專利名稱：基于引物保護解除的甲基化dna的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA檢測方法，尤其涉及一種基于引物保護解除的甲基化 DNA的檢測方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶(C)殘基的5，碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見于基因5’端表達調(diào)控序列。 DNA甲基化在基因表達的調(diào)控中具有重要作用，參與了動物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達。DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升高，可以導致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機率就會提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在腫瘤的早期檢測中的應(yīng)用，因為研究表明表觀遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，檢測DNA甲基化的改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因為人們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測可以用于腫瘤發(fā)生的早期預測。CpG島甲基化的檢測方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測法。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶/Southern法 (methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern,MSRE- Southern)是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylation Specific PCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測方法，是目前檢測DNA甲基化的常用方法，具有高靈敏度的同時，假陽性率也很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種甲基化DNA的檢測方法，通過設(shè)計帶有熒光標記的尾引物，對 DNA進行PCR擴增，然后進行電泳檢測的方法，來判斷是否存在甲基化DNA。本發(fā)明甲基化DNA的檢測方法，步驟如下
步驟1，用亞硫酸鹽處理并純化待測DNA、標準非甲基化DNA和標準甲基化DNA ； 步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在所要檢測的基因區(qū)域，選擇一段含有多個CpG位點的序列作為目標檢測序列進行引物設(shè)計，以該段序列的5’端的一段序列作為PCR正向引物，以該段序列的3’端的一段序列的互補序列作為PCR反向引物；在雙側(cè)引物的5’端加上一段尾引物序列，在正向引物5’端加上一段T7尾引物序列，在反向引物5’端加上一段T3 尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并對T7尾引物進行熒光標記；步驟3，以亞硫酸鹽處理過的標準甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，加入Taq DNA聚合酶和具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶，用所述的正向和反向PCR引物，對亞硫酸鹽處理過的待測DNA進行PCR擴增；并以亞硫酸鹽處理過的標準非甲基化DNA和標準甲基化DNA作為對照；
步驟4，以步驟3所得的PCR產(chǎn)物為模板，以所述尾引物進行第二次PCR擴增； 步驟5，用核酸分析儀測定步驟3所得PCR擴增產(chǎn)物的DNA片段在毛細管電泳的遷移
率；
步驟6，將步驟5所測結(jié)果與標準DNA樣品結(jié)果對照，如果待測樣品中出現(xiàn)與標準甲基化DNA樣品一致的遷移率信號，則存在甲基化DNA ；反之，如果待測樣品中不出現(xiàn)與標準甲基化DNA樣品一致的遷移率信號，則表明待測樣品中不存在甲基化DNA。所述步驟1中，所用的亞硫酸鹽為亞硫酸鈉，用所述亞硫酸鹽處理待測DNA的處理步驟為以0. 3M NaOH變性待測DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌、pH5. 0的混合液，60°C 避光溫浴4小時；脫硫并純化DNA。所述步驟2中，在所要檢測的基因序列中，選擇一段含有多個CpG位點的序列作為目標檢測序列進行引物設(shè)計，以該段序列的5’端的一段序列作為PCR正向引物，以該段序列的3’端的一段序列的互補序列作為PCR反向引物，使PCR擴增的DNA片段大小為8(Γ180 堿基長度，使PCR擴增的序列中含有多個CpG位點，一般為纊20個。優(yōu)選地，所設(shè)計的PCR 引物為1壙32堿基長度，在引物的序列中所含CpG位點不多于3個，且在所述CpG位點的C 的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G。