專利名稱：蜜柑萎縮病毒rt-pcr檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種PT-PCR檢測方法及其檢測用試劑盒，具體的說，涉及一種溫州蜜 柑萎縮病毒的RT-PCR檢測方法及試劑盒
背景技術(shù)：
溫州蜜柑萎縮病是日本溫州蜜柑生產(chǎn)上的重要病害，自從1937年發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng) 遍及各個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)。20世紀(jì)80年代以來，我國研修人員從日本攜帶溫州蜜柑優(yōu)良品種回國 時(shí)無意中將該病帶入浙江黃巖、重慶奉節(jié)和江蘇吳縣。該病可通過嫁接、汁液和土壤傳播， 并通過苗木運(yùn)輸進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，可以危害幾乎所有的柑橘屬及近緣屬的植物。但溫州蜜 柑表現(xiàn)癥狀明顯、受害嚴(yán)重。目前的防治方法主要是檢測無病毒母樹、推廣無病毒苗木，并 挖除病樹。該病由溫州蜜柑萎縮病毒(Satsurm dwarf virus, SDV)引起。SDV為雙分體病 毒，包含兩條正單鏈RNA分子RNAl和RNA2，是豇豆花葉病毒科，線蟲傳多面體病毒屬 的暫定成員。由于多數(shù)寄主植物受侵染后不表現(xiàn)明顯癥狀，病原檢測顯得更為重要。傳統(tǒng) 的檢測方法是指示植物鑒定，主要用白芝麻，可以檢測到春梢嫩葉中的病毒。但是，白芝麻 檢測季節(jié)性強(qiáng)、周期長、癥狀易混淆，而且在檢測過程中需要有溫室做配套設(shè)施。血清學(xué)檢 測SDV，受季節(jié)和寄主部位的影響，只能檢測嫩組織中的病毒，檢測不到老葉和老枝皮中的 病毒。RT-PCR檢測快速、靈敏，可以實(shí)現(xiàn)病害的早期診斷，2003年日本下存克己等建立 了 SDV的RT-PCR檢測技術(shù)體系，但其靈敏度與ELISA相差不大，到目前為止，SDV的RT-PCR 檢測還處于初級階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的不足之處，提供一種檢測溫州蜜柑 萎縮病毒的特異性強(qiáng)、靈敏度高的RT-PCR檢測方法，并在此基礎(chǔ)上研制SDV的RT-PCR檢測 試劑盒，適合大規(guī)模、高通量樣品檢測。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明從已經(jīng)報(bào)道的溫州蜜柑病毒的所有引物對中篩選出 一對特異性引物，堿基序列為
上游引物5’ -GGGAGATGATAGGAGCA-3’ 下游引物5’ - AGAGAGATTTCTACTCGCA-3，。本發(fā)明的目的通過如下措施來實(shí)現(xiàn)
(1)核酸提取
取適量SDV寄主植物的葉或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取樣品總核酸或
RNA ；
(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
所用引物為SDV特異性下游引物5，- AGAGAGATTTCTACTC GCA-3 ’，反應(yīng)體系5u 1，包括核酸抽提液 1. O μ L, 10 XbufferO. 5 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 0. 5 μ L, 10mmol/L 的 dNTPO. 5yL ，10 μ mol/L 引物 0. 5 μ L，40U/μ LRNAsinO. 1 μ L, 200U/μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 2 μ L,超純水 1. 7 μ L，42 °C溫育 30min ；
(3)擴(kuò)增反應(yīng)
所用特異性上、下游引物分別為5’ -GGGAGATGATAGGAGCA-3’、5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3，；反應(yīng)總體積為25 μ L包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液5 μ L、10 Xbuffer2y L, 25mmol/L 的 MgCl2 1. 5μ L，10 μ mol/L 的 SDV 上游引物 0· 5 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L,超純水 15. 6μ L ；反應(yīng)條件 94 "C 4min, 94 "C 15 s, 63 "C 15 s, 72 °C 20 s, 5個(gè)循環(huán)；62 °C，5個(gè)循環(huán)；61 °C，5個(gè)循環(huán)；60 °C，10個(gè)循環(huán)； 59 "C，10 個(gè)循環(huán)；72 "C IOmin ； (4)電泳圖譜獲得
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色、獲取電泳圖譜；
(5)SDV的診斷
