專利名稱：一種固定化過氧化氫酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固定化過氧化氫酶的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用負(fù)載有金屬離子 的膠原纖維為載體的固定化過氧化氫酶的制備方法。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶(Catalase，簡稱CAT，EC 1. 11. 1. 6)是一種高效催化分解過氧化氫的 酶，現(xiàn)存在于大多數(shù)動物、植物和微生物體內(nèi)，并在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品與乳制品業(yè)，紙漿和造 紙業(yè)，紡織印染工業(yè)、廢水處理、牛奶保鮮以及臨床分析等方面有著廣泛的應(yīng)用(張坤生， 田薈琳.過氧化氫酶的功能及研究.食品科技.2007，1 :8)。但是，由于過氧化氫酶對外界 環(huán)境(如溫度，PH等)十分敏感，在自由狀態(tài)下該酶的穩(wěn)定性差、易失活、不能重復(fù)使用，并 且反應(yīng)后產(chǎn)物的分離、純化以及酶的回收困難，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高，限制了其在工業(yè)上 的實際應(yīng)用。為解決上述問題，固定化酶技術(shù)應(yīng)運而生。酶經(jīng)固定化后就可賦予其具有可回 收、產(chǎn)物容易提純、穩(wěn)定性高、有利于實現(xiàn)連續(xù)反應(yīng)等優(yōu)點，并且可以增加產(chǎn)物的收率，提 高產(chǎn)物的質(zhì)量，使酶的使用效率提高，成本降低(徐鳳彩.酶工程.北京中國農(nóng)業(yè)出版 社.2001，15)。但在固定化酶技術(shù)中，載體的選擇對固定化酶的活性及使用特性有著至關(guān)重 要的作用。為了得到具有良好催化性能，載量高，成本低的固定化過氧化氫酶，現(xiàn)有技 術(shù)利用了價格低廉，易得的天然高分子如活性炭，硅藻土，明礬，殼聚糖，凝膠等作為固 定化載體° 其中殼聚糖(Cetinus AS, Oztop ΗΝ. Immobilization of catalase into chemically crosslinked chitosan beads. Enzym Microb Technol 2003 ;32 :889_94),凝 膠(Jurgen-Lohmann DL, Legge RL. Immobilization of bovine catalase in sol-gels. Enzyme MicrobTechnol 2006 ；39 626-633)作為固定化載體的研究比較廣泛。然而使用這 些天然高分子作為固定過氧化氫酶載體時，由于它們與酶的相容性及親和性有限，得到的 固定化酶中酶的固載量均低于20mg/g，加之過氧化氫酶本身具有很高的活性，一般介于幾 千到幾萬個活力單位之間，經(jīng)現(xiàn)有的天然高分子載體固定后，一般都只能保持20%以下的 原有活力，且絕大部分低于10%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用新的載體來制備固定化過氧化 氫酶的方法，該方法可使制得的固定化過氧化氫酶極大的保持原有酶的活力，同時還具有 較高的酶固載量。本發(fā)明提供的用新的載體來制備固定化過氧化氫酶的方法，該方法的工藝步驟和 條件如下1)先將100份皮膠原纖維室溫下浸泡于pH為1. 5-2. 5的去離子水中l(wèi)_4h，然后 加入15-35份金屬鹽，并置于20-40°C水浴中攪拌反應(yīng)4_7h ；
2)在反應(yīng)結(jié)束后的2h內(nèi)，將反應(yīng)體系pH調(diào)節(jié)到4. 0-4. 2，并在40_60°C下繼續(xù)反 應(yīng)5-7h，然后將載體過濾，并用去離子水洗去載體表面的雜質(zhì)后，浸沒于去離子水中，再加 入10-20份戊二醛，并在15-35°C水浴中攪拌反應(yīng)l_3h，過濾并用去離子水洗去載體上殘留 的戊二醛，即得負(fù)載金屬離子的膠原纖維載體；3)先將負(fù)載金屬離子的膠原纖維載體浸沒于去離子水中，然后加入過氧化氫酶 5-15份，于15-35°C水浴中攪拌反應(yīng)l_4h，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的過氧化氫 酶，即得以負(fù)載金屬離子的膠原纖維為載體的固定化過氧化氫酶。