本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種利用家蠶核型多角體病毒載體系統(tǒng)過量表達microRNA的方法。

背景技術(shù)：

家蠶(Bombyx mori)是一種有重要經(jīng)濟價值的昆蟲，也是研究生長發(fā)育和遺傳變異的重要模式生物。MicroRNA(miRNA)是一類長約20-25nt的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，主要通過與靶mRNA的3’UTR靶位點不完全互補配對，降解mRNA或抑制靶基因翻譯，進而調(diào)節(jié)生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝等各項生命活動。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)過量表達家蠶miRNA，可望為研究家蠶miRNA的功能或調(diào)節(jié)機制提供新的手段。在線蟲(Caenorhabditis elegans)中，let-7通過與靶基因lin-14、lin-28、lin-41、lin-42和daf-12的3’UTR端相結(jié)合來負調(diào)控靶基因，進而調(diào)控線蟲幼蟲晚期到成蟲的發(fā)育。在哺乳動物中，let-7負調(diào)控致癌基因RAS的表達，當(dāng)let-7過表達時，肺癌細胞的生長受到抑制。在果蠅(Drosophila melanogaster)的let-7缺失突變體中，幼蟲的肌肉和神經(jīng)維持到成蟲期致使成蟲出現(xiàn)飛行、運動和生殖缺陷；let-7通過下調(diào)基因abrupt使果蠅腹部肌肉和神經(jīng)得以更新，從而保障幼蟲到成蟲的轉(zhuǎn)變。在德國小蠊(Blattella germanica)的蛹期下調(diào)miR-100時，成蟲翅膀會變小，而同時下調(diào)let-7和miR-100時導(dǎo)致成蟲翅脈畸形，但下調(diào)miR-125后卻無顯著影響。在家蠶中，bmo-let-7和bmo-miR-100的表達與蛻皮激素有關(guān)，可能參與家蠶的變態(tài)發(fā)育。然而，家蠶let-7-Complex(let-7、miR-100和miR-2795)在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的具體生物學(xué)功能并不清楚。

桿狀病毒是一類專一性感染節(jié)肢動物的DNA病毒。其中，苜蓿銀蚊夜蛾(autogra phacalifornica)多核型多角體病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)(AcMNPV或AcNPV)能感染30多種鱗翅目昆蟲，被廣泛用作基因表達系統(tǒng)載體。Smith和Summers等在1983年建立了桿狀病毒表達系統(tǒng)。1985年，Maeda等首次以來自家蠶的核型多角體病毒BmNPV為載體，在家蠶細胞和個體中高效表達α-干擾素等外源基因，開辟了以家蠶作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白的手段。目前已有數(shù)千種外源基因在昆蟲NPV系統(tǒng)中得到高效表達。雖然利用AcNPV桿狀病毒bac-to-bac表達系統(tǒng)在昆蟲Sf9細胞中實現(xiàn)了miRNA的超量表達，但還未有利用BmNPV在家蠶細胞和個體中過量表達miRNA的報道。將家蠶let-7簇全長序列構(gòu)建到BmNPV基因組上，在家蠶胚胎細胞系BmE和家蠶五齡幼蟲特異組織中實現(xiàn)miRNA的超量表達，為探索miRNA的功能或調(diào)控機制提供技術(shù)手段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)存在的問題，提供一種利用家蠶核型多角體病毒載體系統(tǒng)過量表達microRNA的方法。利用家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus，BmNPV)載體超量表達家蠶miRNA，為研究家蠶miRNA的功能提供新的思路。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利用家蠶核型多角體病毒載體系統(tǒng)過量表達microRNA的方法，步驟包括：

(1)總RNA與重組Bacmid全基因組DNA提?。河肨rizol提取細胞和組織總RNA，測定RNA濃度和純度，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，然后離心收集重組Bacmid感染BmE細胞后不同時間點的細胞上清液，提取重組病毒DNA，測定DNA濃度和純度；

(2)引物設(shè)計：從miRbase下載bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795的成熟體序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載家蠶gapdh基因序列和BmNPV的糖蛋白gp41基因序列，運用Primer 5.0軟件設(shè)計gapdh和gp41的熒光定量PCR引物；

