專利名稱：一種重組人細(xì)胞靜息因子mhd融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組融合蛋白的表達(dá)，特別涉及一種重組人細(xì)胞 靜息因子MHD融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞靜息因子(Restin)是1999年由zhu等人克隆得到的一個屬于黑色素瘤相關(guān) JfiJ^ (melanoma associated antigen, MAGE)胃方矣白勺§ ]^員。Restin1475bp，IS 碼219個氨基酸，基因產(chǎn)物在不同的細(xì)胞系中定位不同，胞漿和細(xì)胞核中都有表達(dá)。Restin蛋白N末端8_25位氨基酸為一個典型的二分裂核定位信號序列，42-52位 氨基酸為casein kinase II磷酸化位點，該位點的磷酸化對于Restin蛋白的核定位也有 影響；88-176位氨基酸為MAGE家族同源結(jié)構(gòu)域MHD，該結(jié)構(gòu)域理論pi值為9. 99，因此將 Restin蛋白定位為堿性MAGE蛋白。研究認(rèn)為，Restin與細(xì)胞周期分化相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Restin觀察細(xì)胞生長周 期，發(fā)現(xiàn)G1期阻滯，提示其可能參與細(xì)胞分化進(jìn)程。文獻(xiàn)表明，Restin的高度同源蛋白 Necdin也具有細(xì)胞生長周期阻滯的生物學(xué)功能的，而其MHD中的191-222位氨基酸對細(xì)胞 的生長抑制起至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)序列比對發(fā)現(xiàn)，Restin的另一個同源蛋白MAGE-Dl 的MHD中也含有該序列，說明該序列在進(jìn)化上高度保守；并且對于MAGE-Dl的研究發(fā)現(xiàn)，其 也參與細(xì)胞的分化進(jìn)程。而Restin MHD中的92-122位氨基酸與該保守序列的同源性為 48 %，提示其在Restin產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯過程中有重要作用。鑒于Restin重要的生物學(xué)功能，獲得高純度有活性的Restin蛋白，可作為抑制腫 瘤細(xì)胞周期的基因藥物，具有應(yīng)用于腫瘤治療的前景。而由于restin基因的mRNA 二級結(jié) 構(gòu)復(fù)雜，不利于原核系統(tǒng)的外源表達(dá)；且Restin全長蛋白的分子量較大，為24. 4kD，也會影 響后期基因藥物的效率；此外，Restin-MHD多肽可以針對Π類MAGE分子，較Restin具有更 廣泛的靶效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白及其制備方 法，對Restin的黑色素瘤相關(guān)抗原同源結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并驗證了該融合蛋白對 腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)解決方案來實現(xiàn)一種重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白，包括人細(xì)胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域，在人細(xì) 胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域的N端還依次連接有純化標(biāo)記序列、凝血酶和腸激酶酶切位點，以及 Nus序歹丨J。所述的人細(xì)胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的純化標(biāo)記序列為6XHis的標(biāo)記序列。所述的重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
一種表達(dá)重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白的原核表達(dá)載體，該原核表達(dá)載體為 pETAAaw-Restin-mD，是通過Bam Hi/Hind III酶切位點將如SEQ. ID. NO. 3所示的人細(xì)胞靜 息因子MHD基因片段，克隆入pET44a(+)表達(dá)載體。一種重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白的制備方法，包括以下步驟1)以包含完整人Restin基因編碼框的cDNA為模板，以引物對P作為引物，PCR擴(kuò) 增人Restin-·基因片段，所述的引物對P為上游弓I物 Plgaaaagtctc ct ；下游弓I物 P2 :cccaagcttg actttcagtt tgc ；2)將PCR擴(kuò)增的人Restin-MHD基因片段用Bam Hi/Hind III雙酶切得到帶粘性 末端的片段；并將該片段與Bam Hi/Hind III雙酶切的pET44a(+)載體連接得到表達(dá)載體 pET44a(+)-Restin-MHD ；3)將表達(dá)載體pET44a(+)-ReStin-·轉(zhuǎn)染到感受態(tài)的大腸桿菌，篩選得到目的基因 表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)化子；4)將陽性轉(zhuǎn)化子在37°C恒溫箱培養(yǎng)12h后挑取邊緣整齊、生長狀態(tài)良好的菌 落，接種于含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，搖床37°C培養(yǎng)過夜；次日以1 100 的體積比接種于新鮮的含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密 度達(dá)到OD6tltl = 0. 