專利名稱：一種新的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)及生 物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(Pancreatic duct epithelial cells，PDEC)與多數(shù)常見的胰 腺類疾病，如胰腺癌、胰腺炎、糖尿病等關(guān)系密切。據(jù)報道，90%以上的胰腺癌起源于胰腺導(dǎo) 管上皮細(xì)胞，而在急性胰腺炎的始發(fā)環(huán)節(jié)中胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞不僅起到粘液屏障的作用， 還能分泌含有高濃度HC03_的堿液抑制胰蛋白酶的活性，以防止胰腺的自身消化。近年來， 熱點(diǎn)研究關(guān)注于將自身胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞，有望解決可移植胰島來源 少及排異反應(yīng)等問題，其在糖尿病治療中的潛在價值逐步得到體現(xiàn)。因此，建立一個良好的 體外原代培養(yǎng)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的體系，可為探索腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫始發(fā)及細(xì)胞分化等分子 機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前培養(yǎng)胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的方法包括酶消化法和組織塊貼壁法，動物來源多為 牛、豬等大型動物，成本較高、來源較少且難以進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，而組織塊貼壁法尚有周期 較長、成纖維細(xì)胞污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。大鼠作為目前最常見的實(shí)驗(yàn)動物之一，其繁殖率高，價 格便宜，且與人類基因組有很大相似性。然而，由于大鼠的胰腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)細(xì)小、上皮來源少、 對酶消化敏感等特性，使其在胰腺類疾病體外研究中的應(yīng)用受到了一定限制。已有文獻(xiàn)報 道了大鼠的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)、分離、純化方法，如劉濤，等，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì) 胞體外分離與定向分化，《中華器官移植雜志》，2007年28卷8期，報道了分離和純化大鼠的 胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，在體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)其向胰島細(xì)胞定向分化。該方法取整個胰腺，采用膠 原酶逆行灌注法消化、Ficoll密度梯度離心結(jié)合不同細(xì)胞貼壁差異性分離和純化胰腺導(dǎo)管 上皮細(xì)胞；結(jié)果CK-19染色結(jié)果證實(shí)所獲細(xì)胞絕大多為導(dǎo)管上皮細(xì)胞。結(jié)論采用密度梯度 離心結(jié)合差異貼壁法可獲得純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。陳錦鵬，等，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮 細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化，《江蘇醫(yī)藥》，2008年34卷11期，也是取整個胰腺進(jìn)行消化，采用Ficoll 密度梯度離心法；上述報道的方法均是采用分離液方法，成本高，不利于大規(guī)模應(yīng)用。龍愛 梅，等，SD大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究，《江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報》，2005年45卷6期， 分離純化SD大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，為將其轉(zhuǎn)分化為胰島細(xì)胞提供細(xì)胞來源。方法用酶 消化法培養(yǎng)SD大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖動態(tài)，用CK-19進(jìn)行免疫組化鑒定。 