以上各物料的份數(shù)均為重量份。以上方法中所用皮膠原纖維的含水率< 12%。以上方法中所用金屬鹽優(yōu)選為硫酸鐵，硫酸鋯和硫酸鋁中的至少一種。以上方法中用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH的溶液優(yōu)選為硫酸溶液、甲酸溶液或碳酸氫鈉 溶液。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、由于本發(fā)明采用的皮膠原纖維是一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其具有的良好生物相容性， 親疏水性，對酶的親和性更是其它載體無法比擬的，同時還因膠原分子肽鏈上含有大量的 功能基團(tuán)如-C00H，-OH, -NH2等，它們可以與金屬離子，醛等進(jìn)一步發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。正是膠 原纖維的這些獨特的化學(xué)性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，使得其非常適合用作固定化酶的載體，并使制 備得到的固定化過氧化氫酶中酶的載量至少為20mg/g，并可保持原有自由酶30%以上的 活力。2、由于本發(fā)明采用的皮膠原纖維上負(fù)載有金屬離子，因而使經(jīng)本發(fā)明制備的固定 化過氧化氫酶不僅具有良好的熱穩(wěn)定性，貯存穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，且其對環(huán)境溫度及PH 的敏感性也大大降低。3、由于本發(fā)明采用的皮膠原纖維不僅可通過負(fù)載金屬離子制備成固定化酶的載 體，而且可經(jīng)戊二醛交聯(lián)預(yù)處理后用于制備酶載量和活力均高的固定過氧化氫酶，因而不 僅為固定化過氧化氫酶尋找到了一種新的性質(zhì)優(yōu)良的載體，同時也為皮膠原纖維的高值轉(zhuǎn) 化開辟了一條新的途徑。4、本發(fā)明采用的皮膠原纖維是以家畜動物皮為原料制備的一類天然高分子，因而 其不僅來源廣泛，而且價格低廉。5、本發(fā)明方法工藝簡單，易于實施，便于推廣。


圖1為本發(fā)明制備的固定化過氧化氫酶與自由酶的相對活力與熱貯存溫度變化 關(guān)系對比曲線，其中_ 代表自由酶，“·_代表固定化酶；圖2為本發(fā)明制備的固定化過氧化氫酶與自由酶的相對活力與貯存時間變化關(guān) 系對比曲線，其中-代表自由酶-代表固定化酶濕基貯存_·_代表固定化酶干 基貯藏；圖3為本發(fā)明制備的固定化過氧化氫酶的相對活力與重復(fù)使用次數(shù)變化關(guān)系曲 線.
一入 ，圖4為本發(fā)明制備的固定化過氧化氫酶與自由酶的相對活力與環(huán)境溫度變化關(guān)系對比曲線，其中- _代表自由酶，_ · _代表固定化酶；圖5為本發(fā)明制備的固定化過氧化氫酶與自由酶的相對活力與環(huán)境pH變化關(guān)系 對比曲線，其中- _代表自由酶，_ · _代表固定化酶。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于 對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員 可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。另外，值得說明的是，以下各實施例中物料的份數(shù)均為重量份。實施例1將含水量彡12%的皮膠原纖維100份于室溫下浸泡在pH為1. 5的去離子水中l(wèi)h， 然后加入35份硫酸鋁，于20°C水浴中攪拌反應(yīng)4h ；在2h內(nèi)用碳酸氫鈉溶液將反應(yīng)體系pH 調(diào)節(jié)到4. 0，并在40°C下繼續(xù)反應(yīng)5h，過濾載體，用去離子水洗去載體表面的雜質(zhì)后浸沒于 去離子水中，再加入20份戊二醛，于15°C水浴中攪拌反應(yīng)lh，過濾并用去離子水洗去載體 上殘留的戊二醛；再將載體浸沒于去離子水中，加入過氧化氫酶6份，于15°C水浴中攪拌反 應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的過氧化氫酶后，即得到負(fù)載金屬離 子鋁的膠原纖維為載體的固定化過氧化氫酶。