專利名稱：受稻瘟菌誘導的啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中水稻受稻瘟菌誘導的啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻 最主要的病害之一，嚴重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。到目前為止，稻瘟菌病害的防治還沒 有得到有效的解決，植物抗病基因工程的發(fā)展為水稻稻瘟菌病害的防治提供了一條新的途 徑，從而引起了人們廣泛的關(guān)注。植物在與病害長期的互作進化過程中，逐漸獲得了一系列抵御逆境、保護自身免 受其害的抗性防御機制。植物抗病性可以概括為植物的抗病基因識別病源物信號一信號 傳遞一防衛(wèi)基因表達一植保素合成的過程。植物與病原菌相互作用的結(jié)果是誘導植物中與 抗病相關(guān)防衛(wèi)基因的表達，繼而調(diào)控下游代謝途徑合成植保素等次生代謝產(chǎn)物，從而發(fā)揮 抵抗病原物侵害的作用。植物防衛(wèi)基因主要包括編碼苯丙氨酸解氨酶(Ehenlalanine ammonialyase,PAL) 和查爾酮合酶(Qialcone synthase, CHS)等基因，它們是植保素(phytoale_xins，PA)、木 質(zhì)素(Iignin)等抗菌活性物質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)
揮著重要作用。PAL基因是植物防御反應(yīng)中早期被誘導表達的關(guān)鍵的防衛(wèi)基因之一，其對病原 菌及病原菌誘導物的應(yīng)答調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，即病原菌及其誘導物的侵染信號 被PAL基因啟動子上的誘導應(yīng)答元件(inducible cis-element)所識別，調(diào)控植物的抗 病防衛(wèi)反應(yīng)活性。應(yīng)答調(diào)控元件指的是在同一條核苷酸鏈上調(diào)控基因表達活性的DNA 序列。Minami 及 Zhu 等(Minami E，Ozeki Y，Matsuoka M，et al. Structure and some characterization of the gene for phenylalanine ammonia-lyase from rice plants.， Eur. J. Biochem. (1989) 185 :19_25 ；Minami E，Tanaka Y，et al. Nucleotide sequence of the gene for phenylalanine ammonia-lyase of rice and its deduced amino acid sequen ce.Biochim. Biophys. Acta. (1993) 1171 :321_322 ；Zhu Q，Dabi T，Beeche A，et al.Cloning and properties of a rice gene encoding phenylalanine ammonia-lyase. Plant Mol.Biol. (1995)29:535-550)分別從水稻中克隆到三個PAL基因，分別是GP_1、 GP-28和ZB8PAL，其中ZB8PAL基因受傷害、病毒以及真菌誘導物的誘導。1998年Kervinen 等(Kervinen PS,Teeri TH. Differential expression of phenylalanine ammonia-lyase genes in barley induced by fungal infection or elicitors. New Phytol. (1998) 139: 293-300)從大麥的根中分離到四個PAL基因，它們受HgCl2、病原誘導物的誘導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明所提供的DNA分子，來源于水稻(Oryza satvia L.)，是如下1)_3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列選自序列表中序列1，且具有序列表中序列1自5’末端第868位 到1101位的核苷酸序列，同時其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第 1位到868位中的任一位置；2)在嚴格條件下與1)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述DNA分子為如下1) -9)中任一所述的DNA分子1)其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第868位 中的任一位置；2)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第868位中 