專(zhuān)利名稱(chēng)：定性和定量測(cè)定分枝硫醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定性和定量測(cè)定樣品中分枝硫醇(mycothiol)的方法。
背景技術(shù)：
放線(xiàn)菌綱(Actinobacteria)包含大量的革蘭氏陽(yáng)性，高6+(%細(xì)菌，這些細(xì)菌 形態(tài)多樣，有小的球菌，也有復(fù)雜分支的菌絲體。放線(xiàn)菌在自然界分布非常廣泛，土壤、海 洋、動(dòng)物皮膚、肺和消化系統(tǒng)中都可以找到它們的身影。放線(xiàn)菌與人類(lèi)的關(guān)系非常密切 許多放線(xiàn)菌可以用來(lái)生產(chǎn)各種重要的商業(yè)產(chǎn)品，如氨基酸、維生素和抗生素；某些放線(xiàn)菌 也用于有機(jī)污染的生物修復(fù)；最重要的是許多放線(xiàn)菌是人類(lèi)和動(dòng)物的病原菌，可以引起 各種嚴(yán)重的疾病，如引起麻風(fēng)病的Mycobacterium laprae,弓丨起結(jié)核病的Mycobacterium tubercolusis,以及弓I起白喉的 Corynebacterium diphtheriae。絕大多數(shù)放線(xiàn)菌的一個(gè)重要的共同點(diǎn)是它們可以合成mycothiol (MSH， AcCys-GlcN-Ins)，一種小分子量的硫醇，以微摩爾的量存在于細(xì)胞內(nèi)，我們將其命名為分 枝硫醇。分枝硫醇的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其化學(xué)名稱(chēng)為l-0-[2-[[(2R)-2-(acetylamino)-3-mercapto-l-oxopropyl]amino]-2-deoxy-α -D-glucopyranosyl]-D-myo-inositol i 亥 小分子硫醇最初是從Sti^ptomyces菌株和Mycobacterium bovis菌株中分離并進(jìn)行了結(jié) 構(gòu)鑒定，由 Spies 禾口 Steenkamp 命名為 Mycothiol。分枝硫醇在細(xì)胞內(nèi)的作用與放線(xiàn)菌中不存在的glutathione (GSH，谷胱甘肽)的 作用相似。分枝硫醇是放線(xiàn)菌中主要的小分子量硫醇及氧化還原緩沖。分枝硫醇的一個(gè)重 要特點(diǎn)是它有較強(qiáng)的抗自氧化的能力。分枝硫醇有一還原性的巰基，可以與細(xì)胞內(nèi)其他還 原性物質(zhì)一起維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。許多細(xì)胞代謝中都需要分枝硫醇相關(guān)的酶，包 括各種親電化合物的解毒作用，活性氧氮化合物的滅活，還原和異構(gòu)化。分枝硫醇可以和多 種烷基化試劑形成復(fù)合物，使有毒烷基化試劑的毒性降低。由于分枝硫醇是結(jié)核分枝桿菌 中主要的硫醇，并與菌株的抗藥性有關(guān)，因此對(duì)分枝硫醇的研究可能幫助人類(lèi)找到潛在的 藥物作用靶位點(diǎn)用以治療結(jié)核病?？赡艿乃幬锇形稽c(diǎn)包括MshA，MshC, Mtr和MscR等分枝 硫醇合成過(guò)程的酶及其他相關(guān)蛋白。對(duì)放線(xiàn)菌中的分枝硫醇的詳細(xì)的生物化學(xué)研究，和分枝硫醇在分枝桿菌感染中的 作用研究，都需要有高靈敏，高特異的方法來(lái)對(duì)分枝硫醇進(jìn)行分析。對(duì)分枝硫醇的定性和定 量分析方法對(duì)研究分枝硫醇及放線(xiàn)菌尤其是一些病原菌有很重要的作用。不論是對(duì)實(shí)驗(yàn) 室的科學(xué)研究還是臨床診斷，都需要簡(jiǎn)單，快捷，靈敏，特異，準(zhǔn)確的分枝硫醇定性和定量方 法。谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)可以通過(guò)一個(gè)依賴(lài)于分枝硫醇 的龍膽酸途徑降解3-羥基苯甲酸和龍膽酸，首先龍膽酸被龍膽酸1，2-雙加氧酶(G12D， NCgl2920)開(kāi)環(huán)生成馬來(lái)酰丙酮酸(順丁烯二酸_單酰丙酮酸，maleylpyruvate)，馬來(lái)酰 丙酮酸在依賴(lài)于分枝硫醇的馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶(MDMPI，NCgl2918)作用下異構(gòu)為富馬酰 丙酮酸(反丁烯二酸_單酰丙酮酸，fumarylpyruvate)，最后在富馬酰丙酮酸水解酶(FPH，
5NCgl2919)的作用下水解為丙酮酸和延胡索酸，進(jìn)入中心代謝途徑。
馬來(lái)酰丙酮酸的結(jié)構(gòu)式如式II所示；
COOH

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的方法，即定量檢測(cè) 方法。本發(fā)明所提供的輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的方法，包括如下步驟(1)用酶活反應(yīng)體系測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活，制作反應(yīng)體系中分枝硫醇標(biāo) 準(zhǔn)品的濃度對(duì)應(yīng)馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活的一元線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；所述酶活反應(yīng)體系包括馬來(lái)酰丙酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶和分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品；(2)將所述酶活反應(yīng)體系中的分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品替換為待測(cè)樣品，測(cè)定馬來(lái)酰丙酮 酸異構(gòu)酶酶活，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到所述待測(cè)樣品中分枝硫醇的濃度；所述分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品為分枝硫醇；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸且依賴(lài)于分枝 硫醇的酶。