結(jié)果胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞可在體外有效擴(kuò)增，有效去除成纖維細(xì)胞是擴(kuò)增的關(guān)鍵。結(jié)論低 血清培養(yǎng)和反復(fù)貼壁法可獲得較純的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。該方法取整個胰腺進(jìn)行培養(yǎng)，且 僅使用IV型膠原酶。侯敏，等，人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，《解剖學(xué)報》，2000 年31卷2期取整個胰腺，采用混合消化酶進(jìn)行消化，消化液為Hanks平衡液中加入膠原酶 IA型(Sigma)O. 5g/L，大豆胰酶抑制劑(Sigma)使其終濃度為0. 01 %，該文獻(xiàn)報道的方法 雖然運(yùn)用混合消化酶，但是消化過程并未分段，致使有些已經(jīng)過度消化，而有些還未消化充 分。此外，其它報道的方法多是取用整個胰腺組織進(jìn)行消化，消化過程中不分段，或是不同
3的步驟采用不同酶消化。采用整個胰腺的納入會造成其他種類的細(xì)胞，特別是成纖維細(xì)胞 污染的可能會大大增加；不分步消化，會使有些細(xì)胞還未消化出來，而有些細(xì)胞已經(jīng)因消化 過度而成碎片，降低細(xì)胞產(chǎn)量。Ficoll密度梯度離心法，成本高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)；組織 塊培養(yǎng)法時間長，且其余細(xì)胞污染嚴(yán)重。怎樣準(zhǔn)確地獲取實(shí)驗(yàn)材料、怎樣適度地控制酶消化 步驟、怎樣有效地去除成纖維細(xì)胞污染等技術(shù)性的難題，目前仍存在爭議。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種新的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，它包括以下工藝步驟a、從健康大鼠胰腺組織中分離主胰管；b、使用混合消化酶分步消化法對胰管組織碎塊進(jìn)行消化分離，獲取細(xì)胞團(tuán)；所述 的分步消化法為①取清洗后的胰管剪為碎塊，加入胰管碎塊4-5倍體積的混合消化酶消化10-15 分鐘，加入HBSS溶液吹打、清洗，自然沉淀，棄去上清液；加入剩余胰管碎塊2-2. 5倍體積的 混合消化酶消化5分鐘，胎牛血清FBS終止消化，自然沉淀后棄去上清液；②在①步驟的剩余胰管碎塊中加入2-4倍體積的混合消化酶，消化5分鐘，胎牛血 清FBS終止消化，自然沉淀，收集消化液；重復(fù)前述步驟，繼續(xù)消化剩余胰管碎塊，直至無肉 眼可見胰管碎塊，合并收集的消化液放至離心管中，離心，棄上清，即得細(xì)胞團(tuán)；所述的混合消化酶溶液中含有0. 1-0. 2 % w/wV型膠原酶、0. 1-0. 2% w/w透明 質(zhì)酸酶、0. 1-0. 2% w/w大豆胰酶抑制劑；所述的消化溫度為37 °C ；消化過程中PH值為 8. 0-8. 5 ；C、細(xì)胞團(tuán)純化培養(yǎng)，即得胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的混合消化酶配方為0. w/wV型膠原酶，0. w/w透明質(zhì) 酸酶，0. 1% w/w大豆胰酶抑制劑。其中a步驟選取的僅僅為主胰管，而并非傳統(tǒng)培養(yǎng)方式所選用的整個胰腺組織； 且分離過程在胰管仍附著于周圍器官上時進(jìn)行，可利用周圍器官張力使其得到干凈、快速 的剝離。具體解剖方式為兩把鑷子同時提起胃幽門部和十二指腸近端，完全暴露胰腺頭 部。在燈光照射下可見一寬度約為Imm左右黃色透明管狀體呈30-45度角橫跨胰腺頭部， 此即為主胰管。小心去除主胰管周圍胰腺組織，應(yīng)盡量剔除干凈。游離出主胰管后，將其剪 下置于提前準(zhǔn)備好的5-6ml冰HBSS溶液中。在選取實(shí)驗(yàn)材料時僅取用主胰管這極大的減少了腺泡細(xì)胞在消化過程中腺泡細(xì) 胞破裂對上皮細(xì)胞的傷害，以及間質(zhì)細(xì)胞的污染機(jī)會。其中，所述步驟b中的混合消化酶分步消化法的具體工藝步驟為(1)將獲取的胰管置于無菌的生物安全柜中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，冰HBSS沖洗三次以 上；(2)眼科剪將胰管剪為l_2mm碎塊，置于15ml離心管中；(3)加入2ml混合消化酶于37°C水浴箱消化10_15分鐘，每隔3_4分鐘振蕩搖晃， 混合消化酶的體積為胰管碎塊體積的4-5倍；(4)加入6_8ml HBSS，待肉眼可見的胰管碎塊自然沉淀后，棄去上清液；