的任一位置；3)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第693位到第868位中 的任一位置；4)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的 任一位置；5)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第693位中 的任一位置；6)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第693位中 的任一位置；7)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第532位中的 任一位置；8)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第532位中 的任一位置；9)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的
任一位置。所述DNA分子為如下1) -5)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第1位到第1101位的序列；2)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第3 11位到第1101位的序列；3)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第532位到第1101位的序列；4)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第693位到第1101位的序列；5)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第868位到第1101位的序列。所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列2所示。含有所述DNA分子的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā) 明所保護的內(nèi)容。本發(fā)明的又一個目的是提供所述DNA分子在啟動基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)錄受 稻瘟病菌誘導中的應(yīng)用，最終達到培育抗稻瘟病植物的目的。本發(fā)明有助于將水稻中受稻瘟菌誘導的啟動子應(yīng)用于增強植物抗病防御反應(yīng)速率的分子育種中，具有重要的實踐意義。


圖1為稻瘟病菌粗提物誘導處理后水稻愈傷組織中rPAL_P5基因的轉(zhuǎn)錄活性檢 測。其中，A為對照水以及稻瘟病菌粗提物誘導處理后水稻愈傷組織中rPAL-P5基因的 mRNA沉積；B為對照水以及稻瘟病菌粗提物誘導處理后水稻愈傷組織中rPAL-P5基因的 Northern blot 分析。圖2為rPAL_P5基因轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動子序列(_45 +145)及OsACRE序列 (-89 -45)。圖 3 為質(zhì)粒 pCAMBIAl38IT-DNA 結(jié)構(gòu)。圖4為pR-1 X OsACRE和pR_3 X OsACRE報告質(zhì)粒構(gòu)建流程。圖5為pE-OsACBFl效應(yīng)質(zhì)粒的構(gòu)建流程。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、rPAL_P5基因啟動子序列的獲得及其轉(zhuǎn)錄活性的檢測一、rPAL-P5基因啟動子序列的獲得 根據(jù)已發(fā)表的水稻ZB8PAL基因序列設(shè)計一對引物，rPAL-P5-promoterP 1 5' -TCGCGCCTACTGACCTACGTAT-3‘，此引物序列位于rPAL_P5基因啟動子區(qū)域，距離翻譯 起始位點 ATG 上游約 Ikb ；rPAL-P5-promoterP2 5' -ACCATGCGCTTCACCTCGTC-3‘，此引物 序列位于rPAL-P5基因外顯子1區(qū)域，與翻譯起始位點ATG相距330bp。以水稻品種愛知旭 (公眾可從北京大學獲得，記載過該材料的非專利文獻是Lin RM, Zhao WS, Meng XB, Wang M,Peng YL. Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC—domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea. Plant Science(2007) 172 :120-130) 的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增得到含有rPAL-P5基因啟動子序列，得到長度為 1.4kb的特異性片段并測序。PCR反應(yīng)體系如下