4 0. 6，加入0. 1 2. 5mM濃度的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，使得表達(dá)載體 pET44a(+)-Restin-MHD得到表達(dá)，然后離心收集細(xì)菌；5)按10mL/g細(xì)菌沉淀的比例加入裂解液，重懸細(xì)菌，在冰浴下超聲裂菌，然后離 心分離，并收集上清；所述的裂解液為pH 8. 5、濃度50mmol/L的Tris · Cl，5mmol/L的β -巰基乙醇和 lmmol/L的PMSF的混合溶液；6)將收集的上清上樣于金屬螯合親和層析柱，用10倍柱體積的緩沖液A洗柱以 0. 5mL/min的流速洗脫，然后用2倍柱體積的緩沖液B洗柱，最后用緩沖液C洗脫結(jié)合蛋白， 收集洗脫峰；所述的緩沖液8. 5、濃度 20mmol/L 的 Tris .Cl，100mmol/L 的 KC1，5mmol/L 的β _巰基乙醇和20mmol/L的咪唑的混合溶液；所述的緩沖液B為pH 8. 5、濃度20mmol/L 的Tris · Cl，lmol/L的KCl和5mmol/L的β -巰基乙醇的混合溶液；所述的緩沖液C為pH
8.5、濃度 20mmol/L 的 Tris · Cl, IOOmmol/L 的 KCl，5mmol/L 的 β -巰基乙醇和 100mmol/L 的咪唑的混合溶液；將收集的洗脫峰上樣于離子交換層析，用洗脫液D洗脫結(jié)合的蛋白，收集洗脫峰， 得到純化的重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白；所述的洗脫液D為pH 7. 4、濃度50mmol/L的Tris · Cl和lmmol/LNaCl的混合溶 液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、由于Restin為堿性蛋白質(zhì)，其理論pi值為9. 05，Restin結(jié)構(gòu)域理論P(yáng)I值為
9.99，從而決定了此蛋白較難表達(dá)。而本發(fā)明通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pETA^M-Restin-·， 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)之后分離純化得到具有Restin融合蛋白的重組人細(xì)胞靜 息因子MHD結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，該融合蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞周期的生物活性，對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞周期的阻滯作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET44a(+)-ReStin-·是在克隆人Restin-MHD基因結(jié) 構(gòu)域的基礎(chǔ)上，通過Bam Hi/Hind III雙酶切位點克隆入表達(dá)載體pET44a(+)，連接能夠被凝 血酶和腸激酶識別的序列，而且構(gòu)建的Restin-MHD融合蛋白還包含6XHis的純化標(biāo)記序 列，這樣便于融合蛋白的純化；并且在必要的時候通過凝血酶和腸激酶的限制性酶切反應(yīng) 可以去除標(biāo)記序列，從而能夠得到Restin-·多肽。Restin-·多肽可以針對Π類MAGE分 子，較Restin具有更廣泛的靶效應(yīng)。該融合蛋白利用原核大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，具有經(jīng)濟(jì)，易于擴(kuò)大培養(yǎng)的優(yōu)勢，融 合蛋白促使表達(dá)量大大增加，純化標(biāo)簽易于純化，產(chǎn)量高，純度高都是該融合蛋白的優(yōu)勢。


圖1是PCR擴(kuò)增獲得Restin-·基因片段的電泳檢測圖；圖2是pET44a(+)載體的質(zhì)粒圖譜；圖3是pETAAa^-Restin-^ 表達(dá)載體的BamH I和Hind III雙酶切鑒定電泳圖；圖4是SDS-PAGE檢測Restin-·融合蛋白表達(dá)的結(jié)果圖；圖5是Western Blot檢測Restin-·融合蛋白可溶性表達(dá)的結(jié)果圖；圖6是SDS-PAGE檢測Restin-·融合蛋白純化后的結(jié)果圖；圖7是流式細(xì)胞術(shù)檢測Restin-·融合蛋白對Hela腫瘤細(xì)胞周期抑制的結(jié)果圖；圖8是Restin-·融合蛋白刺激Hela腫瘤細(xì)胞與正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長曲線 圖。
