專利名稱：Rsv和rbsdv的rna干涉載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種適合單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化、兼抗 兩種病毒病的RNA干涉載體的構(gòu)建及其在水稻上應(yīng)用。更進(jìn)一步涉及到水稻條紋病毒 (RSV)外殼蛋白(CP)基因和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV) SlO部分核苷酸序列的表達(dá)載體，及 其遺傳轉(zhuǎn)化禾本科植物水稻并獲得抗性植株的方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國(guó)水稻占糧食生產(chǎn)和消費(fèi)的40%，其 在糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的作用。由水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)引起水稻條紋葉枯病是我國(guó)粳稻種植區(qū)最重要的水稻病毒病害。流行年份，一般田塊 減產(chǎn)20 % 30 %，嚴(yán)重田塊達(dá)到80 %以上，甚至顆粒無收。該病在江蘇、安徽、河南和山東 等地，曾于2001、2004、2005、2006、2007年連續(xù)爆發(fā)成災(zāi)。2004年在江蘇、河南等病田率達(dá) 75%以上，部分病重田的病穴率達(dá)90%以上；2005年，僅江蘇省發(fā)病面積就達(dá)2800萬畝，給 當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)造成巨大損失。2006 2009年華北和東北稻區(qū)也呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)，據(jù)農(nóng)業(yè)部 有關(guān)部門估計(jì)2008年發(fā)病面積可達(dá)2800 3000萬畝，2009年發(fā)病面積可達(dá)與2008年持 平，2010年仍將為偏重發(fā)生年份(www. agri. gov. cn)。自2000年以來，在江蘇、浙江、福建、江西等稻區(qū)，由水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)引起的稻黑條矮縮病沉寂多年后再度爆發(fā)流行，流 行地區(qū)約60%的稻田發(fā)病，一般田塊株發(fā)病率10 30%，嚴(yán)重田塊可高達(dá)40 80%以上。 2004年，在浙江省中南部雜交稻種植區(qū)發(fā)病面積80萬畝，僅臺(tái)州市發(fā)病面積就達(dá)48萬畝， 占水稻播種面積的33%，損失產(chǎn)量2萬余噸。2006 2007年在江蘇桐城、鹽城、泰州等地 區(qū)的華粳6號(hào)、淮稻5號(hào)、II優(yōu)084等水稻品種上，病株率一般在20-30%，嚴(yán)重的在80% 左右，有的重病田病株率甚至高達(dá)90%以上，目前已擴(kuò)展到湖南、山東等地，因此該病已成 為威脅我國(guó)水稻生產(chǎn)的又一重要的病毒病。這兩種病毒還可以侵染我國(guó)的主要糧食作物玉米和小麥，由水稻黑條矮縮病毒 (RBSDV)引起的玉米粗縮病是威脅玉米生產(chǎn)的重要病毒病害。流行學(xué)研究結(jié)果表明這些病害暴發(fā)、流行的主要原因是品種抗性的喪失和有效傳 毒介體種群數(shù)量的上升。由于抗病品種在品質(zhì)上的不足，導(dǎo)致感病品種的大面積種植，加之 灰飛虱傳毒的瞬時(shí)性和持久性、病毒病防治藥劑缺乏，使得防蟲治病十分困難，農(nóng)藥的使用 也存在許多弊病，因此最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑是利用品種自身的抗性達(dá)到主動(dòng)防治病毒病害 目的。然而傳統(tǒng)的育種方法由于缺乏理想的抗源(國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)抗黑條矮縮病毒的種質(zhì)資 源)，抗病基因又多與劣質(zhì)基因相伴隨，獲得抗病、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的雙重特性品種的難度很大。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默現(xiàn)象，它 是指通過雙鏈RNA的介導(dǎo)的特異性的降解對(duì)應(yīng)序列的mRNA，從而特異性地抑制相應(yīng)基因 的表達(dá)，是植物對(duì)外來入侵者的一種重要的防御機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)RSV田間分離物外殼蛋 白(CP)的研究表明，我國(guó)北方粳稻產(chǎn)區(qū)所發(fā)生的RSV CP基因非常保守，同源性達(dá)96. 7 100%，有利于SiRNA的識(shí)別。本發(fā)明以近年在我國(guó)北方地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生的水稻條紋病毒 (RSV)和黑條矮縮病毒(RBSDV)為對(duì)象，利用植物轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)將RSV CP和RBSDV SlO 的部分核苷酸導(dǎo)入水稻，通過其特異地干擾、降解或沉默RSV和RBSDV病毒基因在水稻植株 內(nèi)的正常復(fù)制、積累和傳播，篩選獲得分別或同時(shí)抗RSV、RBSDV的水稻品系，為進(jìn)一步結(jié)合 常規(guī)育種工作，改良現(xiàn)有的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)但不抗病的水稻品種，以便實(shí)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得 免疫或高抗RSV和RBSDV的水稻新品系的目的。