去離子水39 μ L
dNTP2μ L
正向引物1 μ L
反向引物1 μ L
模板1 μ L
10 X Taq酶反應(yīng)緩沖液5 μ L
Taq酶1 μ L
總體積50 μ L
PCR反應(yīng)程序如下
預變性 94 °C2分鐘
變性 94 °C60秒
退火60 °C延伸72 °C循環(huán)次數(shù)35次終末延伸72 °C
70秒 90秒
10分鐘二、稻瘟病菌誘導下rPAL_P5基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測以136bp特異的rPAL-P5基因的轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)DNA序列為探針(+1 +136 :5，_A AGAAGAGCCGCACCATCCAGTGCAGTAGTACACTAGCTCTTCTTCACAACAGCTAATCGAGTAGCTAGAACCATTAT ATACTCTTCTCTCGACGCTTTCTGTGCTAGGTTAACCGATCCATCTTCTGGTACTGAA-3，)，測定了愛知旭非 親和小種131稻瘟病菌(公眾可從北京大學獲得，記載過該材料的非專利文獻是Lin RM, Zhao WS, Meng XB, Wang M, Peng YL. Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea. Plant Science (2007) 172 =120-130)誘導粗提物處理不同時間的水稻愈傷組織中rPAL_P5基因的 轉(zhuǎn)錄水平。愛知旭非親和小種131稻瘟病菌誘導粗提物的制備方法如下稻瘟病菌接于固體燕麥培養(yǎng)基，28°C黑暗培養(yǎng)7-8天后用無菌水將表面的菌絲洗 下，重新接于固體燕麥培養(yǎng)基活化4-5天；用無菌水將表面菌絲洗下，蓋上兩層紗布，光照 下培養(yǎng)2-3天后用水將孢子洗下；鏡檢后將孢子濃度調(diào)節(jié)到1. OX 105Cfu/mL-l. OX IO6Cfu/ mL。將無菌水洗下的菌絲接于燕麥液體培養(yǎng)基，置于28°C、暗處振蕩(200rpm)培養(yǎng)4_5天； 10，OOOrpm離心5分鐘收獲菌絲，用蒸餾水洗3_4次后加入適量蒸餾水，并用玻璃研缽將菌 絲體研碎；于10，OOOrpm離心5分鐘后，收集上清并高壓滅菌，即得到稻瘟病菌誘導粗提物。愛知旭非親和小種131稻瘟病菌誘導粗提物處理水稻愈傷組織的方法如下水稻品種愛知旭成熟種子去皮，清水洗凈；用滅好菌的去離子水配制20%的次 氯酸鈉(NaClO)和70%酒精；在超凈臺中將洗好的種子至于三角瓶內(nèi)，用70%的酒精洗 2-3遍，時間控制在30秒內(nèi)；用20% NaClO洗1-2遍，放于搖床上搖20-25min，再利用 20% NaClO洗一次；用無菌水洗3-4遍，置于濾紙上陰干；將滅菌種子放于N6+2mg/L2，4-D 培養(yǎng)基上，避免胚部直接接觸培養(yǎng)基；黑暗培養(yǎng)3周，選擇色澤鮮黃的愈傷組織轉(zhuǎn)入新的 N6+2mg/L 2，4-D培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；將小塊的水稻愈傷組織(約Ig)浸泡在稀釋5倍的上 述誘導粗提物中，于25°C、IOOrpm黑暗處培養(yǎng)，并在不同時間取樣，液氮速凍后，于-70°C保 存；同時以水進行同樣處理的水稻愈傷作為對照。通過Northern blot分析，結(jié)果如圖1所示，在誘導物處理水稻愈傷組織1小時后 即可檢測到少量rPAL-P5基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，3小時后mRNA的沉積達到最高水平，約為水處理 對照組的20倍，到6小時已明顯降低，12小時幾乎恢復到原來正常的水平，而在水處理對照 組的水稻愈傷組織中幾乎檢測不到rPAL-P5基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此結(jié)果說明稻瘟菌誘導物能夠 激活rPAL-P5基因的轉(zhuǎn)錄活性，而且誘導轉(zhuǎn)錄活性的高峰期為誘導后約3小時。實施例2、受稻瘟菌誘導的啟動子的獲得及其功能驗證—、受稻瘟菌誘導的啟動子的獲得以實施例1中獲得的水稻品種愛知旭長度為1. 4kb的特異性的rPAL_P5基因啟動 子序列為模板進行PCR擴增，在rPAL-P5基因啟動子的不同位點設(shè)計引物，分別為-956 -935(rPP-a-BamHI) :5，-cgggatccTCGCGCCTACTGACCTACGTAT-3，，