使所設(shè)計的正向引物的3’端的最后一個堿基正好在CpG的C的位置，使這一堿基為Τ，并使這一堿基的3’ 碳原子標記一個磷酸基團；或使所設(shè)計的反向引物的3’端的最后一個堿基正好在CpG的C 的位置，使這一堿基為Α，并使這一堿基的3’碳原子標記一個磷酸基團。其中，CpG是指胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和連接二者的磷酸酯鍵(P)組成的位點。A 是指腺嘌呤，T是指胸腺嘧啶。所述步驟3中，所用具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶為古核菌屬來源的DNA聚合酶或相同性質(zhì)的DNA聚合酶；進一步優(yōu)選為pfu DNA聚合酶。所述步驟4中，所用的尾引物標記可以是D4。所述步驟5中，所用的核酸分析儀可以是CEQ8000 DNA測序儀，
所述待測DNA為人類基因組DNA，所述標準非甲基化DNA與標準甲基化DNA為于待測 DNA相匹配的、已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組 DNA。其中，所述待測DNA樣品可以是人類正常細胞DNA、癌細胞DNA、腫瘤組織基因組 DNA、血細胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。如
所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結(jié)腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、 淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；
所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；
所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等等。
本發(fā)明提供的甲基化DNA和非甲基化DNA分離技術(shù)相比現(xiàn)有的技術(shù)水平有分離效率高、操作簡單、快捷且成本低廉等優(yōu)點。有效的分離了甲基化DNA與非甲基化DNA，使得在檢測甲基化DNA和PCR過程中可靠性提高，使甲基化水平被靈敏的檢測出。在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。綜上所述，本發(fā)明一種甲基化DNA檢測方法具有適用范圍大、方法簡單、需要樣本量小、不易被干擾、適用混合樣本等優(yōu)點。在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。


圖1為本發(fā)明甲基化DNA檢測方法流程圖。
具體實施例方式參照圖1，對本發(fā)明甲基化DNA檢測方法具體介紹如下 實施方式(一)
PCR引物設(shè)計如下在所要檢測的基因序列中，選擇一段含有多個CpG位點的序列作為目標檢測序列進行引物設(shè)計，以該段序列的5’端的一段序列作為PCR正向引物，以該段序列的3’端的一段序列的互補序列作為PCR反向引物，使PCR擴增的DNA片段大小為8(Γ180 堿基長度，使PCR擴增的序列中含有多個CpG位點，一般為纊20個。優(yōu)選地，所設(shè)計的PCR 引物為1纊32堿基長度，且在引物的序列中所含CpG位點不多于3個，在所述CpG位點的C 的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A混合代替G ；且使所設(shè)計的正向引物的3’端的最后一個堿基正好在CpG的C的位置，使這一堿基為Τ，并在這一堿基的 3’碳原子標記一個磷酸基團。Ρ16基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的甲基化是肺癌等多種癌癥細胞具有的特征。Ρ16基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的序列如下，有下劃線的部分為所選的要檢測的區(qū)域。Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds, DQ325544. 1
CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCG GGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG 甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測的區(qū)域； CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCG GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGC GGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG 非甲基化DNA序列，下劃線部分為要檢測的區(qū)域； TGGATTGTGTGTGTTTGGTGGTTGTGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGTGGGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTG GGTGGTGGGGAGTAGTATGGAGTTTTTGGTTGATTGGTTGGTTATGGTTGTGGTTTGGGTTTGGGTAGAGGAGGTGT GGGTGTTGTTGGAGGTGGGGGTGTTGTTTAATGTATTGAATAGTTATGGTTGGAGGTTG 所設(shè)計的PCR引物