依據(jù)上述圖譜的條帶特征診斷SDV的分子變異類型。參見圖1，泳圖譜中如出現(xiàn)251bp 擴(kuò)增條帶，表明該樣品中存在溫州蜜柑萎縮病毒，如果沒有出現(xiàn)251bp擴(kuò)增條帶，表明該樣 品中不存在溫州蜜柑萎縮病毒。在上述技術(shù)方案中所述步驟(1)的提取方法為稱取SDV病毒寄主不同位置處的 嫩葉各5啤，裝入一無菌離心管中，在液氮中研磨后依次加入60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽 和酚氯仿異戊醇(體積比為25 24 :1)，混勻；70°C水浴5 10分鐘。室溫下13000rpm離 心5分鐘，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G_50_80構(gòu)成的微柱中，置于一新的無菌離 心管，5000rpm離心4分鐘，收集洗脫液。本發(fā)明的檢測溫州蜜柑萎縮病毒的檢測試劑盒由以下試劑構(gòu)成緩沖液A、RT酶、 Taq酶、SDV正對照、緩沖液B和雙蒸水；其中，其中緩沖液A含10 μ mol/L溫州蜜柑萎縮病 毒特異性下游引物5，- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3， 、10 Xbuffer, 25mmol/L 的 MgCl2, IOmmol/L的dNTP 、40U/ μ LRNAsin和超純水；緩沖液B含10 μ mol/L溫州蜜柑萎縮病毒 特異性上游引物5，-GGGAGATGATAGGAGCA-3，、10 Xbuffer、25mmol/L 的 MgCl2 和超純 水。單樣用量的緩沖液A含Ιθμπιο /L溫州蜜柑萎縮病毒特異性下游引物5’ -AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’ 0. 5μ L, 10 XbufferO. 5 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 0. 5 μ L, 10mmol/L 的 dNTPO. 5 μ L ，40U/ μ LRNAsinO. 1 μ L,超純水 1. 7 μ L ；單樣用量的緩沖液 B 含10 μ mol/L溫州蜜柑萎縮病毒特異性上游引物5’ -GGGAGATGATAGGAGCA-3，0. 5 μ L, 10 Xbuffer 2 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 L 5 μ L，超純水 15. 6 μ L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1)實(shí)用性強(qiáng)，傳統(tǒng)的檢測方法不論是白芝麻檢測還是血清學(xué)檢測，只能檢測到春梢嫩 葉中的病毒，受季節(jié)和寄主部位影響很大，無法檢測到老葉和老樹皮中的病毒；而本發(fā)明可 以直接從SDV寄主植物的葉或皮中檢測出SDV病毒，不受季節(jié)和寄主部位的限制；
(2)速度快，操作簡便，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，靈敏度高，從樣品制備到獲檢測結(jié)果圖譜 可在一天之內(nèi)完成，同一樣品的不同檢測批次，不同人員操作，其結(jié)果一致性強(qiáng)，適合大規(guī) 模、高通量的樣品分析，一次可處理樣品幾十個(gè)。


圖1是本發(fā)明檢測結(jié)果示意M DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；從左到右的電泳帶為1-2 陰性對照；3-8 溫州蜜柑萎縮病毒樣 品(陽性，有251bp特征性條帶)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所使用的術(shù)語“PCR”又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通常需要獲得感興趣區(qū)域 端或其外延的序列信息，從而可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物；這些引物應(yīng)與待擴(kuò)增模板相反鏈 的序列相同或相似，兩個(gè)引物的5’端核苷酸可以與擴(kuò)增材料的兩端恰好重合，PCR技術(shù) 可用來擴(kuò)增全部基因組DNA中的、從全細(xì)胞RNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 中的待定 RNA 序列、待定 DNA 序列。見 Mullis 等，Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 51. 263(1987)。RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄 RCR (reverse transcription PCR)逆轉(zhuǎn)錄 PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的 變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)
+飽
+曰οTES緩沖液指三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸生物緩沖液。DEPC水指用DEPCWiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓 消毒的MiliQ純水。dNTP 指，deoxy-ribonucleoside triphosphate (三磷酸脫氧核糖核苷)。實(shí)施例1 溫州蜜柑萎縮病毒RT-PCR檢測方法 (1) 核酸提取