上述定量檢測(cè)方法中，所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活為單位時(shí)間內(nèi)催化單位量的 馬來(lái)酰丙酮酸轉(zhuǎn)化為富馬酰丙酮酸所需的酶量；上述定量檢測(cè)方法中，所述酶活反應(yīng)體系包括富馬酰丙酮酸水解酶。所述富馬酰 丙酮酸水解酶為將富馬酰丙酮酸水解的酶。上述定量檢測(cè)方法中，所述酶活反應(yīng)體系中，各種物質(zhì)在體系中的濃度滿(mǎn)足如下 三個(gè)條件馬來(lái)酰丙酮酸的濃度分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品中最高濃度> 6. 7X IO4,馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的濃度分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品中最高濃度> llU/mL InM,富馬酰丙酮酸水解酶的濃度分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品中最高濃度> 1. 5。上述定量檢測(cè)方法中，所述酶活反應(yīng)體系由馬來(lái)酰丙酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶、 分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品、富馬酰丙酮酸水解酶和緩沖液組成；上述定量檢測(cè)方法中，所述酶活反應(yīng)體系中，馬來(lái)酰丙酮酸的濃度為120 μ Μ,馬來(lái) 酰丙酮酸異構(gòu)酶的濃度為19. 73U/mL，富馬酰丙酮酸水解酶的濃度為2. 78U/mL ；所述分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品在所述酶活反應(yīng)體系中的濃度為0. 05nM、0. 07ηΜ、0. 09ηΜ、
0.11ηΜ、0. 14ηΜ、0. 18ηΜ、0. 22ηΜ、0. 28ηΜ、0. 37ηΜ、0. 45ηΜ、0. 56ηΜ、0. 74ηΜ、0. 89ηΜ、1. 12ηΜ、
1.49ηΜ、1. 78ηΜ。上述定量檢測(cè)方法中，所述緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液或磷酸緩沖液；上述定量檢測(cè)方法中，所述緩沖液濃度為20-100mM，具體為20mM、50mM或IOOmM ；上述定量檢測(cè)方法中，所述酶活反應(yīng)體系的pH值為7. 0-8. 0，具體為7. 0,7. 5或8. 0。上述定量檢測(cè)方法中，所述測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活的方法包括如下步驟 檢測(cè)酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)酶活反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其記作吸光度值I ；檢測(cè)酶反應(yīng) 后酶活反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其記作吸光度值II，吸光度值I與吸光度值II 之差為吸光度差值，根據(jù)吸光度差值得到馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活值；上述定量檢測(cè)方法中，所述酶反應(yīng)后為自酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起1分鐘內(nèi)，具體為自 酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起第30秒；將酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)記作第0秒；上述定量檢測(cè)方法中，所述酶反應(yīng)的溫度為25°C ；上述定量檢測(cè)方法中，所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所 示；上述定量檢測(cè)方法中，所述富馬酰丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所