(5)另加入Iml混合消化酶繼續(xù)于37°C水浴箱中消化5分鐘；(6)0. 5ml胎牛血清FBS終止消化，待其自然沉淀后，棄上清；(7)加入Iml混合消化酶，37°C消化5分鐘，期間吹打并搖動；(8)0. 5ml胎牛血清FBS終止消化并自然沉淀，收集液體至一無菌離心管中；(9)重復(fù)步驟(7)、⑶三至四次，直至無肉眼可見胰管碎塊；(10)將收集到的液體1600rmp離心10分鐘，棄上清；(Il)HBSS重懸細(xì)胞，1200rmp再次離心5分鐘，棄上清；(12)加入4ml高血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞團(tuán)，吹打均勻后種于60mm2無菌培養(yǎng)皿中；(13)在 37°C，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。上述混合消化酶消化過程中pH值為8. 0-8. 5。其中，步驟(3)中水浴箱消化12分鐘。其中，所述HBSS溶液為1000ml三蒸水中加入7. 6g氯化鈉、0. 25g氯化鎂、1.8g葡 萄糖和2. 24g HEPES配制而成。進(jìn)一步地，所述的HBSS溶液中加入500U/ml青霉素和5 μ g/ml鏈霉素。所述步驟c的純化、培養(yǎng)方法為將細(xì)胞團(tuán)中加入高血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞團(tuán)，種 于無菌培養(yǎng)皿中；在37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)后，進(jìn)行時差轉(zhuǎn)皿、使用梯度血清培養(yǎng)基聯(lián)合 純化，得胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述步驟c的純化方法為①時差轉(zhuǎn)皿操作在37°C，5% CO2孵箱中孵育兩小時后，進(jìn)行轉(zhuǎn)皿操作；所謂的 “時差轉(zhuǎn)皿”，就是利用成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞貼壁較快，通常在孵育兩小時后即可貼壁伸 展，而上皮細(xì)胞則需要24小時左右；通過此差速貼壁法，可有效去除間質(zhì)細(xì)胞污染。②培養(yǎng)的不同階段選用不同血清濃度培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)0-48小時期間，選用含 20%胎牛血清FBS的高血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時的過程中，細(xì)胞團(tuán)完全貼 壁后，即更換為含2%胎牛血清FBS的低血清培養(yǎng)基。在低血清培養(yǎng)基中，間質(zhì)細(xì)胞因營養(yǎng) 不足而死亡，上皮細(xì)胞卻由于其中添加了 EGF (上皮生長因子)，胰島素，霍亂毒素等生長因 子，生長狀態(tài)保持良好。其中，所述高血清培養(yǎng)基配方為=IMEMZO培養(yǎng)基中加入20%胎牛血清FBS，5 μ g/ ml胰島素，100ng/ml表皮生長因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍亂毒素，100ng/ml轉(zhuǎn)鐵 蛋白，500U/ml青霉素，5μ g/ml鏈霉素；所述的低血清培養(yǎng)基配方為=IMEMZO培養(yǎng)基中加入 2%胎牛血清FBS，5 μ g/ml胰島素，100ng/ml表皮生長因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍 亂毒素，lOOng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，200U/ml青霉素，2 μ g/ml鏈霉素。對獲取細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)(光鏡下形態(tài)和亞顯微結(jié)構(gòu))以及細(xì)胞標(biāo)志物CK19的鑒 定；對鑒定后的細(xì)胞進(jìn)行生長特性的觀察并對實(shí)驗(yàn)研究提供有效的操作建議。形態(tài)學(xué)鑒定 分別在光鏡(OLYMPUS C-5060)下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在透射電鏡(HITACHI H-600IV)下檢 測其亞顯微水平結(jié)構(gòu)。細(xì)胞標(biāo)志物鑒定選取的角蛋白19 (CK19)，分別進(jìn)行了 RNA水平和蛋 白水平的檢測。CK 19為包括胰腺導(dǎo)管在內(nèi)的簡單上皮細(xì)胞骨架上的特異性蛋白。培養(yǎng)細(xì) 胞的CK-19mRNA水平通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)現(xiàn)，其蛋白水平檢測通過免疫 組化實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果