稱取SDV病毒寄主不同位置處的嫩葉各5啤，裝入一無菌離心管中，在液氮中研磨后依 次加入60μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇(體積比為25 24 :1)，混勻。70°C水 浴5 10分鐘。室溫下13 OOOrpm離心5分鐘，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G-50-80 構(gòu)成的微柱中，置于一新的無菌離心管，5 OOOrpm離心4分鐘，收集洗脫液。(2)逆轉(zhuǎn)錄
在0. 5mL PCR反應(yīng)管中加入1. OyL抽提液，1. 0 μ L超純水，95°C變性5min，迅 速置于冰水中，加入 0. 5yL 10 X buffer, 0. 5 μ L MgCl2 (25mmol/L)，0· 5μ L dNTP (10mmol/L)，0. 5μ L 特異性下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)，2. 52U RNAsin, 25U M2MLV RTase,補(bǔ)超純水至5 μ L。在Biometra公司Tl PCR儀上42 °C溫育30min。反轉(zhuǎn)錄后， 將PCR管迅速置冰水中。(3)擴(kuò)增反應(yīng)
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液中加入2μ L 10 Xbuffer, 1. 5μ L MgCl2 ( 25mmol/L )，0. 5 μ L特異性上游引物(ΙΟμπιοΙ/L )，Taq DNA 聚合酶 0. 4μ L ( 5U / μ L, Promega ) ，反應(yīng)總體積為 25 μ L。運(yùn)行 Touchdown PCR, 94 "C 4min, 94 "C 15 s, 63 "C 15 s, 72 。C 20 s, 5個(gè)循環(huán)；62 °C，5個(gè)循環(huán)；61 °C，5個(gè)循環(huán)；60 °C，10個(gè)循環(huán)；59 "C，10 個(gè)循環(huán)；72 "C IOmin。
(4)電泳及圖譜獲取
配制2%瓊脂糖凝膠，將上步反應(yīng)混合液5 μ L與3 μ L染料混勻后點(diǎn)樣，同時(shí)點(diǎn)5 μ L的 DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker。電泳條件為初始電壓150V，10分鐘；后續(xù)電壓100V，30分鐘。電泳完畢 后EB染色15分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中獲取酶切圖譜。(5) SDV 的診斷
檢測結(jié)果如圖1所示，通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker比較可以估計(jì)出圖譜中各條帶的大小， 從而可以判定8個(gè)SDV樣品中6個(gè)為陽性。實(shí)施例2 檢測溫州蜜柑萎縮病毒的檢測試劑盒 試劑盒由以下試劑組成(100樣份)
權(quán)利要求
一種蜜柑萎縮病毒的RT PCR檢測方法，其特征在于以溫州蜜柑萎縮病毒特異性上游引物、溫州蜜柑萎縮病毒特異性下游引物對待測樣品進(jìn)行RT PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定；所述溫州蜜柑萎縮病毒特異性引物為上游引物5’ GGGAGATGATAGGAGCA 3’下游引物5’ AGAGAGATTTCTACTCGCA 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蜜柑萎縮病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)核酸提取，取適量SDV寄主植物的葉或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取 樣品總核酸或RNA ；(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所用引物為SDV下游引物5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’，反應(yīng)體系 5ul，包括核酸抽提液 1. 0μ L，10 X bufferO. 5 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 0. 5 μ L, 10mmol/L 的 dNTPO. 5 μ L, 10 μ mo 1/LSDV 下游引物 0. 5 μ L, 40U/ μ LRNAsinO. 