具體實施例方式本發(fā)明通過生物技術(shù)實現(xiàn)重組人Restin黑色素瘤相關(guān)抗原同源結(jié)構(gòu)域的制備， 通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET44a (+) -Restin-^,并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌獲得轉(zhuǎn)化體，再對大腸桿 菌轉(zhuǎn)化體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化后得到Restin黑色素瘤相關(guān)抗原同源結(jié)構(gòu)域融合蛋白。 對Restin結(jié)構(gòu)域融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，其分子量結(jié)果一致；而生 物活性驗證表明，Restin結(jié)構(gòu)域融合蛋白對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞周期阻滯作用。下面對本發(fā) 明做詳細(xì)的說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。1.人Restin-MHD基因的克隆在GenBank中查找人Restin基因(匪014061)，利用生物信息學(xué)同源比較認(rèn)為其 黑色素瘤相關(guān)抗原結(jié)構(gòu)域為88 176aa。根據(jù)其mRNA核苷酸序列，設(shè)計并人工合成特異性 引物P，將BamHI和Hind III引入Restin-腦編碼序列的兩端；引物P具體為上游弓I物 Pl :cg￡g^￡aa gaaaagtctc ct 22;下游弓丨物 P2 :cccaaRcttR actttcaRtt tRC 23;利用ΙμΜ ATRA(全反式維甲酸)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化，4天后收集細(xì)胞，利用 RT-PCR技術(shù)提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以引物P為引物，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增出含完 整 ORF (編碼框)的 Restin-MHD cDNA 序列95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s，30 個循環(huán)，72°C IOmin0膠回收擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，泳道M為DNA Marker,泳道1為280bp的兩端帶有克隆位點的Restin-·基因。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳，切膠回收后連接至PMD 18T載體，構(gòu)建pMD IST-Rmhd重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含Amp (100 μ g/mL)的平板上，37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑取單克隆 擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確后送北京奧科生物公司測序，測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. 3所示，與GenBank比對結(jié)果顯示人Restin-·基因序列克隆正確。2.表達(dá)載體pET44a⑴-Restin-·的設(shè)計與構(gòu)建為了便于人Restin-·基因的順利表達(dá)以及Restin-·融合蛋白的純化分離，本 發(fā)明選用了 pET44a(+)原核表達(dá)載體，將人Restin-·基因克隆入T7啟動子的下游，該載體 具有通過大量系統(tǒng)篩選而得到的一種過量表達(dá)時具有極高溶解性的大腸桿菌蛋白Nus. Tag 融合伴侶和標(biāo)簽，可進(jìn)一步提高重組融合蛋白的有效表達(dá)；在Nus. Tag的下游帶有編碼凝 血酶和腸激酶識別氨基酸位點的序列，這樣可對融合蛋白Restin-MHD進(jìn)行后期的標(biāo)簽的 切割；而含有的純化His標(biāo)簽，使得融合蛋白被表達(dá)之后能夠通過層析分離而純化得到。具體通過以下步驟來構(gòu)建a.載體質(zhì)粒和人Restin基因的酶切將測序正確的pMD 18T-R·質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切，并用試劑盒回收帶有 黏性末端的人Restin-·基因片段；原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pET44a(+)購于Novagen公司，其質(zhì)粒 圖譜如圖2所示，其中，T7為T7啟動子/引物位點，2426-2442bp ；Nus. Tag為=Nus標(biāo)簽蛋 白，834-2318bp ；His. Tag 為組氨酸標(biāo)簽蛋白，2325_2342bp，801_818bp 和 512_529bp ；多 克隆酶切位點為:530-724bp ；IacI為=Iac Z等位基因，2833_3915bp ；Ap為氨芐青霉素抗 藥性基因，5870-6730bp ；fl ori為fl起始位點，6852_7299bp。將原核表達(dá)載體pET44a(+) 用BamH I/Hind III雙酶切，試劑盒回收線性化質(zhì)粒大片段。b.