化鈉在細胞儲存液中的濃度為8g/L。2、單核細胞培養(yǎng)液添加胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛曲清在單核細胞培養(yǎng)液中的濃度為10% (體積百分含量)。3、二甲基亞砜(DMSO)。二、試劑盒的制備1、經噻唑蘭染液(MTT染液)染色的HCT-8細胞的制備方法將HCT-8細胞以106/ml密度接種于IOOmm裝有細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，置于 37°C、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合至60-70%，去培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入 2ml,0. 5%的MTT染液，37°C、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，棄上清，PBS洗2遍后收集細胞，即為經噻唑蘭染液(MTT染液)染色的HCT-8細胞。細胞培養(yǎng)基為DMEM，購自sigma，產品目錄號為C7710。噻唑蘭染液的組成由噻唑藍和水組成，噻唑蘭在染液中的濃度0. 5% (質量百分比)。2、將染色后的HCT-8細胞置于細胞儲存液中，保存。細胞在儲存液中的濃度為IxlO6 個/ml。三、試劑盒的功能及性能檢測Hoechst 33342 購自 sigma，產品目錄號為 B2261。(一 )檢測保存不同時間的經MTT染色的HCT-8細胞的形態(tài)將MTT染色的HCT-8細胞置于細胞儲存液中(細胞在儲存液中的濃度為IxlO6個 /ml)，4°C保存，檢測保存1周和1個月后的細胞形態(tài)。方法(1)直接檢測方法顯微鏡觀察。結果如圖1中a-Ι和b_l所示。(2)用Hoechst33M2染色檢測方法H0eChst33342染液(10微克/毫升，覆蓋住細胞即可)，靜置10分鐘，吸出染液， PBS溶液洗2遍，熒光顯微鏡觀察(激發(fā)波長320納米)。結果如圖1中a-2和b_2所示。(3)用PI染色檢測方法PI染液(10微克/毫升，覆蓋住細胞即可)，靜置10分鐘，吸出染液，PBS溶液洗2遍，熒光顯微鏡觀察(激發(fā)波長520納米)。結果如圖1中a-3 和b-3所示。結果經MTT染色后一周及一個月的細胞形態(tài)無顯著差異。熒光顯色觀察到細胞核破裂釋放核小體(a_2和b-幻，細胞死亡(a_3和b-幻，但細胞形態(tài)結構未隨保存時間不同而變化(a_3和b-3)。(a)為染色后一周的細胞形態(tài)、(b)為染色后一個月的細胞形態(tài)。 1為明視場、2為Hoechst染色、3為PI染色。表明，無論細胞儲存一周還是一個月，細胞均死亡，且細胞形態(tài)結構均未變化，均可以用來檢測單核細胞的吞噬能力。 實驗設3次重復，結果無顯著差異。( 二)染色后不同保存時間HCT8 OD值變化將MTT染色的HCT-8細胞置于細胞儲存液中，其中細胞濃度分別為1000、2000、 4000、6000、8000、10000、12000個細胞/ml，4°C保存，檢測保存不同時間的OD值。OD值檢測方法將保存后的樣品直接用熒光分光光度計進行檢測，每種濃度樣品每次檢測100微升ml，檢測波長為490nm。實驗設3次重復，結果取平均數。結果如圖2所示。結果顯示相同濃度細胞，不同保存時間的OD值之間無顯著性差異，說明MTT染色的HCT8的OD值穩(wěn)定，細胞濃度相同時，OD值檢測結果穩(wěn)定，無顯著性差異，表示以任何濃度保存細胞均可。(三)試劑盒應用1、雞單核細胞吞噬能力的檢測矮小雞品種購自北京北農大動物科技有限責任公司。本實驗分別用如下試劑盒進行檢測經噻唑蘭染液(MTT染液)染色的HCT-8細胞在細胞儲存液中的濃度為IxlO6個/ml，試劑盒在4°C保存了 1周、2周、3周、1個月和2個月。1-1、雞單核細胞的分離人淋巴分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，產品目錄號為LTS1077。矮小雞雞翅下靜脈采血，將雞抗凝血液加入等體積的Hanks溶液中，混合均勻，然后將該混合液1 1沿管壁緩慢加到人淋巴分離液面上，2000r/min離心20min;收集細胞并加入Hanks溶液，3000r/min離心lOmin，棄上清，取細胞，即為單核細胞。1-2、雞單核細胞吞噬能力的檢測完全培養(yǎng)液為添加胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清在完全培養(yǎng)液中的濃度為10% (體積百分含量)。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Sigma，產品目錄號為R6504。將單核細胞接入完全培養(yǎng)液中，得到細胞懸浮液(細胞在細胞懸浮液中的濃度為 IxlO5個/ml)，接種到96孔板中(每孔中0. Iml細胞懸浮液)，37°C，5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，棄培養(yǎng)液；向每孔中加入經噻唑蘭染液(MTT染液)染色的HCT-8細胞和細胞儲存液的混合物(混合物中HCT-8細胞濃度為IxlO6個/ml) 20 μ 1和完全培養(yǎng)液80 μ 1， 37°C，5%C02的二氧化碳培養(yǎng)箱孵育不同時間(8h、10h、12h)；棄上清，PBS清洗2次；加入 DMSO 100 μ 1，充分溶解，后酶標儀(570nm)測量吸光值。計算，吞噬積=OD57tlnm值/單核細胞總數，其中單核細胞總數是指剛開始接種時單核細胞的初始數目。吞噬積即代表細胞吞噬能力。通過檢測樣品的OD值(不同的濃度細胞OD值不同)來檢測吞噬細胞的濃度或數量。陰性對照單核細胞和100 μ 1 DMSO。陰性對照的OD值是零。實驗設3次重復，每次實驗從4只矮小雞中分離單核細胞，再分別檢測。結果取平均值士標準差。在4°C保存了 2個月的試劑盒的檢測結果如表1。表1 雞單核細胞吞噬積(平均值士標準差)