(3)miRNA重組桿狀病毒的構(gòu)建：劃線復(fù)蘇Red-pFastBac1-let-7-C(RP-let-7-C)永久菌，挑取單菌落后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Not I和Xho I雙酶切驗證重組報告基因載體，取20μL RP-let-7-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μL E.coli DH10Bac/BmNPV感受態(tài)細胞，冰浴30min，42℃熱激90s，37℃水平搖床搖1h后，取100μL細菌懸液涂布在“卡那霉素50μg·mL^-1、四環(huán)素10μg·mL^-1、慶大霉素50μg·mL^-1、IPTG 40μg·mL^-1、X-gal 100μg·mL^-1”的LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)，通過藍白斑篩選出Tn7轉(zhuǎn)座成功的重組桿狀病毒BmNPV-let-7-C，以M13引物PCR驗證陽性克隆，送華大基因測序鑒定；

(4)重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染BmE細胞系：37℃水浴快速解凍復(fù)蘇家蠶胚胎細胞系BmE，用Grace完全培養(yǎng)基在27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)良好，細胞密度達2-5×10⁶cells·mL^-1時，重懸細胞將其均勻鋪至24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，吸去完全培養(yǎng)基，每孔加入400μL無抗、無血清的Grace培養(yǎng)基；以不加處理的BmE細胞作為空白對照組，非重組病毒BmNPV處理的BmE細胞為陰性對照組，重組病毒處理的BmE細胞為實驗組；用8μL轉(zhuǎn)染試劑X-treme分別包埋1μg的BmNPV和BmNPV-let-7-C質(zhì)粒，再加入100μL無抗、無血清的Grace培養(yǎng)基，瞬離混勻后室溫孵育20min，將混合液緩慢滴入細胞孔中央，順時針輕搖細胞板使混合液均勻分布于細胞板內(nèi)，27℃培養(yǎng)6-8h后更換成完全培養(yǎng)基，通過OLYMPUS倒置熒光顯微鏡觀察細胞的紅色熒光蛋白信號；

(5)重組桿狀病毒BmNPV注射家蠶幼蟲：在BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞72h后，可觀察到明顯的紅色熒光，通過5,000rpm/5min離心收集含病毒粒子的細胞上清液，然后分別用BmNPV和BmNPV-let-7-C病毒上清液感染新鮮鋪板的BmE細胞，倒置熒光顯微鏡觀察病毒感染細胞后12h、24h、48h、72h、96h和120h的細胞紅色熒光蛋白信號，離心收集上述時間點的細胞材料，細胞上清液用于提取病毒DNA檢測病毒拷貝數(shù)，細胞沉淀用PBS清洗后，加入Trizol裂解細胞用于提取RNA檢測miRNA表達，當(dāng)BmNPV-let-7-C病毒上清感染BmE細胞72h后，離心獲取具強侵染活性的病毒上清液，采用TCID₅₀和qPCR測定病毒滴度后，注射等量病毒至家蠶五齡起蠶，用消毒后的桑葉在25℃室溫下正常飼養(yǎng)，觀察幼蟲生長變化，取注射后24h和72h的幼蟲中腸、脂肪體和整蠶，液氮研磨后取約100μg粉末，加入1mL Trizol充分混勻以完全裂解組織細胞，提取RNA用于qPCR檢測miRNA的表達；

(6)熒光定量PCR檢測miRNA的表達：用Trizol提取BmE細胞和家蠶組織總RNA，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，miScript II RT Kit反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于miRNA定量檢測，重組Bacmid基因組DNA測定濃度后，將其稀釋到200ng·μL^-1用于qPCR檢測，即在20μL熒光定量PCR體系中加入2μL DNA模板。