-646 -627(rPP-b-BamHI) :5，-cgggatccCATTCTGAATAGGGCATGCA-3，，-425 -406(rPP-c-BamHI) :5，-cgggatccCACACCAACTTCCATCCATA-3，，-264 -245(rPP-d-BamHI) :5，-cgggatccAGACGCAGCAAGTCCGTCGC-3，，_45 _26 (rPP-e-BamHI) :5，-cgggatccACCCACCCGCCTATTTAAGC-3，(小寫字母為 BamHI酶切位點)和+126 +145(P-a-HindIII) :5，-aagcttGCACTCCATTTCAGTACCAG-3，(小寫字母為 HindIII酶切位點)為引物，進而PCR擴增得到了一系列長度不同的5’端完整及缺失啟動子片段以 引物-956 -935 (rPP-a)和 +126 +145 (Ρ-a)擴增得到了 rPPa(-956 +145)(該擴增 產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中序列1)；以引物-646 -627(rPP-b)和+126 +145 (P_a) 擴增得到了 rPPb(-646 +145)(該擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末 端第311到1101位)；以引物-425 -406 (rPP-c)和+126 +145 (P_a)擴增得到了 rPPc(-425 +145)(該擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第532到1101 位)；以引物-264 -245 (rPP-d)和 +126 +145 (Ρ-a)擴增得到了 rPPd(-264 +145) (該擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第693位到1101位)；和以引 物-45 -26 (rPP-e)和+126 +145 (Ρ-a)擴增得到了 rPPe (-45 +145)(該擴增產(chǎn)物的 核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第912位到1101位)。將rPPa rPPe 5個啟動 子基因片段分別連接于植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1381Xa(購自澳大利亞Cambia公司)的⑶S 基因上游的BamHI和HindIII酶切位點之間，構(gòu)建出一系列5’端缺失啟動子的⑶S表達 質(zhì)粒(rPP-GUS)含有rPPa的載體rPPa_GUS、含有rPPb的載體rPPb_GUS、含有rPPc的載 體rPPc-GUS、含有rPPd的載體rPPd-GUS、含有rPPe的載體rPPe_GUS。同時，在植物轉(zhuǎn)化 載體pCAMBIA1381Xa的⑶S基因上游的BamHI和HindIII酶切位點之間連入35S啟動子， 此 35S 啟動子是以 pCAMBIA1381Xa 質(zhì)粒為模板，以引物 35S-P1 :5，-gcggatccAACATGGTGGAG CACGACACTCTCG-3，和 35S-P2 :5，-ccaagcttAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT-3，為引物，擴增 得到pCAMBIA1381Xa載體上第9810-10593位的35S啟動子DNA序列，用限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI和HindIII酶切后連接于pCAMBIA1381Xa載體中，構(gòu)建出含有35S啟動子的⑶S表達 質(zhì)粒(35S-GUS)。測序結(jié)果表明，各嵌合基因的讀碼框都正確。使用基因槍法分別將上述5個rPP-GUS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，同時用35S-GUS 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織作為對照，然后將液體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織分別經(jīng)稻瘟病菌誘 導粗提物和無菌水處理(處理方法同實施例1)8小時(經(jīng)測定8小時PAL酶活達到最大) 后進行GUS熒光值測定，以它們受誘導物誘導后GUS活性與受水誘導后GUS活性的比值， 即E/W值，檢測稻瘟病菌對上述5個啟動子的誘導情況。實驗設(shè)3個克隆愈傷組織作為重 復。檢測結(jié)果如下E/W比值為轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織經(jīng)誘導物(E)或水(W)處理8小時后 ⑶S活性的比值。因為已知35S啟動子是一個組成型表達的強啟動子，因此35S-GUS質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織雖然在水或誘導物處理后都有較高的GUS活性，但是它們的比值(即 Ε/ff)卻接近于1，這與其組成型表達的特性是相符的，表明35S啟動子沒有受到稻瘟菌的 誘導，而缺乏⑶S基因啟動子的pCAMBIA1381Xa質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織在兩種處理下都 檢測不到⑶S活性；但是分別含有缺失啟動子rPPa(-956 +145)、rPPb (-646 +145)和 rPPc (-425 +145)的質(zhì)粒rPPa_GUS、rPPb-GUS和rPPc_GUS轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織，它們