實施例2將含水量彡12%的皮膠原纖維100份于室溫下浸泡在pH為1. 6的去離子水中2h， 加入25份硫酸鐵，在30°C水浴下攪拌反應(yīng)5h，再用碳酸氫鈉溶液在2h內(nèi)將pH調(diào)節(jié)到4. 1， 在45°C下繼續(xù)反應(yīng)6h，然后將載體過濾，用去離子水洗去載體表面的雜質(zhì)，再將洗凈的載 體浸沒于去離子水中，加入15份戊二醛，于25°C水浴下攪拌反應(yīng)1. 5h。過濾載體，用去離 子水洗去載體上殘留的戊二醛后，再將其浸沒于去離子水中，加入過氧化氫酶8份，于25°C 水浴下攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留的過氧化氫酶后， 得到以膠原纖維負(fù)載鐵為載體的固定化過氧化氫酶。實施例3將含水量≤12%的皮膠原纖維100份于室溫下浸泡在pH為1. 8的去離子水中3h， 加入15份硫酸鋯，在25°C水浴下攪拌反應(yīng)6h，再用碳酸氫鈉溶液在2h內(nèi)將pH調(diào)節(jié)到4. 2， 在45°C下繼續(xù)反應(yīng)5h，然后將載體過濾，用去離子水洗去載體表面的雜質(zhì)，再將洗凈的載 體浸沒于去離子水中，加入10份戊二醛，于20°C水浴下攪拌反應(yīng)2h。過濾載體，用去離子 水洗去載體上殘留的戊二醛后，再將其浸沒于去離子水中，加入過氧化氫酶5份，于20°C水 浴下攪拌反應(yīng)2. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留的過氧化氫酶后， 得到以膠原纖維負(fù)載鋯為載體的固定化過氧化氫酶。實施例4將含水量≤12%的皮膠原纖維100份于室溫下浸泡在pH為2. 0的去離子水中 2. 5h，加入15份硫酸鋁，12份硫酸鐵，在40°C水浴下攪拌反應(yīng)4h，再用碳酸氫鈉溶液在2h 內(nèi)將PH調(diào)節(jié)到4. 0，在50°C下繼續(xù)反應(yīng)7h，然后將載體過濾，用去離子水洗去載體表面的 雜質(zhì)，再將洗凈的載體浸沒于去離子水中，加入13份戊二醛，于20°C水浴下攪拌反應(yīng)2. 5h。 過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留的戊二醛，再將其浸沒于去離子水中，加入過氧化氫酶10份，于30°C水浴下攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留 的過氧化氫酶后，得到以膠原纖維負(fù)載鋁和鐵為載體的固定化過氧化氫酶。實施例5將含水量彡12%的皮膠原纖維100份于室溫下浸泡在pH為2. 1的去離子水中4h， 加入8份硫酸鋁，15份硫酸鋯，在35°C水浴下攪拌反應(yīng)5h，再用碳酸氫鈉溶液在2h內(nèi)將pH 調(diào)節(jié)到4. 1，在55°C下繼續(xù)反應(yīng)6h，然后將載體過濾，用去離子水洗去載體表面的雜質(zhì)，再 將洗凈的載體浸沒于去離子水中，加入14份戊二醛，于30°C水浴下攪拌反應(yīng)3h。過濾載體， 用去離子水洗去載體上殘留的戊二醛，再將其浸沒于去離子水中，加入過氧化氫酶12份， 于35°C水浴下攪拌反應(yīng)3.5h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留的過氧 化氫酶后，得到以膠原纖維負(fù)載鋁和鋯為載體的固定化過氧化氫酶。實施例6將含水量彡12%的皮膠原纖維100份于室溫下浸泡在pH為2. 3的去離子水中 3. 5h，加入10份硫酸鐵，10份硫酸鋯，在30°C水浴下攪拌反應(yīng)6h，再用碳酸氫鈉溶液在2h 內(nèi)將PH調(diào)節(jié)到4. 2，在60°C下繼續(xù)反應(yīng)6h，然后將載體過濾，用去離子水洗去載體表面的 雜質(zhì)，再將洗凈的載體浸沒于去離子水中，加入16份戊二醛，在25°C水浴下攪拌反應(yīng)1. 5h。 過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留的戊二醛，再將其浸沒于去離子水中，加入過氧化氫 酶14份，于20°C水浴下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留 的過氧化氫酶后，得到以膠原纖維負(fù)載鐵和鋯為載體的固定化過氧化氫酶。實施例7將含水量彡12%的皮膠原纖維100份在室溫下浸泡在pH為2. 