優(yōu)選的，步驟(2)中，所述引物為：

M13-F GTTTTCCCAGTCACGAC

M13-R CAGGAAACAGCTATGAC

Qgapdh-F CATTCCGCGTCCCTGTTGCTAAT

Qgapdh-R GCTGCCTCCTTGACCTTTTGC

Qgp-41-F CCGTTACCGTTCAATCAGCAG

Qgp41-R GTTGATGTGCGGAAAGCGA

Qlet-7 CGGTGAGGTAGTAGGTTGTATAG

QmiR-100 AACCCGTAGATCCGAACTTGTG

QmiR-2795 AAGTTTGGTGATACGCGGGC

QU6 CGCAAGGATGACACGCAA

進一步的，步驟(4)中，所述Grace完全培養(yǎng)基配方為Grace液體培養(yǎng)基+10％Gibco FBS+20萬單位/升的青霉素和鏈霉素混合液。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明通過雙酶切驗證重組報告基因穿梭載體Red-pFastBac1-let-7-C，通過Tn7同源重組把let-7-C和報告基因轉(zhuǎn)座到家蠶核型多角體病毒BmNPV基因組上，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒BmNPV-let-7-C。將BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細胞系BmE，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染不同時間后細胞中的紅色熒光蛋白信號，以熒光定量PCR檢測重組桿狀病毒在不同時間點的增殖和miRNA的表達。離心收集轉(zhuǎn)染72h后的BmE細胞上清液，用于侵染新鮮的BmE細胞，以獲取具有強感染力的重組病毒上清，將其注射至家蠶五齡起蠶，分別在12h、24h和72h取幼蟲組織,檢測miRNA的表達。成功將let-7-C構(gòu)建到BmNPV基因組上，獲得BmNPV-let-7-C過表達載體。BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細胞系BmE，24h后觀察到紅色熒光信號；72h時，熒光信號最強，重組桿狀病毒的拷貝數(shù)也達最高。將重組病毒上清注射至家蠶五齡起蠶，24h后取整蠶和脂肪體檢測，bmo-miR-2795顯著超量表達。利用家蠶核型多角體病毒表達載體在家蠶胚胎細胞系BmE和家蠶脂肪體組織中過量表達了let-7簇miRNA，為后續(xù)研究家蠶miRNA的功能提供了可能。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1家蠶let-7-C重組桿狀病毒表達載體構(gòu)建；A：Rp-let-7-C重組質(zhì)粒雙酶切驗證。M：TH5000DNA ladder；1：Rp-let-7-C重組質(zhì)粒雙酶切；B：BmNPV-let-7-C菌液PCR驗證。M：1kb Ladder DNA marker(購自Promega)；1：BmNPV-let-7-C的PCR產(chǎn)物；

圖2重組桿狀病毒感染BmE細胞后Red報告基因信號檢測：A-F：重組桿狀病毒BmNPV-let-7-C上清液感染BmE細胞分別12h、24h、48h、72h、96h和120h，72h未處理的BmE細胞(WT)；H：陰性對照BmNPV上清液感染BmE細胞72h，I：重組桿狀病毒BmNPV-let-7-C上清液感染BmE細胞72h，J：gp41是BmNPV糖蛋白基因，用以檢測病毒DNA拷貝數(shù)；GAPDH是甘油醛-3-磷酸脫氫酶，作為病毒感染家蠶后的內(nèi)參基因；

圖3 BmNPV桿狀病毒表達載體在細胞水平對let-7簇miRNA的過量表達：A：BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞48h后bmo-let-7的表達；B：BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞48h后bmo-miR-100的表達；C：BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞48h后bmo-miR-2795的表達；E：BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞72h后bmo-let-7的表達；F：BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞72h后bmo-miR-100的表達；G：BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞72h后bmo-miR-2795的表達

圖4 BmNPV桿狀病毒表達載體在個體水平對let-7簇miRNA的過量表達：A：BmNPV-let-7-C注射后72h的整蠶中bmo-let-7的表達；B：BmNPV-let-7-C注射后72h的整蠶中bmo-miR-100的表達；C：BmNPV-let-7-C注射后72h的整蠶中bmo-miR-2795的表達；D：BmNPV-let-7-C注射后72h的脂肪體中bmo-let-7的表達；E：BmNPV-let-7-C注射后72h的脂肪體中bmo-miR-100的表達；F：BmNPV-let-7-C注射后72h的脂肪體中bmo-miR-2795的表達；G：BmNPV-let-7-C注射后24h的脂肪體中bmo-let-7的表達；H：BmNPV-let-7-C注射后24h的脂肪體中bmo-miR-100的表達；I：BmNPV-let-7-C注射后24h的脂肪體中bmo-miR-2795的表達；J：BmNPV-let-7-C注射后12h的脂肪體中bmo-miR-2795的表達；K：BmNPV-let-7-C注射后24h的中腸組織中bmo-miR-2795的表達。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例

(1)總RNA與重組Bacmid全基因組DNA提?。河肨rizol提取細胞和組織總RNA，以核酸濃度測定儀(NANODROP2000C)測定RNA濃度和純度，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。離心收集重組Bacmid感染BmE細胞后不同時間點的細胞上清液(含重組病毒)，提取重組病毒DNA，操作步驟詳見MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書，用核酸濃度測定儀測定DNA濃度和純度。

(2)引物設(shè)計：從miRbase(http：//www.mirbase.org/)下載bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795的成熟體序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載家蠶gapdh基因序列和BmNPV的糖蛋白gp41基因序列，運用Primer 5.0軟件設(shè)計gapdh和gp41的熒光定量PCR引物(表1)。