7J\ ο本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的方法， 即定性檢測(cè)。本發(fā)明所提供的輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的方法，包括以下步驟(1)配制酶反應(yīng)體系，進(jìn)行酶反應(yīng)；(2)檢測(cè)所述酶反應(yīng)體系中馬來(lái)酰丙酮酸的濃度是否變化，若馬來(lái)酰丙酮酸的濃 度降低，則確定所述待測(cè)樣品中含有分枝硫醇；若不變化，則確定所述待測(cè)樣品中不含有分 枝硫醇；所述酶反應(yīng)體系由馬來(lái)酰丙酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶、待測(cè)樣品溶液和緩沖液 組成；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分枝硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰 丙酮酸的酶。上述定性檢測(cè)方法中，所述檢測(cè)所述酶反應(yīng)體系中馬來(lái)酰丙酮酸的濃度是否變化 的方法包括如下步驟檢測(cè)酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)酶反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其記作吸 光度值I ；檢測(cè)酶反應(yīng)后酶反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其記作吸光度值II，若與吸 光度值I相比，吸光度值II降低，則確定馬來(lái)酰丙酮酸的濃度降低；若與吸光度值I相比， 吸光度值II不變，則確定馬來(lái)酰丙酮酸的濃度不變；上述定性檢測(cè)方法中，所述酶反應(yīng)后為自酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起5分鐘內(nèi)，具體為酶 反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起第5分鐘，將酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)記作第0分鐘；上述定性檢測(cè)方法中，所述緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液；所述緩沖 液濃度為20-100mM，具體為50mM、20mM或IOOmM ；上述定性檢測(cè)方法中，所述酶反應(yīng)體系中，所述馬來(lái)酰丙酮酸的濃度為 90 μ M-150 μ Μ,具體為90 μ Μ、120 μ M或150 μ M ；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的濃度為0. 3U/ mL-1. 3U/mL,具體為 0. 3U/mL、0. 8U/mL 或 1. 3U/mL ；上述定性檢測(cè)方法中，所述酶反應(yīng)體系的pH值為7. 0-8.0，具體為7. 0、7. 5或 8. 0 ；上述定性檢測(cè)方法中，所述酶反應(yīng)的溫度為25°C ；上述定性檢測(cè)方法中，所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所不。上述任一所述定量檢測(cè)方法在輔助檢測(cè)分枝硫醇產(chǎn)生菌中分枝硫醇含量中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述定性檢測(cè)方法在輔助檢測(cè)菌中是否含有分枝硫醇中的應(yīng)用也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶在檢測(cè)分枝硫醇中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述馬 來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分枝硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸的酶；所述 馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列具體如SEQ ID NO 1所示；上述應(yīng)用中包括如下制備菌粗提物的步驟用質(zhì)量百分比為3%高氯酸水溶液和 待測(cè)菌體細(xì)胞混勻，25°C或30°C或25°C -30°C反應(yīng)30分鐘，離心，取上清液，上清液即為菌 粗提物。實(shí)際應(yīng)用中，將菌粗提物作為待測(cè)樣品，用上述輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的 方法進(jìn)行測(cè)定或用上述輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的方法進(jìn)行測(cè)定。制備的菌 粗提物穩(wěn)定，在其制備完成后12小時(shí)內(nèi)均可用上述方法進(jìn)行檢測(cè)；優(yōu)選為在所述菌的粗提 物制備完成后0. 2小時(shí)起到6小時(shí)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的試劑
品.ο本發(fā)明所提供的輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的試劑盒，包括獨(dú)立包裝 的馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶、馬來(lái)酰丙酮酸和緩沖液；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分枝 硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸的酶；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序 列具體如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的試劑盒。