8的E/W值為3，表明這3個啟動子受稻瘟菌誘導物處理后其活性約為水處理對照組的3倍， 即3個啟動子對稻瘟菌誘導具有應(yīng)答活性并可以提高下游基因的表達；而含有缺失啟動子 rPPd (-264 +145)的質(zhì)粒rPPd_GUS轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的E/W值為1. 6，較前3者的誘 導活性降低了約1/2 ；含有缺失啟動子rPPe (-45 +145)的質(zhì)粒rPPe_GUS轉(zhuǎn)化的水稻愈傷 組織的E/W值為1. 1，與35S-GUS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的E/W值接近，因此-45 +145 序列確定為能夠使rPAL-P5基因轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動子(mini-promoter)，其中包括TATAbox和 轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)(圖2)。以上結(jié)果說明在rPAL_P5啟動子-425 -45區(qū)域存在與稻瘟病菌誘導相關(guān)的順 式元件，通過與PLACE數(shù)據(jù)庫(www. dna. affrc. go. jp)進行比對，發(fā)現(xiàn)-89 -45區(qū)域里面 存在AC-rich順式元件區(qū)域(圖2中所示的-89 -45核苷酸序列)，即為稻瘟病菌誘導應(yīng) 答調(diào)控元件區(qū)域。將該誘導應(yīng)答調(diào)控元件命名為OsACRE(AC-rich element)。實施例3、誘導應(yīng)答調(diào)控元件OsACRE與反式作用因子OsACBFI的相互作用。一、反式作用因子OSACBFI的獲得以三個拷貝串聯(lián)重復的OsACRE作為誘餌序列，從稻瘟病菌誘導0. 5,1. 0、1. 5小時 的水稻愈傷組織mRNA混合制備的cDNA文庫中篩選出與OsACRE相互作用的反式作用因子， 命名為 0sACBFl(0ryza sativa AC-rich element binding factor 1)。通過體夕卜 EMSA 方 法證實誘導應(yīng)答調(diào)控元件OsACRE與反式作用因子OsACBFI可以結(jié)合；同時在酵母體內(nèi)表達 的蛋白OsACBFI與OsACRE特異性結(jié)合后可以激活下游報告基因(LacZ，相當于PAL基因的 替換)的轉(zhuǎn)錄活性。二、通過煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證誘導應(yīng)答調(diào)控元件OsACRE與反式作用因子 OsACBFI的相互作用為了在植物體內(nèi)證實誘導應(yīng)答調(diào)控元件OsACRE與反式作用因子OsACBFI的相互 作用，我們利用不同的報告質(zhì)粒(Importer，pR_l X OsACRE和pR_3 X OsACRE)和效應(yīng)質(zhì)粒 (Effector, pE-0sACBFl)對煙草葉片進行共轉(zhuǎn)化瞬時表達，測定⑶S報告基因的活性。l、pR_lX0sACRE和pR_3X0sACRE三重復串聯(lián)順式作用元件報告質(zhì)粒(Iteport er plasmid)的制備以 rPAL-P5 基因為模板，用如下一對引物，OsACRE-Pl :5，-ccaagcttACCAGACCATCA CAACCCCCCTCCGTCAT-3，(此引物序列位于rPAL_P5基因啟動子-89 -60，帶有HindIII酶 切位點)和 0sACRE-P2 :5，-ctactagtGCACTCCATTTCAGTACCAG-3，(此引物序列位于 rPAL_P5 基因的+126 +145，帶有SpeI酶切位點)，進行PCR擴增，得到rPAL_P5基因的1 X OsACRE 序列(圖2中的-89 +145位，即序列表中序列1的第868位到第1101位)。并克隆入 pCAMBIA1381Xa質(zhì)粒(購自澳大利亞Cambia公司)，得到質(zhì)粒pR_l X OsACRE。之后直接 合成2XOsACRE (2X (-89 -45)，長度為90bp)，兩端分別帶有BamHI和HindIII酶切位 點，并克隆入 pCAMBIA1381Xa-l XOsACRE (pR-1 XOsACRE)質(zhì)粒，得到質(zhì)粒 pR_3X0sACRE。 pCAMBIAl38IT-DNA結(jié)構(gòu)如圖3所示。pR-1 XOsACRE和pR_3X0sACRE報告質(zhì)粒構(gòu)建流程如 圖4所示。3X0sACRE的核苷酸序列如序列表中序列2所示。PCR反應(yīng)程序如下預變性94 °C 2分鐘變性95 °C 10 秒