1 μ L, 200U/ μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 2 μ L，超純水 1· 7 μ L，42°C溫育 30min ；(3)擴(kuò)增反應(yīng)，所用上、下游引物分別為5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、 5，-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3，；反應(yīng)總體積為25 μ L包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液5 μ L、 10Xbuffer2 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 L 5 μ L，10 μ mol/L 的 SDV 上游引物 0. 5 μ L, Taq DNA 聚合酶 0. 4yL，超純水 15. 6yL;反應(yīng)條件 94°C 4min，94°C 15s，63°C 15s，72°C 20s，5 個(gè) 循環(huán)；62°C，5個(gè)循環(huán)；61 °C，5個(gè)循環(huán)；60°C，10個(gè)循環(huán)；59°C，10個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；(4)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色、獲取電泳圖譜；(5)依據(jù)上述圖譜的條帶特征診斷SDV的分子變異類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述蜜柑萎縮病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述步驟(1) 的提取方法為稱取SDV病毒寄主不同位置處的嫩葉各5mg，裝入一無菌離心管中，在液氮 中研磨后依次加入60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚、氯仿和異戊醇溶液混勻，所述溶液體 積比為酚氯仿異戊醇為25 24 1，70°C水浴5 10分鐘；室溫下13000rpm離心5 分鐘，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G_50_80構(gòu)成的微柱中，置于一新的無菌離心管， 5000rpm離心4分鐘，收集洗脫液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述蜜柑萎縮病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述溫州蜜柑 萎縮病毒特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為251bp。
5.一種檢測蜜柑萎縮病毒的檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒由以下試劑構(gòu)成 緩沖液A、RT酶、Taq酶、SDV正對照、緩沖液B和雙蒸水；其中緩沖液A由10 μ mol/L溫州 蜜柑萎縮病毒特異性下游引物5，-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3MOXbuffer,25mmo 1 /L 的 MgCl2, IOmmol/L的dNTP、40U/ μ LRNAsin和超純水組成；緩沖液B由10 μ mol/L溫州蜜柑萎 縮病毒特異性上游引物5，-GGGAGATGATAGGAGCA-3，、10Xbuffer、25mmol/L 的 MgCl2 和超 純水組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測蜜柑萎縮病毒的檢測試劑盒，其特征在 于單樣用量的緩沖液A含10 μ mol/L溫州蜜柑萎縮病毒特異性下游引物 5' -AGAGAGATTTCTACTCGCA-3‘ 0. 5 μ LUOXbufferO. 5μ L,25mmol/L 的 MgCl2O. 5 μ L, 10mmol/L 的 dNTPO. 5 μ L、40U/ μ LRNAsinO. 1 μ L，超純水 1. 7 μ L ；單樣用量的緩沖液 B 含ΙΟμπιοΙ/L溫州蜜柑萎縮病毒特異性上游引物5’ -GGGAGATGATAGGAGCA-3’ 0. 5 μ L、 IOXbuffer 2 μ L、25mmol/L 的 MgCl2 1. 5 μ L 和超純水 15. 6 μ L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測溫州蜜柑萎縮病毒的RT-PCR檢測方法和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法通過提取核酸、應(yīng)用溫州蜜柑萎縮病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及電泳來判斷檢測樣品中是否存在溫州蜜柑萎縮病毒電泳圖譜中如出現(xiàn)251bp特征性條帶，表明該樣品中存在溫州蜜柑萎縮病毒，如果沒有出現(xiàn)251bp特征性條帶，表明該樣品中不存在溫州蜜柑萎縮病毒。本發(fā)明還相應(yīng)地建立了檢測試劑盒，可特異、靈敏、高效地檢測溫州蜜柑萎縮病毒，適用于田間樣品檢測、溫州蜜柑萎縮病毒流行監(jiān)控、脫毒苗木鑒定等多種用途。
文檔編號C12Q1/68GK101948935SQ20101028082
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者周常勇, 周彥, 宋震, 李中安, 楊方云, 王雪峰, 高艷玲 申請人:西南大學(xué)