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述目的，本發(fā)明提供了可用于農(nóng)桿菌和基因槍遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物的2種 含有水稻條紋病毒(RSV)和水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)基因的RNA干涉(RNAi)載體，這些 載體分別包含致病病毒RSV的CP基因部分核苷酸序列(RSV-HCP)和致病病毒RBSDV的SlO 部分片段(RBSDV-HS10)。本發(fā)明還提供這些干涉病毒基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用，為植物抗病育種工 程提供了 一種新的策略和思路。RSV和RBSDV的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征 在于以串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列為正、反義鏈，所述串聯(lián)的RSV和RBSDV特 異性核苷酸序列如SEQ ID NOl。所述骨架載體為PMCG161載體。所述正義鏈插入在酶切位點(diǎn)AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點(diǎn)SpeI和 SacI之間，命名為pMCG161+/-D，其結(jié)構(gòu)如圖6A所示。所述骨架載體為去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301載體。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)為干涉載體pMCG161+/-D經(jīng)BamHI、HindIII酶切得到的，命名為 PCMBIA1301+/-D，其結(jié)構(gòu)如圖6B所示。pMCG161+/-D干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)得到如序列SEQ ID NOl所示的串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸片段；(2) 將步驟(1)的基因部分片斷經(jīng)AscI、AvrII雙酶切后，與同樣經(jīng)AscI、AvrII酶切的載體 PMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒pMCG161+D;再將步驟(1)的基因部分片 斷經(jīng)SpeI、SaCI雙酶切，與經(jīng)SpeI、SaCI酶切的載體pMCG161+D連接，即可得到插入正反義 鏈的RNA干涉載體pMCG161+/-B。所述步驟(1)采用如下步驟方式(1)以感染水稻條紋病毒RSV水稻總RNA為模 板，以SEQ ID N02和SEQ ID N03所示序列為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物I，SEQ ID N02 :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，，SEQ ID N03 :5’ -AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3，；(2)以感染水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQ ID N04和SEQ ID N05所示序列為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物II，SEQ ID N04 5' -CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3，，SEQ ID N05 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3，；(3)以PCR產(chǎn)物I和II的1 1混合物為模板，以SEQ ID N02和SEQ ID N05為 引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物III，
SEQ ID N02 :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，，SEQ ID N05 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3，。(4)以PCR產(chǎn)物III為模板，以SEQ ID N02和SEQ ID N05為引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增 得到串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸片段。PCMBIA1301+/-D干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)用限制性內(nèi)切酶Xho I酶切 PCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標(biāo)記基因的pCMBIA1301載體，即pCMBIA1301_hpt- ； (2) 將pMCG161+/-D用BamHI、HindIII酶切，得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301_hpf，得到無標(biāo) 記基因的RNA干涉載體pCMBIA1301+/-D。所述干涉載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將上述干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對(duì)水稻條紋病毒和黑條矮縮 病毒同時(shí)產(chǎn)生抗性。所述干涉載體為PMCG161+/-D，所述轉(zhuǎn)化的方法為基因槍法。所述干涉載體為PCMBIA1301+/-D，所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105。所述受體植物為禾本科植物。所述禾本科植物為水稻。所述水稻品種為愛知旭(Oryzasativa cv. Aichiasahi)或皖粳97 (Wanjing 97)。