退火延伸
58 0C 30 秒 72 0C 15 秒循環(huán)次數(shù)30次終末延伸 72°C10分鐘2、表達反式作用因子的植物效應(yīng)質(zhì)粒pE-OsACBFl (Effector plasmid)的構(gòu)建植物效應(yīng)質(zhì)粒pE-OsACBFl的構(gòu)建步驟如下(1)以pGADT7 5' KpnI和pGADT7 3‘ BamHI為引物，以水稻葉片的cDNA為模板， PCR擴增出含有KpnI和BamHI位點的OsACBFIcDNA片段。引物序列為pGADT7 5' KpnI 5，-ccggtaccATGGAGTTGCATCTGAACAACGTGG-3，和 pGADT7 3' BamHI :5，-gcggatccTCAATGG TGGTGGTGATGGCGGCTT-3‘。(2) KpnI 和 BamHI 酶切 OsACBFl PCR 產(chǎn)物并回收 OsACBFI 片段；KpnI 和 BamHI 酶 切pRTL2 (購自Invitrogen公司)，回收質(zhì)粒；(3)連接步驟(2)中獲得的OsACBFl片段和酶切質(zhì)粒，然后利用氨芐青霉素鈉(終 濃度為50 μ g/mL)篩選陽性質(zhì)粒pRTL2-HA-0sACBFl ；(4) Hindi11 酶切 pRTL2-HA_0sACBFl，回收 35S-HA_0sACBFl ；(5)將pCAMBIA1381Xa使用HindIII單酶切，去磷酸化，回收；(6)將步驟(4)回收的35S-HA-0sACBFl和步驟(5)回收的酶切質(zhì)粒連接，利用卡 那霉素(終濃度為50 μ g/mL)篩選陽性1381-HA-OsACBF 1質(zhì)粒，即pE-OsACBFl。質(zhì)粒pE-OsACBFl的構(gòu)建流程如圖5所示。同時，將實施例2中基礎(chǔ)啟動子(mini-promoter)(即含有-45 +145序列)克 隆入pCAMBIA1381Xa質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體pC-mini。3、反式作用因子和順式作用元件互作的檢測(1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和處理(土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化)挑取 1 個新鮮的農(nóng)桿菌 EHA105 (購自 http //www. ρ green, acuk. com)菌落到 2mL 液體LB (加入利福平終濃度為10 μ g/mL)中28°C、250rpm培養(yǎng)48小時后轉(zhuǎn)入50mL新鮮 的液體LB (加入利福平終濃度為10 μ g/mL)繼續(xù)培養(yǎng)3小時。菌液4°C，4，OOOrpm離心5 分鐘，去上清。用無菌的IXTE重懸細胞，然后4°C，4，OOOrpm離心5分鐘。用5mL無菌的 IXTE重懸細胞。取200 μ L感受態(tài)細胞，加入待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pR-lX0sACRE、pR-3X0sACRE 報告質(zhì)粒、效應(yīng)質(zhì)粒pE-OsACBFl、質(zhì)粒pC-mini以及質(zhì)粒35S-GUS，分別為500ng，冰上放置 30分鐘，液氮速凍30秒后放入42°C水浴中熱激90秒，然后冰上放置5分鐘；加入800 μ L LB培養(yǎng)基28°C恢復培養(yǎng)1小時；將培養(yǎng)后的菌液鋪在含10 μ g/mL利福平，50 μ g/mL卡那 霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，28°C培養(yǎng)2天，篩選出具有卡那霉素抗性的 農(nóng)桿菌即為陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。(2)轉(zhuǎn)化后的土壤農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和處理從平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌落接種到2mL含有10 μ g/mL利福平和50 μ g/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24小時后按1 100的比例轉(zhuǎn)接到含有10 μ g/mL 利福平、50 μ g/mL卡那霉素、20 μ M的乙酰丁香酮和10mmol/L無水2-嗎啉乙磺酸(MES)的 LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)到0D600大于或者等于1時，將菌液4，OOOrpm離心5分鐘，去上 清。