將酶切的人Restin-·序列和回收的pET44 a(+)線性片段用T4 DNA連接酶連 接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α細(xì)胞，37°C恒溫箱培養(yǎng)12h后挑取單克隆菌落接種于含氨 卞青霉素(Amp) 100mg/L的LB培養(yǎng)液中，搖床37°C培養(yǎng)12h后收菌提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定， BamH I/Hind III雙酶切鑒定電泳結(jié)果如圖3所示，泳道1、2所示的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切得到預(yù) 期的約270bp大小的插入片段，說明人Restin-·序列正確插入到pET44a(+)載體當(dāng)中，表 達(dá)載體pETA^GPRestin- 構(gòu)建成功。3.表達(dá)載體pETA^GPRestin-^ 的轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)將重組表達(dá)載體pETA^GPRestin-·轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)感 受態(tài)細(xì)胞中，37°C恒溫箱培養(yǎng)12h后，挑取邊緣整齊、生長狀態(tài)良好的菌落，接種于含氨芐 青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，搖床37°C振蕩培養(yǎng)過夜。次日，以1 100的體積比接種 于新鮮的含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到OD6tltl = 0. 4 0. 6，加入IPTG至終濃度分別為0. 1,0. 5,1. 0,1. 5,2. 0mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，使得表 達(dá)載體pETA^GPRestin-·得到表達(dá)，然后離心收集細(xì)菌。iRestin-MHD融合蛋白的鑒定a. 10 % SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測Restin-畫融合蛋白的表達(dá)以未進(jìn)行誘導(dǎo)的pETAAaGPRestin-MHD/BI^l重組細(xì)胞作為對照，IPTG誘導(dǎo)4h 后離心收集，用裂解液溶解細(xì)菌，加入50μ1 5Χ上樣緩沖液煮沸l(wèi)Omin。取總蛋白進(jìn)行 10%的SDS-PAGE電泳。考馬斯亮藍(lán)染色后可見明顯誘導(dǎo)后的新生條帶，分子量約76kDa ；具體結(jié)果如圖4所示圖中，泳道M為蛋白質(zhì)Marker，分別為97. 2、66. 4、44. 3,29.0,20. U 14. 3kDa ；泳道1為未誘導(dǎo)的pET44a (+) -Restin-_/BL21重組細(xì)胞，泳道2 6分別為0. 1、 0. 5,1. 0,1. 5,2. OmM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h ；與其他泳道相比，泳道2 6在進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后， 產(chǎn)生分子量約76kDa的Restin-·融合蛋白。b. Restin-MHD 融合蛋白的 Western 檢測收集IPTG誘導(dǎo)后的pETA^GPRestin-^/BI^KDES)重組菌，分別提取細(xì)菌胞 質(zhì)上清和包涵體(收集細(xì)菌裂菌后離心的上清和沉淀)，WesternBlot分析融合Restin-· 蛋白的表達(dá)。在融合蛋白表達(dá)檢測的SDS-PAGE電泳結(jié)束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產(chǎn)品 說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維(NC)膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris、192mMGlycine、20%甲醇)中100V恒壓電泳60分鐘，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上；電泳結(jié) 束后，取出 NC膜，洗滌液TBST(20mM Tris_HCl，pH7. 5、150mM NaCl,0. 05% Tween-20)清洗 后浸入封閉液(含2% BSA的TBST)中室溫封閉lh，TBST室溫洗3次，每次5min ；然后加入 鼠源His標(biāo)簽抗體，室溫孵育lh，TBST室溫洗3次，每次5min ；再加入熒光素酶標(biāo)記的二抗， 室溫孵育lh，TBST室溫洗3次，每次5min，紅外蛋白掃膜儀掃膜顯示在胞質(zhì)上清和包涵體中 均可見被標(biāo)記的誘導(dǎo)后Restin-MHD融合蛋白條帶，分子量與SDS-PAGE電泳檢測一致，說明 Restin-MHD融合蛋白為可溶性表達(dá)。具體結(jié)果如圖5所示，其中，泳道M為蛋白質(zhì)Marker， 分別為 97. 2,66. 4,44. 3,29. 0,20. 1,14. 3kDa ；泳道 1 為未誘導(dǎo)的 pET44a(+)-Restin-_/ BL21重組細(xì)胞；泳道2為pET44a(+)-Restin-MHD/BL21用1. OmM IPTG誘導(dǎo)后的包涵體；泳 道3為pET44a(+)-Restin-MHD/BL21用1. OmM IPTG誘導(dǎo)后的的胞質(zhì)上清；對比泳道1、2、3 可見=Restin-MHD融合蛋白在胞質(zhì)上清和包涵體沉淀中均有表達(dá)。