1、動物來源為常見的實(shí)驗(yàn)動物大鼠，避免了以往使用牛、豬等大型動物成本較高、 來源較少且難以進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)等缺點(diǎn)。2、在實(shí)驗(yàn)材料的選取上僅僅納入了主胰管，本發(fā)明提供的新的解剖方式，可利用 主胰管周圍器官的張力使其能從整體胰腺組織中得到快速有效的剝離。3、本發(fā)明使用了混合消化酶分步消化法。混合消化酶可提前制備，簡化了現(xiàn)有技 術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟，并且減少了實(shí)驗(yàn)過程中頻繁換酶所引起的污染機(jī)會。分步消化的方式可得 到大小適宜的細(xì)胞團(tuán)，所得培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)量可比整體消化法提高了 60%以上。4、聯(lián)合使用取材、時差轉(zhuǎn)皿、使用梯度血清培養(yǎng)基三種方式去除其余胰腺細(xì)胞污 染，純化上皮細(xì)胞。該發(fā)明的上皮細(xì)胞純化率可達(dá)95%。5、本發(fā)明還觀察和描述了大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的生長特性，對后來研究者的實(shí) 驗(yàn)設(shè)計提供一些有效的建議。


圖1解剖方式及分離出的主胰管圖2光鏡下顯示培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)200 X圖3透射電鏡下培養(yǎng)細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)10000X (箭頭指示微絨毛，*指示細(xì)胞間 緊密連接)圖4透射電鏡下培養(yǎng)細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)25000 X (箭頭指示橋粒結(jié)構(gòu))圖 5CK-19 的 RT-PCR 電泳6免疫組化分析中培養(yǎng)細(xì)胞呈陽性表達(dá)200X (CK-19為細(xì)胞膜著色，胞核用蘇 木素復(fù)染)圖7種皿時PDEC細(xì)胞團(tuán)200 X (箭頭所指為上皮細(xì)胞團(tuán))圖8培養(yǎng)48小時細(xì)胞100X圖9培養(yǎng)72小時細(xì)胞40 X圖10培養(yǎng)4-5天細(xì)胞40 X圖11培養(yǎng)第8天細(xì)胞200 X (箭頭指示空泡)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法1主要實(shí)驗(yàn)材料1)高血清培養(yǎng)基IMEMZO培養(yǎng)基加入20 %胎牛血清FBS，5 μ g/ml胰島素， 100ng/ml表皮生長因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍亂毒素，100ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，500U/ ml青霉素，5 μ g/ml鏈霉素。2)低血清培養(yǎng)基=IMEMZO培養(yǎng)基中加入2%胎牛血清FBS，200U/ml青霉素，2 μ g/ ml鏈霉素。其余添加物同上。3)混合消化酶0. V型膠原酶，0. 透明質(zhì)酸酶，0. 大豆胰酶抑制劑。所 有酶都來源于sigma公司，美國密蘇里州的圣路易斯市；4)緩沖鹽溶液(HBSS)加入500U/ml青霉素，5 μ g/ml鏈霉素的Hank，s溶液。所述的緩沖鹽溶液(HBSS)可以自配，也可直接購買市售產(chǎn)品。
5)實(shí)驗(yàn)動物健康Wistar大鼠4只，雌雄不限，體重120 150g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動物中心提供。試驗(yàn)操作遵照國家動物保護(hù)法執(zhí)行。2操作步驟1)從健康大鼠胰腺組織中，使用適當(dāng)?shù)慕馄史绞将@取主胰管取健康Wistar大鼠，10%水合氯醛麻醉(5mg/g)。碘酊和酒精消毒，無菌操作開 腹。兩把鑷子同時提起胃幽門部和十二指腸近端，完全暴露胰腺頭部。在燈光照射下可見 一寬度約為Imm左右黃色透明管狀體呈30-45度角橫跨胰腺頭部，此即為主胰管。小心去 除主胰管周圍胰腺組織，應(yīng)盡量剔除干凈。游離出主胰管后，將其剪下置于提前準(zhǔn)備好的 5-6ml冰HBSS溶液中。(見圖1)2)使用混合消化酶分步消化法對組織碎塊進(jìn)行消化分離操作者更換無菌衣并消毒，以下步驟需在無菌條件下完成。A.將獲取的胰管置于無菌的生物安全柜中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，冰HBSS沖洗三次以 上。B.眼科剪將胰管剪為l_2mm碎塊，置于15ml離心管中。C.加入2ml混合消化酶，于37°C水浴箱消化12分鐘，每隔3_4分鐘振蕩搖晃；混 合消化酶的體積為胰管碎塊體積的4-5倍。