5的去離子水中 2. 5h，加入2份硫酸鋁，3份硫酸鐵，13份硫酸鋯，在25°C水浴下攪拌反應(yīng)7h，再用碳酸氫鈉 溶液在2h內(nèi)將pH調(diào)節(jié)到4. 0，在50°C下繼續(xù)反應(yīng)7h，然后將載體過濾，用去離子水洗去載 體表面的雜質(zhì)，再將洗凈的載體浸沒于去離子水中，加入18份戊二醛，在35°C水浴下攪拌 反應(yīng)2.5h。過濾載體，用去離子水洗去載體上殘留的戊二醛，再將其浸沒于去離子水中，加 入過氧化氫酶15份，于25°C水浴下攪拌反應(yīng)2. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾載體，用去離子水洗去 載體上殘留的過氧化氫酶后，得到以膠原纖維負(fù)載鐵、鋁和鋯為載體的固定化過氧化氫酶。為了考察制備的固定化過氧化氫酶的酶固載量及活力保持的情況，本發(fā)明隨即 選取以上實施例制備的固定化過氧化氫酶分別依據(jù)考馬斯亮藍(lán)法(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding. Anal Biochem 1976 ;72 :248·)、高猛 酸鉀滴定法(蔣傳蔡等.工具酶活力的測定.上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.2002,38)進(jìn)行 了酶固載量和活力保持的測定，測定結(jié)果見表1。表 1
(%)其次，本發(fā)明還考察了制備的固定化過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和重復(fù) 使用性以及環(huán)境溫度、PH對制備的固定化過氧化氫酶活力的影響程度，測試結(jié)果見圖1-5。在考察固定化過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性時，是將6份由實施例3制備的固定化過氧 化氫酶，置于PH為7. 0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液中，然后在不同溫度下(25-75°C )保存5h后， 測定固定化酶在不同溫度下的活力變化，并在同等條件下測定了自由酶的熱穩(wěn)定性作為對 照，如圖1所示。在考查的溫度范圍內(nèi)，固定化過氧化氫酶較自由酶表現(xiàn)出了更高的熱穩(wěn)定 性，固定化過氧化氫酶在75°C下保存5h后仍能保持50%以上的原有活力，而自由酶則完全 失活。由此可見，過氧化氫酶經(jīng)本發(fā)明固定化后，熱穩(wěn)定性大幅提高，從而可大大提高其在 工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。在考察固定化過氧化氫酶的貯存穩(wěn)定性時，是將2份由實施例4得到的固定化過 氧化氫酶，1份置于PH為7. 0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液中，1份置于空氣中，另取等量自由過 氧化氫酶溶于PH為7. 0檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中，3份樣品均在室溫下貯藏，每隔一天測 試其酶活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，自由酶貯存12天后，基本失活；而固定化過氧 化氫酶在緩沖液中貯存12天后，仍可保持50%的原有活力；空氣中貯存的固定化酶在此條 件下保存12天后，仍具有80%以上的原有活力，至其完全失活，可貯存高達(dá)70天。由此可 見，過氧化氫酶經(jīng)本發(fā)明固定化后，貯存穩(wěn)定性大大提高。干基貯藏效果最好且簡單易行， 還可節(jié)約了貯藏成本及能耗。在考察固定化過氧化氫酶的重復(fù)使用性時，是將1份由實施例7得到的固定化過 氧化氫酶，置于25°C水浴中，考查其在IOh內(nèi)，于不同時間間隔下催化分解過氧化氫分解后 的活力變化，結(jié)果如圖3所示。由圖可見，固定化過氧化氫酶經(jīng)過27次連續(xù)催化過氧化氫 分解反應(yīng)后，活力保持可在50%以上，前7次的反應(yīng)中無明顯的活力下降，至其完全失活可 連續(xù)反應(yīng)70次，顯示出了該固定化酶良好的重復(fù)使用性，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。