而根據(jù)pET44a(+)載體的表達(dá)，Restin-^融合蛋白從氨基端開始，依次含有Nus 序列、凝血酶和腸激酶酶切位點、His標(biāo)簽、MHD結(jié)構(gòu)域，含685個氨基酸，具體的氨基酸序列 如SEQ. ID. NO. 2所示，其中MHD結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；Resting融合 蛋白的理論分子量為75. 78kDa，與SDS-PAGE和Western Blot檢測一致。c. Restin- D融合蛋白的純化擴(kuò)大培養(yǎng)pET44a(+)-Restin_MHD/BL21重組菌，IPTG誘導(dǎo)后離心收集細(xì)菌，按 10mL/g 細(xì)菌沉淀加入裂解液(pH 8. 5,50mmol/L Tris · Cl，5mmol/L β -巰基乙醇，lmmol/ L PMSF)，重懸細(xì)菌，在冰浴下超聲裂菌(每次Imin, 5 10次)，12，000r/min離心IOmin, 分離上清和沉淀，將上清轉(zhuǎn)入新瓶，-20°C凍存。金屬螯合親和層析再生NI-NTA柱，緩沖液A (pH 8. 5，20mmol/LTris · Cl， 1 OOmmo 1/L KCl,5mmol/L β -巰基乙醇，20mmol/L咪唑)平衡NI-NTA層析柱，將上清上柱， 保持0. 5mL/min的流速，10倍柱體積的緩沖液A洗柱，以洗去雜蛋白；2倍柱體積的緩沖液 B(pH 8. 5,20mmol/LTris-Cl,lmol/L KC1，5mmol/L β -巰基乙醇)洗柱，洗去核酸；再用緩 沖液 C(pH 8. 5,20mmol/L Tris .Cl，100mmol/L，5mmol/L β -巰基乙醇，100mmol/L 咪唑)洗 脫結(jié)合蛋白，收集洗脫峰，聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示洗脫蛋白包含目的蛋白。離子交換層析進(jìn)一步純化離子交換層析緩沖液(pH 7. 4,50mmol/LTris · ci) 平衡Q Sapharose HP層析柱，將經(jīng)過Ni-NTA層析柱初步純化的Restin-·融合蛋白加 在Q Sapharose HP凝膠介質(zhì)上，用緩沖液洗層析柱，用洗脫緩沖液(pH 7. 4、50mmol/L Tris · Cl,lmol/L NaCl)洗脫結(jié)合的蛋白，收集洗脫峰，聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定洗脫蛋白，結(jié)果如圖6所示其中，泳道M為蛋白質(zhì)Marker，分別為97. 2,66.4,44. 3,29.0,20. 1、 14. 3kDa ；泳道1為未誘導(dǎo)的pET44a(+)-Restin-MH1ZBI^l重組細(xì)胞；泳道2為1. OmMIPTG誘 導(dǎo)表達(dá)4h ；泳道3為純化后的Restin-MHD融合蛋白。將純化的重組人細(xì)胞靜息因子結(jié)構(gòu) 域分裝后凍干備用。d. Restin-·融合蛋白對腫瘤細(xì)胞的周期阻滯常規(guī)方法培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度1 X 105/ml，分 成3組，每組3瓶，第1組為空白對照，第2組為加入緩沖液PBS對照，第3組加入Restin-· 融合蛋白組(PBS稀釋Restin-·融合蛋白至終濃度1 μ g/ml)，作用48小時后收集細(xì)胞， 70%乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期。三組樣 品的檢測結(jié)果如圖7所示，其中第1組、第2組的細(xì)胞周期比例正常，第3組加入Restin-· 融合蛋白刺激組的Gl期明顯升高，說明Hela細(xì)胞被Restin-·融合蛋白刺激后發(fā)生了細(xì) 胞周期阻滯。常規(guī)培養(yǎng)Hela細(xì)胞至對數(shù)期，將細(xì)胞分為12組，每組3瓶，其中7組加入終濃度 1 μ g/ml的Restin-·融合蛋白進(jìn)行刺激，另外6組不加Restin-·融合蛋白，以作為對照。 每天從刺激組和對照組細(xì)胞中各取一瓶，每瓶計數(shù)4次，取其均值，再累計三瓶均值。連續(xù) 計數(shù)7天，不計數(shù)的三天后換含終濃度1 μ g/ml融合蛋白的培養(yǎng)液。根據(jù)計數(shù)結(jié)果繪制細(xì) 胞生長曲線，結(jié)果如圖8所示，可以明顯看到融合蛋白刺激組生長緩慢于作為對照的正常 培養(yǎng)組。
權(quán)利要求
一種重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白，其特征在于，包括人細(xì)胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域，在人細(xì)胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域的N端還依次連接有純化標(biāo)記序列、凝血酶和腸激酶酶切位點，以及Nus序列。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白，其特征在于，所述的人細(xì)胞 靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白，其特征在于，所述的純化標(biāo) 記序列為6 X Hi s的標(biāo)記序列。