表1本研究所用引物

(3)miRNA重組桿狀病毒的構(gòu)建：劃線復(fù)蘇Red-pFastBac1-let-7-C(RP-let-7-C)永久菌，挑取單菌落后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Not I和Xho I雙酶切驗證重組報告基因載體。取20μL RP-let-7-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μL E.coli DH10Bac/BmNPV感受態(tài)細胞，冰浴30min，42℃熱激90s，37℃水平搖床搖1h后，取100μL細菌懸液涂布在“卡那霉素(50μg·mL^-1)-四環(huán)素(10μg·mL^-1)-慶大霉素(50μg·mL^-1)-IPTG(40μg·mL^-1)-X-gal(100μg·mL^-1)”的LB固體平板上，37℃過夜培養(yǎng)，通過藍白斑篩選出Tn7轉(zhuǎn)座成功的重組桿狀病毒BmNPV-let-7-C，以M13引物PCR驗證陽性克隆，送華大基因測序鑒定。

由于BmNPV基因組上含有一個與pFsatBac1穿梭載體上Tn7同源重組的mini-attTn7結(jié)合位點，且E.coli DH10Bac/BmNPV感受態(tài)細胞中的helper質(zhì)粒能夠促進Tn7的同源重組，使目的基因高效地與BmNPV基因組完成整合。用Not I和Xho I雙酶切重組報告基因載體RP-let-7-C(圖1-A)，提取RP-let-7-C質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac/BmNPV感受態(tài)細胞。以BmNPV基因組上mini-attTn7兩端的M13F/R作為PCR擴增引物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測到5,624bp目的條帶(圖1-B)。

(4)重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染BmE細胞系：37℃水浴快速解凍復(fù)蘇家蠶胚胎細胞系BmE，用Grace完全培養(yǎng)基(Grace液體培養(yǎng)基+10％Gibco FBS+20萬單位/升的青霉素和鏈霉素混合液)在27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)良好，細胞密度達2-5×10⁶cells·mL^-1時，重懸細胞將其均勻鋪至24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，吸去完全培養(yǎng)基，每孔加入400μL無抗、無血清的Grace培養(yǎng)基。以不加處理的BmE細胞作為空白對照組(WT)，非重組病毒BmNPV處理的BmE細胞為陰性對照組(BmNPV)，重組病毒處理的BmE細胞為實驗組(BmNPV-let-7-C)。用8μL轉(zhuǎn)染試劑X-treme分別包埋1μg的BmNPV和BmNPV-let-7-C質(zhì)粒，再加入100μL無抗、無血清的Grace培養(yǎng)基，瞬離混勻后室溫孵育20min。將混合液緩慢滴入細胞孔中央，順時針輕搖細胞板使混合液均勻分布于細胞板內(nèi)，27℃培養(yǎng)6-8h后更換成完全培養(yǎng)基。通過OLYMPUS倒置熒光顯微鏡觀察細胞的紅色熒光蛋白信號。

當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑包裹病毒Bacmid進入BmE細胞后，在72h可觀察到一定強度的紅色熒光蛋白信號，離心收集72h的細胞上清液以獲取具有侵染活性的病毒粒子，用其直接感染新培養(yǎng)的BmE細胞。在倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)重組Bacmid感染BmE后，在12h、24h、48h、72h和96h時，細胞中的紅色熒光蛋白信號由漸強到漸弱(圖2-A-2-F)，72h的紅色熒光蛋白信號最強。熒光信號的強弱間接反映了細胞中病毒的增殖狀態(tài)，載體上的let-7簇miRNA也可能隨著病毒的增殖而高量表達(圖2-G-2-I)；但是，隨著感染時間的延長，病毒的大量累積導(dǎo)致細胞的營養(yǎng)與能源物質(zhì)嚴重損耗，細胞從梭形變成圓形，并逐漸破裂，從而使病毒的增殖和生長受到抑制，紅色熒光蛋白信號也越來越弱。

為了進一步證實重組病毒在細胞中增殖，我們提取了重組Bacmid感染BmE后12h、24h、48h、72h、96h和120h的病毒DNA，用qPCR進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)病毒DNA量從12h開始不斷增加，在72h時達最大值，隨后逐漸降低，120h的表達水平顯著低于48h(圖2-J)，病毒DNA量的變化反映了病毒的增殖變化，這與熒光信號的變化一致。

為了檢測載體上的miRNA是否伴隨著病毒增殖而過量表達，我們提取了重組Bacmid感染BmE后12h、24h、48h、72h、96h和120h的細胞總RNA，qPCR檢測結(jié)果表明48h的let-7、miR-100和miR-2795均顯著性超量表達(圖3-A和3-C)。感染后48h的WT組和BmNPV陰性對照組之間無顯著變化(圖3-A和3-C)，但72h的BmNPV組和WT之間卻有明顯的差異，let-7、miR-100和miR-2795表達量明顯低于WT組(圖3-D和3-F)miRNA。