本發(fā)明所提供的輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的試劑盒，包括獨(dú)立包裝的馬來(lái)酰 丙酮酸異構(gòu)酶、馬來(lái)酰丙酮酸、緩沖液、富馬酰丙酮酸水解酶和標(biāo)準(zhǔn)品分枝硫醇，所述馬來(lái) 酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分枝硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸的酶；所述馬 來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列具體如SEQ ID NO :1所示，所述富馬酰丙酮酸水解酶的氨 基酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述任一所述檢測(cè)方法不僅可以測(cè)定放線(xiàn)菌細(xì)胞中分枝硫醇的含量，還可以測(cè)其 它樣品中分枝硫醇的含量。本發(fā)明所提供定性和定量測(cè)定分枝硫醇的方法，操作簡(jiǎn)單，需要的試劑較少，儀器 設(shè)備簡(jiǎn)單常見(jiàn)，對(duì)分枝硫醇的特異性高，檢測(cè)靈敏度較高，檢測(cè)時(shí)間短，不僅可以快速檢測(cè) 到分枝硫醇的存在，還能對(duì)樣品中的分枝硫醇進(jìn)行定量，可以對(duì)樣品中是否存在分枝硫醇 進(jìn)行大規(guī)模的篩選，尤其對(duì)鑒定分枝桿菌等病原菌的臨床應(yīng)用也有重要意義。


圖1為分枝硫醇(Mycothiol)結(jié)構(gòu)式圖2為純化的分枝硫醇質(zhì)譜結(jié)果，其中A為一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果，B為m/z為487. 4片段
的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果。圖3為谷胱甘肽濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
圖4為陽(yáng)性對(duì)照，即在反應(yīng)體系中加入純化的分枝硫醇后330nm處吸光值的變化 (箭頭所示為330nm)。圖5為陰性對(duì)照，即反應(yīng)體系中加入Escherichia coli裂解液(無(wú)分枝硫醇)后 330nm處吸光值的變化(箭頭所示為330nm)。圖6為菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4. 1072τ的定性測(cè)定結(jié)果(箭頭所示 為 330nm)。圖7為菌株Clavibacter michiganensis AS 1. 1909的定性測(cè)定結(jié)果(箭頭所示 為 330nm)。圖8為菌株Nonomuraea roseoviolacea AS 4. 1072τ的巰基特異性結(jié)合熒光試劑 衍生化和HPLC結(jié)果(圖7中Α)及質(zhì)譜分析結(jié)果(圖7中B-D)。圖9為菌株Clavibacter michiganensis AS 1. 1909的巰基特異性結(jié)合熒光試劑 衍生化和HPLC結(jié)果。圖10為測(cè)定體系中分枝硫醇終濃度與馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活關(guān)系。圖11為測(cè)定體系中分枝硫醇終濃度與馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖12不同比例濕菌體重量(毫克)高氯酸水溶液體積(微升)對(duì)分枝硫醇提取 的影響。圖13為不同處理時(shí)間對(duì)分枝硫醇提取的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、酶、底物和分枝硫醇的制備一、異源表達(dá)龍膽酸1，2-雙加氧酶(G12D)，依賴(lài)于分枝硫醇的馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu) 酶(MDMPI)和富馬酰丙酮酸水解酶(FPH)質(zhì)粒pET28a-ncgl2918，pET28a_ncgl2919 禾Π pET28a_ncgl2920 在文獻(xiàn)(Shen， Χ. H. , C.Y.Jiang, et al. (2005).Functional identification of novel genes involved in theglutathione-independent gentisate patheway in Corynebacterium glutamicum. Appl. Environ. Microbiol. 71(7) :3442_3452)中公開(kāi)過(guò)，分別用于異源表達(dá) MDMPI, FPH和G12D，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所處獲得。將質(zhì)粒pET28a-ncgl2918，pET28a_ncgl2919 和 pET28a_ncgl2920 分別轉(zhuǎn)化到 Escherichia coli BL21(DE3)菌株中，鑒定，將陽(yáng)性克隆接入Luria-Bertani (LB)液體培 養(yǎng)基(含50μ g/mL的卡那霉素)37°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)到OD6tltl約為0. 5-0. 6時(shí)，加 入IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)至終濃度0. 5mM, 16°C誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)；收集細(xì)胞； 將200mg濕菌體重新懸浮在ImL緩沖液中(50mM的Tris-HCl，pH8. 