正向引物 5 ’ - GTTGYGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGT [P] -3 ’反向引物 5，- TTAAACAACRCCCCCRCCTCCAACAAC-3， Y=C/T 混合，R=G/A 混合，P=磷酸基團(phosphate) 在正向和反向引物的5’端分別加上T7和T3引物作為尾引物。T7 啟動子序列，5，-[F]TAATACGACTCACTATAGGG-3， T3 啟動子序列，5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’
F為熒光標記，如D4。實施方式(二)
在實施方式(一)的基礎(chǔ)上，以所設(shè)計的引物，以標準的非甲基化DNA和甲基化DNA作為待測樣品進行檢測，以確定本發(fā)明的特異性和靈敏度。步驟1 采用亞硫酸鹽處理并純化已知的標準非甲基化DNA和甲基化DNA。將一定量的亞硫酸鈉處理過的標準非甲基化DNA，與梯度稀釋的亞硫酸鈉處理過的標準甲基化 DNA混合，作為待測樣品；
其中，所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測DNA的處理步驟為，以 0. 2M NaOH變性待測DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌、pH5. 0的混合液，60°C避光溫浴 4小時；脫硫并純化DNA。步驟2:確定待測基因檢測區(qū)域，按照在實施方式(一)所述的方法設(shè)計并合成正向 PCR引物和反向PCR引物；在正向引物的5’末端加上一段20個堿基長度的T7啟動子序列作為T7尾引物序列，在反向引物的5’末端加上一段20個堿基長度的T3啟動子序列作為 T3尾引物序列。步驟3 =PCR擴增；PCR操作過程，由步驟1所混合的待測DNA樣品作為模板 (Template),由步驟2所設(shè)計并合成的正向和反向PCR引物(primer)、PCR擴增緩沖液 (Buffer),以對尿嘧啶敏感的DNA聚合酶、四種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)、以具有 3’ 5’外切酶活性的DNA聚合酶與Taq DNA聚合酶按比例混合，進行PCR擴增；
其中對尿嘧啶敏感的DNA聚合酶為古核菌屬來源的DNA聚合酶，具體為pfu DNA聚合酶。步驟4 以步驟3的PCR產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，以T3尾引物和熒光標記的T7尾引物、在與步驟3相同的條件下進行第二次PCR擴增；
其中，相同條件是指與步驟3相同濃度的PCR引物，PCR擴增緩沖液(Buffer)、Taq DNA 聚合酶和四種三磷酸脫氧核糖核苷酸，相同的PCR條件和PCR擴增儀； 其中，所述T7尾引物的熒光標記為D4 ；
步驟5 用核酸分析儀測定PCR擴增產(chǎn)物DNA片段在毛細管電泳的遷移率，判斷檢測結(jié)
果；
其中，所述核酸分析儀為CEQ8000 DNA測序儀；
判斷是否存在甲基化DNA，判斷方法為將步驟5中所測待測DNA樣品的結(jié)果與標準樣品的信號作對照，如果待測樣品中出現(xiàn)與甲基化DNA標準樣品一致的遷移率信號，則表明待測樣品中存在甲基化DNA ；反之，則不存在。本發(fā)明一種甲基化DNA檢測方法，通過上述步驟檢驗本發(fā)明的特異性和靈敏度。在醫(yī)學領(lǐng)域，能夠準確而靈敏地測出DNA中是否存在甲基化DNA，就能夠?qū)τ谀[瘤的早期檢測、病情判斷和癌癥的復發(fā)監(jiān)控提供一種很好的指標。
實施方式(三)
在實施方式(二)的基礎(chǔ)上，以實際臨床樣品提取的DNA為待測樣品，在與上述實施方式 (二)相同的條件下，檢驗本發(fā)明的實用性。其中，與上述在實施方式(二)相同的條件，指的是除以實際臨床樣品提取的DNA為待測樣品外，所有操作與上述在實施方式(二)相同。所述臨床提取的待測DNA樣品，為人類正常和癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。所述癌細胞可以是肺癌細胞、胃癌細胞、結(jié)腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織可以是肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液可以是血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實施例的例舉，對于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作方法等，應(yīng)當理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來予以實施。