根據(jù)已公開的RSV CP基因和RBSDV SlO設(shè)計(jì)了重疊引物SEQ ID N03和SEQ ID N04，以感染水稻條紋病毒RSV水稻總RNA為模板，以SEQ ID N02 (上游引物)和SEQ ID N03(下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到RSV-CP基因部分片段，即為RSV-HCP，以感染 水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQ ID N04 (上游引物)和SEQ ID N05 (下 游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到RBSDV-S10基因部分片段即RBSDV-HS10，以上述兩 個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物1 1混合作為模板，以SEQ ID N02和SEQ ID N04為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增得到PCR 產(chǎn)物III ；以PCR產(chǎn)物III為模板，以SEQ ID N02和SEQ ID N05為引物對(duì)擴(kuò)增得到串聯(lián)的 RSV-HCP和RBSDV-HS10目的片段，將其作為正義鏈和反義鏈插入骨架載體中得到本發(fā)明的 干涉載體。將本發(fā)明的干涉載體轉(zhuǎn)入受體植物中，將使RSV和RBSDV發(fā)生基因沉默而不表 達(dá)，從而使該受體植物產(chǎn)生RSV和RBSDV的抗性。RNA干涉載體PMCG161+/-D，適合于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物，可獲得兼抗RSV和 RBSDV的轉(zhuǎn)基因后代，該載體攜帶有氯霉素抗性基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。采用的骨架載 體是雙向表達(dá)載體PMCG161，將串聯(lián)的RSV-HCP和RBSDV-HS10片段的正義鏈插入在酶切位 點(diǎn)AscI和AvrII間，將負(fù)義鏈插入在酶切位點(diǎn)SpeI和SacI之間，通過載體上的intro (rice Waxy-a intron 1)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物。本發(fā)明將用限制性內(nèi)切酶Xho I酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標(biāo)記 基因的 PCMBIA1301 載體，即 pCMBIA1301_hpt、然后將 pMCG161+/_D 干涉載體用 BamHI、 HindIII酶切，得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301 -hpt_，得到無標(biāo)記基因的RNA干涉載體 PCMBIA1301+/-D。由于該干涉載體不僅適合于超毒力菌株，且不含有抗生素基因，有利于將 來轉(zhuǎn)基因植物的安全釋放。最終構(gòu)建的無標(biāo)記基因RNA干涉載體pCMBIA1301+/-D不攜帶抗生素或除草劑抗 性基因，適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得兼抗RSV和RBSDV的轉(zhuǎn)基因后代；與攜帶潮霉素和卡那霉素抗性的抗性基因的PCMBIA1301的空白載體經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo) 進(jìn)行單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)比，這樣即可方便抗性愈傷組織的篩選，又可通過后代分離， 方便得到無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因再生植株，減少轉(zhuǎn)基因植物帶來的生物安全性隱患。根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法是目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)化方法之一，已成 功的應(yīng)用于單、雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因研究中。本發(fā)明最終構(gòu)建的干涉載體PCMBIA1301+/-D 適合超毒力菌株EHA105等農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化。利用根瘤農(nóng)桿菌EHA105將其導(dǎo)入 水稻，所得到的轉(zhuǎn)基因植株可以使入侵的致病病毒發(fā)生RNA沉默現(xiàn)象，使病毒不能繁殖或 積累，從而使植物具備對(duì)病毒的抗病性。本發(fā)明利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，借助水稻細(xì)胞 RdRp的轉(zhuǎn)錄作用，產(chǎn)生RSV部分CP基因、RBSDV的SlO部分片段的dsRNA的形式，再由 DicerIII的作用產(chǎn)生SiRNA，當(dāng)水稻受RSV和RBSDV侵染時(shí)，就可產(chǎn)生SiRNA，從而達(dá)到利 用RNA干擾介導(dǎo)對(duì)RSV和RBSDV抗性，最終篩選出免疫或高抗RSV和RBSDV的轉(zhuǎn)基因水稻植株。本發(fā)明已得到以水稻模式品種愛知旭為受體的水稻TO代再生植株，轉(zhuǎn)化載體 PCMBIA1301+/-D的植株是267株，在病毒病重發(fā)區(qū)河南鄭州經(jīng)田間抗病性篩選評(píng)價(jià)。其中 轉(zhuǎn)化雙價(jià)載體的24株未表現(xiàn)癥狀(0級(jí))，97株表現(xiàn)輕微癥狀(I級(jí))，109株表現(xiàn)中等癥狀 (II級(jí))，37株嚴(yán)重癥狀(III)。經(jīng)PCR檢測(cè)，未表現(xiàn)癥狀的24株中19株擴(kuò)增到目的基因， 表現(xiàn)輕微癥狀的97株中有38株有陽性條帶，同時(shí)受體愛知旭發(fā)病嚴(yán)重，全部為II或III 級(jí)，發(fā)病株率為100%，這說明轉(zhuǎn)基因水稻植株較受體有明顯的抗病性。