4.如權(quán)利要求1所述的重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白，其特征在于，所述的重組人 細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
5.一種表達(dá)重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白的原核表達(dá)載體，其特征在于，該原核 表達(dá)載體為pETAAaw-Restin-^ ，是通過Bam Hi/Hind III酶切位點將如SEQ. ID. NO. 3所 示的人細(xì)胞靜息因子MHD基因片段，克隆入pET44a(+)表達(dá)載體。
6.一種重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)以包含完整人Restin基因編碼框的cDNA為模板，以引物對P作為引物，PCR擴(kuò)增人 Restin-·基因片段，所述的引物對P為上游弓丨物 Pl :cgggatccaa gaaaagtctc ct ；下游弓I物 P2 :cccaagcttg actttcagtt tgc ；2)將PCR擴(kuò)增的人Restin-·基因片段用BamHi/Hind III雙酶切得到帶粘性末 端的片段；并將該片段與Bam Hi/Hind III雙酶切的pET44a(+)載體連接得到表達(dá)載體 pET44a(+)-Restin-MHD ；3)將表達(dá)載體pET44a(+)-Restin-·轉(zhuǎn)染到感受態(tài)的大腸桿菌，篩選得到目的基因表達(dá) 的陽性轉(zhuǎn)化子；4)將陽性轉(zhuǎn)化子在37°C恒溫箱培養(yǎng)12h后挑取邊緣整齊、生長狀態(tài)良好的菌落，接種 于含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，搖床37°C培養(yǎng)過夜；次日以1 100的體積比接 種于新鮮的含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到0D_ = 0. 4 0. 6，加入0. 1 2. 5mM濃度的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，使得表達(dá)載體pETAAaw-Restin-mD 得到表達(dá)，然后離心收集細(xì)菌；5)按10mL/g細(xì)菌沉淀的比例加入裂解液，重懸細(xì)菌，在冰浴下超聲裂菌，然后離心分 離，并收集上清；所述的裂解液為PH 8. 5、濃度50mmol/L的Tris ·α，5πιπιο1/1的β -巰基乙醇和lmmol/ L的PMSF的混合溶液；6)將收集的上清上樣于金屬螯合親和層析柱，用10倍柱體積的緩沖液A洗柱以 0. 5mL/min的流速洗脫，然后用2倍柱體積的緩沖液B洗柱，最后用緩沖液C洗脫結(jié)合蛋白， 收集洗脫峰；所述的緩沖液 A 為 pH 8. 5、濃度 20mmol/L 的 Tris · Cl, IOOmmol/L 的 KC1，5mmol/L 的 β -巰基乙醇和20mmol/L的咪唑的混合溶液；所述的緩沖液B為pH 8. 5、濃度20mmol/L 的Tris · Cl，lmol/L的KCl和5mmol/L的β -巰基乙醇的混合溶液；所述的緩沖液C為pH 8. 5、濃度 20mmol/L 的 Tris · Cl, IOOmmol/L 的 KCl，5mmol/L 的 β -巰基乙醇和 100mmol/L 的咪唑的混合溶液；將收集的洗脫峰上樣于離子交換層析，用洗脫液D洗脫結(jié)合的蛋白，收集洗脫峰，得到 純化的重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白；所述的洗脫液D為pH 7. 4、濃度50mmol/L的Tris · Cl和lmmol/LNaCl的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人細(xì)胞靜息因子MHD融合蛋白及其制備方法，該融合蛋白包括人細(xì)胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域，在人細(xì)胞靜息因子MHD結(jié)構(gòu)域的N端還依次連接有純化標(biāo)記序列、凝血酶和腸激酶酶切位點，以及Nus序列。本發(fā)明通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET44a(+)-Restin-MHD-MHD，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌獲得轉(zhuǎn)化體，再對大腸桿菌轉(zhuǎn)化體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化后得到Restin-MHD融合蛋白。生物活性驗證表明，對Restin融合蛋白對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞周期阻滯作用，可用于抗腫瘤藥物的制備。
文檔編號C12N15/12GK101967194SQ20101028056
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者吳有盛, 沈琦, 王衛(wèi)華, 王孝功, 王莉, 藥立波, 路凡 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)