D.加入6_8ml HBSS，待肉眼可見的胰管碎塊沉下后，棄去上清液。E.另加入Iml混合消化酶繼續(xù)于37°C水浴箱中消化5分鐘。F. 0. 5ml胎牛血清FBS終止消化，待其自然沉淀后，棄上清。G.加入Iml混合消化酶，37°C消化5分鐘，期間吹打并搖動。H. 0. 5ml胎牛血清FBS終止消化并自然沉淀，收集液體至一無菌離心管中。I.重復(fù)步驟8三至四次，直至無肉眼可見胰管碎塊。J.將收集到的液體1600rmp離心10分鐘，棄上清。K. HBSS重懸細(xì)胞，1200rmp再次離心5分鐘，棄上清。L.加入4ml高血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞團(tuán)，吹打均勻后種于60mm2無菌培養(yǎng)皿中。M. 37°C,5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。3)對所獲取細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)以及純化將消化分離得到細(xì)胞在60mm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)兩小時后，輕輕搖晃轉(zhuǎn)于4ml高血清 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48-72小時，待細(xì)胞團(tuán)完全貼壁后即更換于4ml低血清培養(yǎng)基中。4)對培養(yǎng)增殖細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞標(biāo)志物的鑒定待培養(yǎng)細(xì)胞處于生長旺盛期時，從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞標(biāo)志物CK-19兩方面對其進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定①在OLYMPUS C-5060光學(xué)顯微鏡下觀察所得細(xì)胞的外形特點(diǎn)。②透 射電鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)細(xì)胞標(biāo)志物CK-19的檢測CK 19為包括胰腺導(dǎo)管在內(nèi)的簡單上皮細(xì)胞骨架上的 特異性蛋白。①用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測所得細(xì)胞中CK 19mRNA的表達(dá)。 ②用免疫組化SP三步法檢測所獲細(xì)胞中CK19蛋白的表達(dá)。5)對鑒定后的細(xì)胞進(jìn)行生長特性的觀察每日在OLYMPUS C-5060光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)及形態(tài)變化。
7
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)通過上述方法，我們獲得了生長狀態(tài)良好且數(shù)量充足的細(xì)胞。該原代培養(yǎng)系統(tǒng)
已重復(fù)三次以上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)率高。(2)形態(tài)學(xué)水平鑒定結(jié)果光鏡下觀察，培養(yǎng)細(xì)胞呈多角形，鋪路石樣緊密排列。 具有典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)(圖2)。透射電鏡亞顯微結(jié)構(gòu)顯示，該細(xì)胞具有明顯的微 絨毛、橋粒樣結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間的緊密連接復(fù)合物。此為上皮細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)典型特點(diǎn)(圖3、 圖4)。(3) CK-19鑒定結(jié)果CK-19mRNA表達(dá)結(jié)果CK19的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為248bp的單一 條帶(Maker為DL2000)。該結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物CK19高度特異地在培養(yǎng)細(xì)胞上表達(dá)(圖 5)。CK-19蛋白表達(dá)結(jié)果所獲細(xì)胞在免疫組化檢測中95%以上呈陽性表達(dá)。這表明我們 所獲的細(xì)胞能特異性的表達(dá)CK-19蛋白，且所獲細(xì)胞具有較高的純度(圖6)。由圖6可以 看出，通過三次以上的重復(fù)試驗(yàn)，CK-19陽性染色率可高達(dá)95%。