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種干擾病毒基因表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與 應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾在生物抗性育種中的應(yīng)用提供了新的思路。將該載體轉(zhuǎn)入 水稻中，成功獲得了抗病毒植株，實(shí)現(xiàn)了利用RNA干擾原理獲得抗RSV和RBSDV水稻新材料 的預(yù)期目標(biāo)，為RNA干擾介導(dǎo)的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實(shí)例，彌補(bǔ)了 RNA干 擾介導(dǎo)的RSV和RBSDV抗性在本領(lǐng)域研究中的空缺。利用本發(fā)明的干擾載體轉(zhuǎn)化所得的抗性生物體可以是任何微生物、植物或其組 織、細(xì)胞，以及由此所獲得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及該類植物后代的種子、雜 交和轉(zhuǎn)育后代。轉(zhuǎn)化單子葉植物的RNA干涉載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1)串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列的獲得以感染水稻條紋病毒(RSV)水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO. 2 (上游引物)和 SEQ ID NO. 3 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增RSV-HCP,得到PCR產(chǎn)物III，目的片段 約為250bp。回收PCR產(chǎn)物I，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α (購自北京全式 金公司)得到陽性質(zhì)粒PMD18-T-HCP，進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確的目的片段即可用于下述試 驗(yàn)。所述SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的序列如下SEQ ID N02 :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，，SEQ ID NO 3 :5’ -AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3，以感染水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO. 4 (上游引 物)和SEQ ID N0. 5 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增RBSDV-HS10，得到PCR產(chǎn)物II， 目的片段約為290bp。回收PCR產(chǎn)物II，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α (購自北京全式金公司)得到陽性質(zhì)粒PMD18-T-HS10，進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確目的片段即可用 于下述試驗(yàn)。所述SEQ IDN0. 4和SEQ IDN0. 5序列如下SEQ ID N04 5' -CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3，，SEQ ID N05 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3，以PCR產(chǎn)物I和II的混合物(1 1)為模板，以SEQ ID NO. 2 (上游引物)和SEQ ID NO. 5 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物III，目的片段約為540bp。 回收PCR產(chǎn)物III。再以PCR產(chǎn)物III為模板，以SEQ ID NO. 2 (上游引物)和SEQ ID NO. 5 (下游引 物)為引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物IV，此即為串聯(lián)的RSV-HCP和RBSDV-HS10-雙價(jià)目 的片段，大小為537bp?；厥誔CR產(chǎn)物IV，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，得到 陽性質(zhì)粒PMD18-T-HCP/HS10，進(jìn)行序列驗(yàn)證。測(cè)序正確的目的片段即可用于雙價(jià)RNA干涉 載體的構(gòu)建。2)病毒RNA干涉載體(中間載體)的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物IV分別經(jīng)AscI、AvrII雙酶切后，分別與同樣經(jīng)AscI、AvrII酶切的 載體PMCG161連接，分別得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒-PMCG161+D。同樣將PCR產(chǎn)物 IV分別經(jīng)Spel、SacI雙酶切，分別與經(jīng)Spel、SacI酶切的載體pMCG161+D連接，即可得到 插入正反義鏈的RNA干涉載體pMCG161+/-D，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)、核苷酸序列分析，目的片段序 列正確的干涉載體可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物，獲得兼抗RSV、RBSDV兩種病毒的轉(zhuǎn)基因 植株。這些干涉載體攜帶有氯霉素抗性基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。由于pMCG161載體帶有氯霉素抗性基因，而農(nóng)桿菌EHA105抗氯霉素，因此上述 構(gòu)建的適合基因槍轉(zhuǎn)化水稻的干涉載體不能直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。