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于引物保護解除的甲基化DNA的檢測方法，其特征在于，步驟如下步驟1，用亞硫酸鹽處理并純化待測DNA、標準非甲基化DNA和標準甲基化DNA ；步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在所要檢測的基因序列中，選擇一段含有多個CpG 位點的序列作為目標檢測序列進行引物設(shè)計，以該段序列的5’端的一段序列作為PCR正向引物，以該段序列的3’端的一段序列的互補序列作為PCR反向引物；并將20堿基長度的T7 序列加在正向引物的5’端作為T7尾引物序列，將20堿基長度的T3序列加在反向引物的 5’端作為T3尾引物序列；合成T7尾引物和T3尾引物，并對T7尾引物進行熒光標記；步驟3，以亞硫酸鹽處理過的標準甲基化DNA和非甲基化DNA作為PCR模板，加入Taq DNA聚合酶和具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶，用所述的正向和反向PCR引物，對亞硫酸鹽處理過的待測DNA進行PCR擴增；并以亞硫酸鹽處理過的標準非甲基化DNA和標準甲基化DNA作為對照；步驟4，以步驟3所得的PCR產(chǎn)物為模板，以所述T3和熒光標記的T7尾引物進行第二次PCR擴增；步驟5，用核酸分析儀測定步驟4所得PCR擴增產(chǎn)物的DNA片段在毛細管電泳的遷移率；步驟6，將步驟5所測結(jié)果與標準DNA樣品結(jié)果對照，如果待測樣品中出現(xiàn)與標準甲基化DNA樣品一致的遷移率信號，則存在甲基化DNA;反之，如果待測樣品中不出現(xiàn)與標準甲基化DNA樣品一致的遷移率信號，則表明待測樣品中不存在甲基化DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟1中所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測DNA的處理步驟為以0. 3M NaOH變性待測DNA，加入由5M亞硫酸鈉、0. 5mM氫醌、pH5. 0的混合液，60°C避光溫浴4小時；脫硫并純化DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟2中，所設(shè)計的PCR引物為 18 32堿基長度，并使PCR擴增的DNA片段大小為8(Tl80堿基長度，并使PCR擴增的序列中含有多個CpG位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，在引物的序列中所含CpG位點不多于 3個，且在所述CpG位點的C的位置，正向引物可以用C/T混合代替C，反向引物可以用G/A 混合代替G，使所設(shè)計的正向引物的3’端的最后一個堿基正好在CpG的C的位置，使這一堿基為Τ，并使這一堿基的3’碳原子標記一個磷酸基團；或使所設(shè)計的反向引物的3’端的最后一個堿基正好在CpG的C的位置，使這一堿基為Α，并使這一堿基的3’碳原子標記一個磷酸基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟3中，所用具有3’、’外切酶活性DNA聚合酶為古核菌屬來源的DNA聚合酶或相同性質(zhì)的DNA聚合酶的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述具有3’ 5’外切酶活性DNA聚合酶為pfu DNA聚合酶，所述的核酸分析儀為CEQ8000 DNA測序儀，所用的Τ7尾引物的熒光標記為D4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述Τ7和Τ3序列長度為20堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述待測DNA為人類基因組DNA，所述標準非甲基化DNA與標準甲基化DNA為于待測DNA相匹配的、已確定的純的非甲基化人類基因組DNA和已確定的純的甲基化人類基因組DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述待測DNA樣品為人類正常細胞 DNA、癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結(jié)腸癌細胞、直腸癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、 淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結(jié)腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA檢測方法，步驟如下步驟1，用亞硫酸鹽處理待測DNA；步驟2，在要檢測的目標區(qū)域內(nèi)，選擇一段連續(xù)序列，合成帶有尾引物序列的PCR引物；步驟3，加入TaqDNA聚合酶和具有3’~5’外切酶活性DNA聚合酶進行PCR擴增反應(yīng)；步驟4，以帶有熒光標記的尾引物進行第二次PCR擴增；步驟5，測定DNA片段在毛細管電泳的遷移率并判定樣品中是否存在甲基化DNA。本發(fā)明提高了檢測結(jié)果的可靠性，靈敏度高；在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102399864SQ20101028309
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者王建 申請人:上海迦美生物科技有限公司