(4)大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞生長特性觀察將酶消化分離所得的細(xì)胞種于培養(yǎng)皿中后，可觀察到大部分細(xì)胞小而圓，且 5-10個聚集成團(tuán)，此即為所需的導(dǎo)管上皮細(xì)胞團(tuán)。同時，這些細(xì)胞團(tuán)中通常會夾雜一些間質(zhì) 細(xì)胞，紅細(xì)胞，及腺泡細(xì)胞團(tuán)(圖7)。孵育24小時后，大部分上皮細(xì)胞團(tuán)可貼壁。培養(yǎng)第二 天，全部PDEC細(xì)胞團(tuán)貼壁，細(xì)胞從貼壁的集落中心向四周擴(kuò)展。與細(xì)胞團(tuán)相比，單個的細(xì)胞 反而不容易貼壁擴(kuò)增的。這些擴(kuò)增出的細(xì)胞為多角形，呈鋪路石樣排列為單層細(xì)胞(圖8)。 培養(yǎng)第三天，細(xì)胞繁殖速度加快，生長旺盛。此時細(xì)胞集落蔓延至第二天的5倍大小，細(xì)胞 幾乎覆蓋了培養(yǎng)皿的50% (圖9)。在隨后的1-2天中，細(xì)胞繼續(xù)快速生長，細(xì)胞集落匯合， 整個培養(yǎng)皿的80%被生長的上皮細(xì)胞所占據(jù)(圖10)。至第6-7天，細(xì)胞生活力降低，雖仍 有增長，但貼壁的細(xì)胞團(tuán)已開始脫落。至培養(yǎng)第八天，細(xì)胞團(tuán)拉網(wǎng)現(xiàn)象明顯，大部分細(xì)胞出 現(xiàn)空泡(圖11)。培養(yǎng)第十二天，大部分細(xì)胞死亡；14-15天，所有細(xì)胞死亡。采用本發(fā)明方法與整體消化法(在選擇的消化酶相同的情況下，不采用分步消化 法)進(jìn)行比較，所得培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)量提高了 60%以上。實(shí)施例2本發(fā)明大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法中混合消化酶的濃度選擇 試驗(yàn)按實(shí)施例1的方法進(jìn)行操作，三種酶每種濃度一致，以0.05%，0. 1%，0. 2%， 0. 5%共四個實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對比。試驗(yàn)結(jié)果0. 05%組因濃度低，消化次數(shù)多，時間長，細(xì)胞未能充分從組織塊中游 離出來。0.5%在消化過程中就出現(xiàn)明顯的消化過度，細(xì)胞碎片多，出現(xiàn)膠狀物纏繞在一起。 0. 1%和0. 2%組消化過程差不多。但從最后產(chǎn)量上看，0. 組多于0. 2%組多于0. 05%組 多于0.5%組。所以酶濃度可在0. 至0.2%之間，其中以0. 最優(yōu)。綜上所述，本發(fā)明大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法采用實(shí)驗(yàn)動物大鼠，成本 低、來源廣；在實(shí)驗(yàn)材料的選取上僅納入了主胰管，利用主胰管周圍器官的張力使其能從整 體胰腺組織中得到快速有效的剝離。使用了混合消化酶分步消化法；混合消化酶可提前制 備，簡化了現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟，并且減少了實(shí)驗(yàn)過程中頻繁換酶所引起的污染機(jī)會；分步 消化的方式可得到大小適宜的細(xì)胞團(tuán)，所得培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)量可比整體消化法提高了 60%以 上。再聯(lián)合使用取材、時差轉(zhuǎn)皿、使用梯度血清培養(yǎng)基三種方式去除其余胰腺細(xì)胞污染，純化上皮細(xì)胞；本發(fā)明的上皮細(xì)胞純化率可達(dá)95 %以上。
權(quán)利要求
一種大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，它包括以下工藝步驟a、從健康大鼠胰腺組織中分離主胰管；b、使用混合消化酶分步消化法對胰管組織碎塊進(jìn)行消化分離，獲取細(xì)胞團(tuán)；所述的分步消化法為①取清洗后的胰管剪為碎塊，加入胰管碎塊4 5倍體積的混合消化酶消化10 15分鐘，加入HBSS溶液吹打、清洗，自然沉淀，棄去上清液；加入剩余胰管碎塊2 2.5倍體積的混合消化酶消化5分鐘，胎牛血清FBS終止消化，自然沉淀后棄去上清液；②在①步驟的剩余胰管碎塊中加入2 4倍體積的混合消化酶，消化5分鐘，胎牛血清FBS終止消化，自然沉淀，收集消化液；重復(fù)前述步驟，繼續(xù)消化剩余胰管碎塊，直至無肉眼可見胰管碎塊，合并收集的消化液放至離心管中，離心，棄上清，即得細(xì)胞團(tuán)；所述的混合消化酶溶液中含有0.1 0.2％w/wV型膠原酶、0.1 0.2％w/w透明質(zhì)酸酶、0.1 0.2％w/w大豆胰酶抑制劑；所述的消化溫度為37℃；c、將步驟b得到的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行純化培養(yǎng)，即得胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的混合消化酶溶液中含有 0. 