而 PCAMBIA1301載體是農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化水稻的常用載體，具有潮霉素抗性和卡那霉素抗性。3)無標(biāo)記基因載體pCMBIA1301_hpt_的獲得用限制性內(nèi)切酶Xho I酶切pCMBIA1301載體，經(jīng)電泳檢測(cè)、回收、純化大片段后， 再經(jīng)T4DNA連接酶16°C連接過夜，即可得到去除潮霉素標(biāo)記基因的PCMBIA1301載體，即 pCMBIA1301-hpt_。4)無標(biāo)記載體基因病毒RNA干涉載體的構(gòu)建將上述中間載體pMCG161+/-D 和 pCMBIA1301_hpt_ 用 BamHI、HindIII 酶切， 回收大片段，在T4DNA連接酶作用下(16°C連接過夜)，將中間載體上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入 pCMBIA1301-hpt",得到無標(biāo)記基因的RNA干涉載體pCMBIA1301+/_D。經(jīng)PCR檢測(cè)、序列分 析正確的干涉載體即可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化，獲得不含有標(biāo)記基因的兼 抗RSV、RBSDV兩種病毒的轉(zhuǎn)基因再生植株。


圖1.PCR擴(kuò)增獲得串聯(lián)的RSV-HCP和RBSDV-HS10的結(jié)果(PCR產(chǎn)物III)；泳道 1. DL2000，2-5. PCR產(chǎn)物I和II的混合物(1 1)，6.空白對(duì)照?qǐng)D 2.串聯(lián)的 RSV-HCP 和 RBSDV-HS10 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(IV)；泳道 1. DL2000, 2.空 白對(duì)照，3-5. PCR產(chǎn)物III圖3.連入病毒正義鏈重組質(zhì)粒PMCG161+D的PCR鑒定結(jié)果
圖4.連入正負(fù)義鏈重組質(zhì)粒PMCG161+/-D的鑒定結(jié)果圖5.無標(biāo)記基因載體pCMBIA1301-hpt-的PCR檢測(cè)結(jié)果泳道l.DL2000，2.空白 對(duì)照，3-15. pCMBIA1301-hpt"圖6.重組質(zhì)粒pCMBIA1301+/-D的PCR鑒定結(jié)果泳道l.DL2000，2.空白對(duì)照，3.空 白質(zhì)粒pCMBIA1301，4-8.重組質(zhì)粒圖7. pMCG161+/-D干涉載體圖譜圖8pCMBIA1301+/_D干涉載體圖譜圖9. RSV-HCP/RBSDV-HS10重組農(nóng)桿菌的PCR鑒定結(jié)果(泳道1. DL2000, 2.空白 對(duì)照，3. DH5 α，4-10.重組質(zhì)粒)圖10.水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)圖11.水稻成熟胚愈傷組織的繼代培養(yǎng)圖12.愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)圖13.抗性愈傷組織的篩選圖14.抗性愈傷組織的分化圖15.分化小苗的壯苗培養(yǎng)圖16. TO轉(zhuǎn)基因水稻幼苗圖17. TO代轉(zhuǎn)基因再生植株的PCR鑒定圖18Τ0代轉(zhuǎn)基因愛知旭植株和對(duì)照在大田的抗病性表現(xiàn)
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)中所用的pMD18-T購自大連寶生物公司(Takara公司)，感受態(tài)細(xì)胞DH5 α購 自北京全式金公司。實(shí)驗(yàn)中使用的載體PMCG161保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病毒實(shí) 驗(yàn)室(可向公眾發(fā)放)，是專門適用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的RNA干擾載體，它含有來源于水稻 的Rice waxy-a intron 1，位于5442bp_6576bp，在它的上游含有AscI和AvrII兩個(gè)酶切 位點(diǎn)，用來連接目的基因的正向片段，在它的下游含有SpeI和SacI位點(diǎn)，可用來連接目的 基因的反向片段，最終獲得雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。載體pCMBIA1301是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的常用載體(該載體保存在中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，可向公眾發(fā)放)，具有潮霉素抗性和卡那霉素抗 性。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造的pCMBIA1301_hpt_也可向公眾發(fā)放，通過單酶切位點(diǎn)BamHI和 HindIII可以將來自中間載體pMCG161+/-D上的目的基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)插入其中，獲得無標(biāo) 記基因、且適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳的RNA干涉載體。實(shí)施例1、兼抗RSV、RBSDV的雙價(jià)無標(biāo)記基因RNA干擾載體的構(gòu)建步驟1 設(shè)計(jì)RSV-HCP和RBSDV-HS10的重疊引物根據(jù)已經(jīng)公布的RSV CP基因和RBSDV SlO的核苷酸序列，設(shè)計(jì)重疊PCR引物SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4。SEQ ID NO 3 :5’ -AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3，SEQ ID NO 4 :5’ -CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3，