再用浸染緩沖液(Infiltration Buffer 150 μ M AS, 10mmol/L MES，IOmmo 1/L MgCl2)重懸細胞(0D600 = 1)。然后將重懸液室溫靜置3小時備用。(3)煙草葉片農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化(Agroinfiltration)共轉(zhuǎn)化1體積含報告質(zhì)粒(Iteporter)的菌液加1/5體積的含效應(yīng)質(zhì)粒 (Effector)的菌液1體積pR_l XOsACRE菌液加1/5體積的pE-OsACBFl菌液；1體 積pR-3XOsACRE菌液加1/5體積的pE-OsACBFl菌液；1體積pC-mini菌液加1/5體積 的pE-OsACBFl菌液；對照為未加入效應(yīng)質(zhì)粒菌液的報告質(zhì)粒菌液PR-lX0sACRE菌液、 pR-3XOsACRE菌液、pC-mini菌液以及35S-GUS菌液。選取植株生長、發(fā)育狀態(tài)一致的葉 片大小近似(約90%成熟葉片大小)的煙草(Nicotinana tabacum)葉片作為注射備用葉 片。用IOmL注射器吸取菌液，再用針頭在葉片上扎直徑約2mm的小孔(穿過葉片)，去掉針 頭，用手指尖托著葉片背面小孔處，將注射器頭輕壓在小孔上，將菌液注入葉片(需要掌握 力度，太輕和過重都難將菌液均勻注入葉片)。隨后，將植株用塑料袋套上，保濕，弱光下培 養(yǎng)36小時后取樣。(4)植物材料的采集用打孔器在注射孔附近取樣，將一部分葉盤用1. 5mL離心管保存在_80°C，以備定 量測定GUSA基因的表達活性。取少量新鮮葉盤直接用GUS染液染色，定性觀察GUSA基因 的表達活性。(5)⑶S活性檢測取少量葉盤直接浸泡在⑶S染液中，37°C反應(yīng)4-6小時，然后用75%的乙醇脫色， 定性觀察GUSA基因的表達活性，按以下成分配制X-Gluc染色液N、N-二甲基甲酰胺500 μ LX-Gluc5mg1 OOmmo 1/L 磷酸緩沖液 pH7. O9800 μ L5mmol/L 鐵氰化鉀IOOyL5mmol/L 亞鐵氰化鉀IOOyLTriton X-10010 μ L總體積IOmL⑶S基因表達活性的定量測定方法如下取約IOOmg的注射后的煙草葉片，加入少量酸洗過的沙(Sigma公司)，再加入 200 μ L GUS緩沖液[50mmol/L的磷酸鈉緩沖液(ρΗ7· 5)，IOmmol/L的巰基乙醇，0. 1% (V/ V)的 TritonX-100, IOmmol/L 的 EDTA]，冰上研磨；12，000rpm，4°C離心 5 分鐘；取 50 μ L 上 清到0. 35mL⑶S緩沖液中，其他上清留存用于測蛋白濃度；37°C保溫5分鐘；加入100 μ L 5mmol/L的4_MUG(4_甲基傘形酮葡萄糖苷酸)(終濃度lmmol/L)(購自Sigma公司)；37°C 保溫；不同時間點取樣分別于10、30、60、90分鐘取100 μ L樣品至IJ 3. 9mL 0. 2M的碳酸鈉 溶液中(碳酸鈉用來終止反應(yīng)，并且可以增強熒光強度)。將終止反應(yīng)的樣品保存于黑暗 處待測。用日立-850型熒光分光光度計測定各樣品Ex365/Em455的值；配制一系列濃度的 4-MUG，建立GUS熒光標準曲線。根據(jù)標準曲線可以精確測定反應(yīng)體系中的4-MU (4-甲基傘 形酮)的量。⑶S活性用4-MU pmol/mg · min表示。⑶S基因表達活性的定量測定的結(jié)果如下所選用的mini promoter是有效的基 本啟動子，對下游⑶S基因的啟動表達活性很低，⑶S活性為115士 12 pmol/mg -min ；在沒有外源因子OsACBFI時，OsACRE也可以啟動GUS基因表達，GUS活性為200士30pmol/mg ·π η， 是基本啟動子所啟動的⑶S活性的2倍，3個重復OsACRE下游的⑶S活性是321 士 16pmol/ mg ·π η，是基本啟動子所啟動的GUS活性的3倍，應(yīng)該是煙草中含有可以和OsACRE元件相 互作用的因子；當外源因子OsACBFI存在時，如果啟動子中只插入一個拷貝的OsACRE，下游 ⑶S基因的表達活性為1089士 115pmol/mg -min,比沒有外源因子OsACBFI時的GUS活性提 高約5倍；而這種激活作用可因為順式元件序列數(shù)目的增加而加強，當有三個重復串聯(lián)的 OsACRE存在時，⑶S基因的表達活性為3525士227pmol/mg · min,比沒有外源因子OsACBFI 時的GUS活性提高10倍以上；因為已知35S啟動子是一個組成型表達的強啟動子，因此帶 有35S啟動子的pCAMBIA1381Xa質(zhì)粒的煙草葉片瞬時表達體系中沒有OsACBFI存在時，也 具有較高的⑶S活性，⑶S活性為3650士612pmol/mg ·π η，表明35S啟動子并不受OsACBFI 的調(diào)控。此結(jié)果說明，在植物體內(nèi)OsACBFI與OsACRE之間存在著特異性相互作用，并激活 下游目的基因的表達。同時，OsACBFI對下游目的基因的激活轉(zhuǎn)錄活性隨著誘導應(yīng)答元件 OsACRE拷貝數(shù)的增加而增強。