權利要求
1.一種用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒，包括經染料染色的腫瘤細胞。
2.經染料染色的腫瘤細胞在制備用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒中的應用。
3.根據權利要求1所述的試劑盒或權利要求2所述的應用，其特征在于所述試劑盒包括細胞儲存液，所述經染料染色的腫瘤細胞混合于所述細胞儲存液中；所述細胞儲存液由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和水組成，磷酸二氫鈉在所述細胞儲存液中的濃度為 1. 14g/L，磷酸氫二鈉在所述細胞儲存液中的濃度為0. 2g/L，氯化鈉在所述細胞儲存液中的濃度為8g/L。
4.根據權利要求1或3所述的試劑盒或權利要求1或3所述的應用，其特征在于所述試劑盒包括單核細胞培養(yǎng)液和二甲基亞砜；所述單核細胞培養(yǎng)液為添加胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清在所述單核細胞培養(yǎng)液中的濃度為10% (體積百分含量)。
5.根據權利要求1、3或4所述的試劑盒或權利要求1、3或4所述的應用，其特征在于 所述試劑盒由所述經染料染色的腫瘤細胞、所述細胞儲存液、單核細胞培養(yǎng)液和二甲基亞砜組成；所述經染料染色的腫瘤細胞混合于所述細胞儲存液中。
6.根據權利要求1-5中任一所述的試劑盒或權利要求1-5中任一所述的應用，其特征在于所述試劑盒中，所述經染料染色的腫瘤細胞在所述細胞儲存液中的濃度為1000個細胞/ml,2000個細胞/ml,4000個細胞/ml,6000個細胞/ml,8000個細胞/ml、10000個細胞 /ml或12000個細胞/ml。
7.根據權利要求1-6中任一所述的試劑盒或權利要求1-6中任一所述的應用，其特征在于所述經染料染色的腫瘤細胞是按照包括如下步驟的方法制備得到的將所述腫瘤細胞預培養(yǎng)，得到預培養(yǎng)后的腫瘤細胞，將所述預培養(yǎng)后的腫瘤細胞與染料溶液混合，培養(yǎng) 10h-12h或IOh或12h，得到經染料染色的腫瘤細胞。
8.根據權利要求1-7中任一所述的試劑盒或權利要求1-7中任一所述的應用，其特征在于所述預培養(yǎng)的方法包括如下步驟將所述腫瘤細胞以IO6個/ml密度接種于腫瘤細胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至所述腫瘤細胞匯合至 60% -70%，得到所述預培養(yǎng)后的腫瘤細胞；所述將所述預培養(yǎng)后的腫瘤細胞與染料溶液混合，培養(yǎng)lOh-ia!或IOh或Ia1中，所述培養(yǎng)的方式為37°c、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；所述細胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
9.根據權利要求1-8中任一所述的試劑盒或權利要求1-8中任一所述的應用，其特征在于所述腫瘤細胞為結直腸癌HCT-8細胞或細胞；和/或，所述染料為3- (4，5- 二甲基噻唑- -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽或熒光染料；所述熒光染料為 PI、DAPI、Hoechst 33342, Hoechst 33258、EB、cy3 或 cy5 ；所述染料溶液由3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽和水組成，3-(4， 5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽在染料溶液中的濃度為0. 5% (質量百分比)。
10.根據權利要求1-9中任一所述的試劑盒或權利要求1-9中任一所述的應用，其特征在于所述用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒為用于檢測雞單核細胞吞噬能力或羊單核細胞吞噬能力的試劑盒；所述雞為矮小雞，所述羊為薩福克羊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒。該用于檢測單核細胞吞噬能力的試劑盒，包括經染料染色的腫瘤細胞。用本發(fā)明試劑盒實現了單核細胞的高通量快速檢測。用本發(fā)明試劑盒進行檢測時，可以在96孔板中進行，將樣品及試劑盒中的試劑加入96孔板中，使其相互作用一定時間后，用酶標儀或熒光分光光度計檢測各孔的OD值，再根據OD值計算出各孔中檢測的單核細胞的吞噬能力。采用酶標儀等儀器進行讀數，人為顯微鏡下讀數相比，既節(jié)省時間，又避免了人為誤差，提高了檢測準確性和檢測效率。傳統(tǒng)方法每天僅可檢測30只個體，而本發(fā)明每天可以檢測2-300個樣品、150-300只個體，大大提高了檢測效率。
文檔編號C12Q1/02GK102337321SQ201010233980
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權日2010年7月22日
發(fā)明者牟進菲, 連正興, 韓紅兵 申請人:中國農業(yè)大學