步驟2 串聯(lián)RSV和RBSDV特異性核苷酸序列的獲得以采集自江蘇南京的感染水稻條紋病毒(RSV)水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO. 2(上游引物)和SEQ ID NO. 3(下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增RSV-HCP，得到PCR 產(chǎn)物I，目的片段約為250bp。回收PCR產(chǎn)物I，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α 得到陽性質(zhì)粒PMD18-T-HCP，進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確的目的片段即可用于串聯(lián)片段的擴(kuò)
+飽
+曰ο以采集自山東濟(jì)寧的感染水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO. 4 (上游引物)和SEQ ID NO. 5 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增RBSDV-HS10, 得到PCR產(chǎn)物II，目的片段約為290bp?；厥誔CR產(chǎn)物II，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH 5α (購自北京全式金公司)得到陽性質(zhì)粒pMD18-T-HS10，進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確 的目的片段即可用于RNA干涉載體的構(gòu)建。以PCR產(chǎn)物I和II的混合物(1 1)為模板，以SEQ ID NO. 2 (上游引物)和SEQ ID N0. 5 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物III，目的片段為538bp (圖1)。 回收PCR產(chǎn)物III。再以PCR產(chǎn)物III為模板，以SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 5為引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò) 增得到PCR產(chǎn)物IV，此即為串聯(lián)的RSV-HCP和RBSDV-HS10-雙價(jià)目的片段，大小為538bp。 回收PCR產(chǎn)物IV(圖2)，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，得到陽性質(zhì)粒 PMD18-T-HCP/HS10,進(jìn)行序列驗(yàn)證。測(cè)序正確的目的片段即可串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性 核苷酸序列，可用于雙價(jià)RNA干涉載體的構(gòu)建。步驟3、干涉載體pMCG161+/-D的獲得將PCR產(chǎn)物IV和載體pMCG161分別經(jīng)AscI、AvrII雙酶切后，65°C處理20min， 使內(nèi)切酶失活，在T4DNA Ligase作用下連接，將正向目的片段插入載體pMCG161，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH 5 α，經(jīng)PCR鑒定(圖3)、序列分析正確的重組質(zhì)粒就是含有串聯(lián)的RSV-HCP和 RBSDV-HS10的正向片段的重組質(zhì)粒，命名為pMCG161+D。同樣將PCR產(chǎn)物IV經(jīng)SpeI、SacI雙酶切，與經(jīng)SpeI、SacI酶切的載體pMCG161+D 在T4DNA Ligase作用下連接，即可得到插入串聯(lián)的RSV-HCP和RBSDV-HS10正反向片段的 RNA干涉載體pMCG161+/-D，PCR檢測(cè)結(jié)果見圖4，載體圖譜見圖7。該干涉載體可用于基因 槍轉(zhuǎn)化單子葉植物，獲得兼抗RSV和RBSDV的轉(zhuǎn)基因植株，也可以用做構(gòu)建無標(biāo)記RNA干涉 載體的中間載體。該干涉載體攜帶有氯霉素抗性基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。步驟4、無標(biāo)記基因載體pCMBIA1301-hpt_的獲得用限制性內(nèi)切酶Xho I酶切PCMBIA1301載體，經(jīng)大片段柱回收、純化后，再 經(jīng)T4DNA連接酶16°C連接過夜，即可得到去除潮霉素標(biāo)記基因的PCMBIA1301載體，即 pCMBIA1301-hpt_。通過PCR檢測(cè)潮霉素標(biāo)記基因的載體擴(kuò)增的目的片段為189bp，含有掉 潮霉素標(biāo)記基因的載體擴(kuò)增的目的片段約為1200bp (圖5)。步驟5、干涉載體pCMBIA1301+/-D的獲得將干涉載體pMCG161+/-D經(jīng)BamHI、HindIII酶切后，回收得到約7. 5Kb的目的片 段，在T4DNA Ligase作用下(16°C連接過夜)，將其連入pCMBIA1301-hpt_載體，經(jīng)PCR檢測(cè) (圖6)、序列分析正確的載體即為無標(biāo)記基因的串聯(lián)的RSV-HCP和RBSDV-HS10的RNA干涉 載體，命名為PCMBIA1301+/-D (其圖譜見圖8)，該載體可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化，分別獲得不含有標(biāo)記基因的兼抗RSV和RBSDV的轉(zhuǎn)基因再生植株。至此本發(fā)明得到了適合單子葉轉(zhuǎn)化的2種RNA干涉載體，其中一種適合基因槍的 遺傳轉(zhuǎn)化的中間載體，另一種為適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的最終載體。所構(gòu)建的2種干涉載 體中，正向片段和反向片段間有約為IlOObp的水稻內(nèi)含子片段，有利于維持發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形 成。最終構(gòu)建的一種RNA干涉載體不含有抗除草劑基因，減少了將來轉(zhuǎn)基因植物存在生物 安全性的隱患。