(5)重組桿狀病毒BmNPV注射家蠶幼蟲在BmNPV-let-7-C轉(zhuǎn)染BmE細胞72h后，可觀察到明顯的紅色熒光，通過5,000rpm/5min離心收集含病毒粒子的細胞上清液。然后分別用BmNPV和BmNPV-let-7-C病毒上清液感染新鮮鋪板的BmE細胞，倒置熒光顯微鏡觀察病毒感染細胞后12h、24h、48h、72h、96h和120h的細胞紅色熒光蛋白信號。離心收集上述時間點的細胞材料，細胞上清液用于提取病毒DNA檢測病毒拷貝數(shù)，細胞沉淀用PBS清洗后，加入Trizol裂解細胞用于提取RNA檢測miRNA表達。當(dāng)BmNPV-let-7-C病毒上清感染BmE細胞72h后，離心獲取具強侵染活性的病毒上清液，采用TCID₅₀和qPCR測定病毒滴度后，注射等量病毒至家蠶五齡起蠶，用消毒后的桑葉在25℃室溫下正常飼養(yǎng)，觀察幼蟲生長變化。取注射后24h和72h的幼蟲中腸、脂肪體和整蠶，液氮研磨后取約100μg粉末，加入1mL Trizol充分混勻以完全裂解組織細胞，提取RNA用于qPCR檢測miRNA的表達。

(6)熒光定量PCR檢測miRNA的表達：用Trizol提取BmE細胞和家蠶組織總RNA，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。參照試劑盒說明書和我們前面所用的方法進行qPCR檢測。miScript II RT Kit反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于miRNA定量檢測。重組Bacmid基因組DNA測定濃度后，將其稀釋到200ng·μL^-1用于qPCR檢測，即在20μL熒光定量PCR體系中加入2μL DNA模板。

BmNPV桿狀病毒過表達載體在家蠶個體中是否也能實現(xiàn)miRNA的過量表達？為此，我們分別收集了注射重組病毒的實驗組(BmNPV-let-7-C)和注射非重組病毒的陰性對照組(BmNPV)感染BmE細胞72h后的細胞上清液，采用TCID₅₀和qPCR共同測定到上清液中的病毒滴度分別為1.09×10⁷PFU·mL^-1和1.14×10⁷PFU·mL^-1，分別注射5μL到家蠶五齡起蠶。無任何處理的空白對照組(WT)、陰性對照組和實驗組的幼蟲分別隔離飼養(yǎng)于25℃培養(yǎng)箱中。注射后第3天，發(fā)現(xiàn)BmNPV組和BmNPV-let-7-C組的幼蟲不進食、節(jié)間凸起、體壁破裂并伴有純白色膿血流出，在注射后第4天死亡；而WT組正常進食、上簇吐絲和化蛹。qPCR檢測結(jié)果表明，注射后72h的整蠶中，let-7表達量無顯著差異(圖4-A)，miR-100的表達量只相對于WT組過量表達，與陰性對照組沒有顯著性差異(圖4-B)；而miR-2795顯著性過量表達(圖4-C)，且過表達倍數(shù)高達40多倍。然而在72h的脂肪體組織中，陰性對照組與實驗組的let-7、miR-100和miR-2795的表達量均受到顯著性抑制(圖4-D和4-F)，這可能是因為在發(fā)病的第三天，病毒已在脂肪體中大量增殖，脂肪體被病毒損壞，基因的表達平衡被打破，從而使let-7簇miRNA的表達受到抑制。在24h的脂肪體組織中，miR-2795顯著性超量表達(圖4-I)，let-7和miR-100呈上調(diào)趨勢(圖4-G和4-H)，WT組和BmNPV病毒注射組無明顯差異，這說明BmNPV病毒在感染的早期還沒有對家蠶幼蟲的生長發(fā)育造成明顯破壞。脂肪體作為家蠶營養(yǎng)和能量的儲備場所，有利于病毒載體的增殖，從而達到高效表達外源基因的目的。因此，我們?nèi)×俗⑸浜?2h的脂肪體組織，qPCR檢測結(jié)果顯示bmo-miR-2795的表達量并無顯著差異(圖4-J)，這也說明了病毒的復(fù)制增殖需要一定的時間。雖然bmo-miR-2795在24h的脂肪體中都能實現(xiàn)超量表達，但在24h的中腸組織中其表達量卻無顯著性差異(圖4-K)。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。