1 % w/wV型膠原酶，0. 1 % w/w透明質(zhì)酸酶，0. 1 % w/w大豆胰酶抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于b步驟所述的離心速度為 1200rmp-1600rmp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于b步驟所述消化過程中pH值為 8. 0-8. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述HBSS溶液為1000ml三蒸水中 加入7. 6g氯化鈉、0. 25g氯化鎂、1. 8g葡萄糖和2. 24g HEPES配制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的HBSS溶液中加入500U/ml青 霉素和5μβ/πι1鏈霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟c的純化培養(yǎng)方法為 在沉淀的細(xì)胞團(tuán)中加入高血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞團(tuán)，種于無菌培養(yǎng)皿中；在37°C，5% 0)2孵 箱中培養(yǎng)后2小時后，進(jìn)行時差轉(zhuǎn)皿、使用梯度血清培養(yǎng)基聯(lián)合純化，得純化率為95%以上 的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟c的純化、培養(yǎng)方法為①時差轉(zhuǎn)皿操作在37°C，5%CO2孵箱中孵育兩小時后，進(jìn)行轉(zhuǎn)皿操作；②培養(yǎng)的不同階段選用不同血清濃度培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)0-48小時期間，選用含有 20%胎牛血清FBS的高血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時的過程中，細(xì)胞團(tuán)完全貼 壁后，即更換為含2%胎牛血清FBS的低血清培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述高血清培養(yǎng)基配方為=IMEMZO 培養(yǎng)基中加入20%胎牛血清FBS，5 μ g/ml胰島素，100ng/ml表皮生長因子，4 μ g/ml地塞 米松，100ng/ml霍亂毒素，100ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，500U/ml青霉素，5 μ g/ml鏈霉素；所述的低 血清培養(yǎng)基配方為IMEMZ0培養(yǎng)基中加入2%胎牛血清FBS，5y g/ml胰島素，100ng/ml表 皮生長因子，4 μ g/ml地塞米松，100ng/ml霍亂毒素，100ng/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，200U/ml青霉素， 2 μ g/ml鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法；它包括以下工藝步驟a、從健康大鼠胰腺組織中分離主胰管；b、使用混合消化酶分步消化法對胰管組織碎塊進(jìn)行消化分離，獲取細(xì)胞團(tuán)；c、細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)及純化時差轉(zhuǎn)皿、使用梯度血清培養(yǎng)基聯(lián)合純化，得胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。本發(fā)明方法原料來源于常見的實(shí)驗(yàn)動物大鼠，利用主胰管周圍器官的張力使其能從整體胰腺組織中得到快速有效的剝離。分步消化的方式可得到大小適宜的細(xì)胞團(tuán)，所得培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)量可比整體消化法提高了60％以上。聯(lián)合使用取材、時差轉(zhuǎn)皿、使用梯度血清培養(yǎng)基三種方式去除其余胰腺細(xì)胞污染，純化上皮細(xì)胞；本發(fā)明的上皮細(xì)胞純化率可達(dá)95％。
文檔編號C12N5/071GK101955909SQ201010233969
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者周總光, 李園, 鄭雪蓮, 陳珂玲 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院