在考察環(huán)境溫度對固定化過氧化氫酶活力的影響時，是將7份由實施例1制得的 固定化過氧化氫酶和自由酶，置于pH為7. 0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液中，然后在不同溫度下 (15-75°C )保存15min后，測定它們的活力，繼而得到了溫度對固定化過氧化氫酶和自由酶 活力的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可見，固定化過氧化氫酶在所考察的溫度范圍內(nèi)較自由酶 均表現(xiàn)出了更高的相對活力，當(dāng)溫度達(dá)到75°C時，固定化酶仍可保持原有活力的70%，而 自由酶由此可見，過氧化氫酶經(jīng)此法固定后對溫度的敏感性降低，并可在更廣泛的溫度范 圍內(nèi)發(fā)揮較高的催化活力。在考察環(huán)境pH對固定化過氧化氫酶活力的影響時，是將6份由實施例2得到的固定化過氧化氫酶和自由酶，在室溫下分別置于PH為3-8的檸檬酸磷酸鹽緩沖液中15min 后，測定其活力，繼而得到PH對固定化過氧化氫酶及自由酶活力的影響，結(jié)果見圖5。由圖5 可見，固定化過氧化氫酶在考查的PH范圍內(nèi)較自由酶均表現(xiàn)出了更高的相對活力。在酸性 條件下，固定化酶活力保持能力尤為突出。在PH為3時，固定化酶的相對活力仍高于70%。 由此可見，過氧化氫酶經(jīng)本發(fā)明固定后對PH的敏感性降低，可在更寬的pH范圍內(nèi)發(fā)揮較高 的催化活力。
權(quán)利要求
一種固定化過氧化氫酶的制備方法，該方法的工藝步驟和條件如下1)先將100份皮膠原纖維室溫下浸泡于pH為1.5 2.5的去離子水中1 4h，然后加入15 35份金屬鹽，并置于20 40℃水浴中攪拌反應(yīng)4 7h；2)在反應(yīng)結(jié)束后的2h內(nèi)，將反應(yīng)體系pH調(diào)節(jié)到4.0 4.2，并在40 60℃下繼續(xù)反應(yīng)5 7h，然后將載體過濾，并用去離子水洗去載體表面的雜質(zhì)后，浸沒于去離子水中，再加入10 20份戊二醛，并于15 35℃水浴中攪拌反應(yīng)1 3h，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的戊二醛，即得負(fù)載金屬離子的膠原纖維載體；3)將負(fù)載金屬離子的膠原纖維載體浸沒于去離子水中，加入過氧化氫酶5 15份，于15 35℃水浴中攪拌反應(yīng)1 4h，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的過氧化氫酶，即得以負(fù)載金屬離子的膠原纖維為載體的固定化過氧化氫酶，以上各物料的份數(shù)均為重量份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化過氧化氫酶的制備方法，該方法中所用皮膠原纖維的 含水率< 12%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化過氧化氫酶的制備方法，該方法中所用金屬鹽為 硫酸鐵，硫酸鋯和硫酸鋁中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明公開的固定化過氧化氫酶的制備方法，是先將皮膠原纖維室溫下于pH為1.5-2.5的去離子水中浸泡后加入金屬鹽進(jìn)行攪拌反應(yīng)4-7h，然后將反應(yīng)體系pH調(diào)節(jié)到4.0-4.2繼續(xù)反應(yīng)5-7h，再將載體過濾，放入去離子水中與戊二醛反應(yīng)1-3h，即得負(fù)載金屬離子的膠原纖維載體；將負(fù)載金屬離子的膠原纖維載體浸沒于去離子水中，與過氧化氫酶攪拌反應(yīng)1-4h，過濾并洗去載體上殘留的過氧化氫酶即可。用本發(fā)明方法制備得到的固定化過氧化氫酶中酶的載量至少為20mg/g，可保持原有自由酶30％以上的活力，且具有良好的熱穩(wěn)定性，貯存穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。本發(fā)明方法工藝簡單，易于實施，便于推廣。
文檔編號C12N11/02GK101892214SQ201010236258
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者唐曉蓉, 宋娜, 廖學(xué)品, 曹明蓉, 石碧 申請人:四川大學(xué)