利用PMCG161載體和pCAMBIA1301載體所構(gòu)建的上述2種載體可分別用于基因槍 和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2、病毒RNA干涉載體電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105由于重組質(zhì)粒pCMBIA1301+/-D向農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化的效率很低，本發(fā) 明采取了電擊轉(zhuǎn)化的方法，獲得了含有目的基因的重組農(nóng)桿菌。具體步驟如下步驟1、將1 μ g質(zhì)粒(pCMBIA1301+/-D)與150 μ 1農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)混勻，加 入到滅菌后的電擊杯中，于2. 5KV電壓下進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。步驟2、然后加800μ 1液體培養(yǎng)基沖洗電擊杯并轉(zhuǎn)入EP管，28°C，220rpm搖培2h。步驟3、再取100 200 μ 1培養(yǎng)液涂YM (Kana 50 μ g/ml ；利福平50 μ g/ml)平板， 28°C培養(yǎng)約18小時(shí)。步驟4、經(jīng)挑取單菌落于5ml YM液體培養(yǎng)基(Kana 50 μ g/ml ；利福平50 μ g/ml)， 28°C，220rpm，搖培 16_24h 即可。步驟5、重組農(nóng)桿菌的PCR鑒定菌落PCR鑒定結(jié)果(見圖9)表明，陽性轉(zhuǎn)化子和載體質(zhì)粒為模板的陽性對(duì)照擴(kuò)增 到約540bp左右的條帶；以未轉(zhuǎn)化的空的EHA105菌液為模板的陰性對(duì)照未得到目的片段。實(shí)施例3、病毒基因干擾病毒基因表達(dá)載體的應(yīng)用。應(yīng)用上述含有目的結(jié)構(gòu)的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物-愛知旭水稻品種，使之 產(chǎn)生對(duì)水稻病毒病的抗性(圖10-16)。本發(fā)明已得到以水稻模式品種愛知旭為受體的水稻TO代再生植株，其中轉(zhuǎn)化雙 價(jià)載體PCMBIA1301+/-D的植株267棵，并在病毒病重發(fā)區(qū)河南鄭州經(jīng)田間抗病性篩選評(píng)價(jià) (圖 18)。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植株(TO代)的PCR鑒定本發(fā)明以SEQ ID NO. 2/SEQ ID NO. 5為引物對(duì)，對(duì)以愛知旭為受體的轉(zhuǎn)RSV-HCP 和RBSDV-HS10雙價(jià)干涉載體的再生水稻植株TO代267株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，結(jié)果表 明51株擴(kuò)增到目約540bp的目的條帶(圖17)，陽性為19%，說明目的基因整合進(jìn)了水稻
的基因組。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水稻條紋病毒和水稻矮縮病毒的抗性測(cè)定本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因苗移栽到病毒病的重發(fā)區(qū)的條件，通過自然發(fā)病進(jìn)行了抗病性篩 選，移栽30-35天的調(diào)查結(jié)果表明轉(zhuǎn)化載體pCMBIA1301+/-D的植株267棵中，24株未表 現(xiàn)癥狀(0級(jí))，97株表現(xiàn)輕微癥狀(I級(jí))，109株表現(xiàn)中等癥狀(II級(jí))，37株嚴(yán)重癥狀 (III)。但受體愛知旭發(fā)病嚴(yán)重，全部為II或III級(jí)，發(fā)病株率為100%，這說明轉(zhuǎn)基因水稻 植株較受體有明顯的抗病性(圖19)。與PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比得知，未表現(xiàn)癥狀的24株中有19株擴(kuò)增到目的基因，表現(xiàn)輕微癥狀的97株中有32株有陽性條帶。 雖然本發(fā)明只采用了 PCMBIA1301+/-D轉(zhuǎn)化了水稻，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根 據(jù)常規(guī)知識(shí)可以得知，采用基因槍法同樣可以將PMCG161+/-D轉(zhuǎn)化其它受體植株，得到相 同的效果。
權(quán)利要求
RSV和RBSDV的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列為正、反義鏈，所述串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸序列如SEQ ID NO1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述骨架載體為pMCG161載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述正義鏈插入在酶切位點(diǎn) AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點(diǎn)SpeI和SacI之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述骨架載體為去掉潮霉素 抗性基因的PCMBIA1301載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)為權(quán)利要求3 的干涉載體經(jīng)BamHI、HindIII酶切得到。