權(quán)利要求
一種DNA分子，為如下1) 3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列選自序列表中序列1，且具有序列表中序列1自5’末端第868位到第1101位的核苷酸序列，同時其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第868位中的任一位置；2)在嚴格條件下與1)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)-9)中任一 所述的DNA分子1)其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第868位中的 任一位置；2)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第868位中的任 一位置；3)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第693位到第868位中的任 一位置；4)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的任一 位置；5)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第693位中的任 一位置；6)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第532位到第693位中的任 一位置；7)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第532位中的任一 位置；8)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第311位到第532位中的任 一位置；9)其自5’端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到第693位中的任一位置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)-5)中任一 所述的DNA分子1)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第1位到第1101位的序列；2)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第311位到第1101位的序列；3)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第532位到第1101位的序列；4)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第693位到第1101位的序列；5)其核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第868位到第1101位的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列為序列 表中序列2所示。
5.含有權(quán)利要求1-4中任一所述DNA分子的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重 組菌。
6.權(quán)利要求1-5中任一所述DNA分子在啟動基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)錄受稻瘟病菌 誘導。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述DNA分子在培育抗稻瘟病植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻中受稻瘟菌誘導的啟動子。本發(fā)明所提供的受稻瘟菌誘導的啟動子，為如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列選自序列表中序列1，且具有序列表中序列1自5’末端第868位到1101位的核苷酸序列，同時其自5’末端第一位核苷酸位于序列表中序列1自5’末端第1位到868位中的任一位置；2)在嚴格條件下與1)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本發(fā)明有助于將水稻中受稻瘟菌誘導的啟動子應(yīng)用于增強植物抗病防御反應(yīng)速率的分子育種中，具有重要的實踐意義。
文檔編號C12N1/15GK101935660SQ201010270229
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者于祥春, 安成才, 張旭, 王莉江, 錢萬強, 黃萍 申請人:北京大學