6.權(quán)利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)得到如序列SEQID NOl所示的串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸片段；(2)將步驟 (1)的基因部分片斷經(jīng)AsCI、AvrII雙酶切后，與同樣經(jīng)AsCI、AvrII酶切的載體pMCG161連 接，得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒PMCG161+D;再將步驟(1)的基因部分片斷經(jīng)Spel、 SacI雙酶切，與經(jīng)SpeI、SaCI酶切的載體pMCG161+D連接，即可得到插入正反義鏈的RNA干 涉載體 PMCG161+/-B。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，所述步驟(1)采用如下步驟方式(1)以感染水 稻條紋病毒RSV水稻總RNA為模板，以SEQ ID N02和SEQ ID N03所示序列為引物對(duì)，經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物I，SEQ ID N02 :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，，SEQ ID N03 :5’ -AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3，；(2)以感染水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQID N04和SEQ IDN05 所示序列為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物II，SEQ ID N04 5' -CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3，，SEQ ID N05 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3，；(3)以PCR產(chǎn)物I和II的1 1混合物為模板，以SEQ ID N02和SEQ ID N05為引物 對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物III，SEQ ID N02 :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3，，SEQ ID N05 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。(4)以PCR產(chǎn)物III為模板，以SEQID N02和SEQ ID N05為引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到 串聯(lián)的RSV和RBSDV特異性核苷酸片段。
8.權(quán)利要求5所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)用限 制性內(nèi)切酶XhoI酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標(biāo)記基因的pCMBIA1301載體， 即pCMBIA1301-hpt" (2)將權(quán)利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體用BamHI、 HindIII酶切，得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301-hpt_，得到無標(biāo)記基因的RNA干涉載體 PCMBIA1301+/-D。
9.權(quán)利要求1-5任一所述的干涉載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，為將權(quán)利要求1-5任一所述的RSV和RBSDV的RNA干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對(duì)水稻條紋病毒和黑條矮縮病毒同時(shí)產(chǎn)生抗性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述干涉載體為權(quán)利要求3所述的RSV和RBSDV的 RNA干涉載體，所述轉(zhuǎn)化的方法為基因槍法。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述干涉載體為權(quán)利要求5所述的RSV和RBSDV的 RNA干涉載體，所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述受體植物為禾本科植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，所述禾本科植物為水稻。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，所述水稻品種為愛知旭或皖粳97。
全文摘要
本發(fā)明涉及“RSV和RBSDV的RNA干涉載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將如SEQ ID NO1所示的序列作為正、反義鏈建立了水稻條紋病毒RNA干涉載體pMCG161+/-D和pCMBIA1301+/-D。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種干擾病毒基因表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾在生物抗性育種中的應(yīng)用提供了新的思路。將該載體轉(zhuǎn)入水稻中，成功獲得了抗病毒植株，實(shí)現(xiàn)了利用RNA干擾原理獲得兼抗RSV和RBSDV水稻新材料的預(yù)期目標(biāo)，為RNA干擾介導(dǎo)的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實(shí)例，彌補(bǔ)了RNA干擾介導(dǎo)的RSV和RBSDV抗性在本領(lǐng)域研究中的空缺。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101974550SQ20101027610
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者劉艷, 吳蓓蕾, 李紅偉, 李莉, 王錫鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所