0)冰上超聲破碎，離心 取上清，用His-Bind蛋白純化試劑盒(Novagen)進(jìn)行純化，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，收集合 并活性蛋白，超濾置換緩沖液并濃縮；濃縮后的目的蛋白用Superdex 200預(yù)裝柱(GE)FPLC 凝膠過(guò)濾純化。凝膠柱預(yù)先用流動(dòng)相(50mM的Tris-HCl，pH 8.0)平衡2個(gè)柱體積，上樣量 2mL，流速0. 5mL/min ；上樣后收集活性組分并超濾濃縮，超聲破碎后所有的操作均在4°C進(jìn) 行。用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。酶活測(cè)定方法如文獻(xiàn)(Zhou，N. Y.，S. L Fuenmayor
9et al. (2001). nag genes ofRalstonia (formerly Pseudomonas)sp. strain U2encoding enzymes for gentisate catabolism. J. Bacteriol. 183 (2) 700-708) ΦIjfiS, ^Sif 7
修改，測(cè)定MDMPI時(shí)加入的不是谷胱甘肽，而是終濃度為0. 3 μ M的分枝硫醇，反應(yīng)溫度為 25°C。1個(gè)單位的酶活力(U)定義為25°C時(shí)，每1分鐘內(nèi)催化Iymol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需
要的酶量。同時(shí)以轉(zhuǎn)入pET28a的E. coli (DE3)為對(duì)照。結(jié)果轉(zhuǎn)pET28a-nCgl2918的菌表達(dá)得到的蛋白具有MDMPI活性； 轉(zhuǎn)pET28a-nCgl2919的菌表達(dá)得到的蛋白具有富馬酰丙酮酸水解酶活性；轉(zhuǎn) pET28a-ncgl2920的菌表達(dá)得到的蛋白具有龍膽酸1，2-雙加氧酶活性。轉(zhuǎn)入pET28a的 E. coli (DE3)的表達(dá)產(chǎn)物無(wú)以上任何酶活性。依賴(lài)于分枝硫醇的馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。富馬酰丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。龍膽酸1，2-雙加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。二、馬來(lái)酰丙酮酸(順丁烯二酸_單酰丙酮酸，maleylpyruvate)的制備3mL反應(yīng)體系120μΜ龍膽酸、0. 03U/mL龍膽酸1，2_雙加氧酶(G12D)、50mM的 Tris-HCl緩沖液、pH 8. 0 ；室溫(25°C )反應(yīng)5分鐘，330nm處吸光值不再變化，反應(yīng)完全， 得到馬來(lái)酰丙酮酸。制備方法按照文獻(xiàn)(Liu, D. Q.，H. Liu, et al. (2005). Production of maleylpyruvate and fumarylpyruvate. Journal of Zhe.jiang Univesity (Agric. &Life Sci. )31(3) :301-304.)中所述。將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，馬來(lái)酰丙酮酸結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
一種輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的方法，包括如下步驟(1)用酶活反應(yīng)體系測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活，制作反應(yīng)體系中分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)應(yīng)馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活的一元線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；所述酶活反應(yīng)體系包括馬來(lái)酰丙酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶和分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品；(2)將所述酶活反應(yīng)體系中的分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品替換為待測(cè)樣品，測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到所述待測(cè)樣品中分枝硫醇的濃度；所述分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品為分枝硫醇；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸且依賴(lài)于分枝硫醇的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活為單位時(shí) 間內(nèi)催化單位量的馬來(lái)酰丙酮酸轉(zhuǎn)化為富馬酰丙酮酸所需的酶量；和/或，所述酶活反應(yīng)體系包括富馬酰丙酮酸水解酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述酶活反應(yīng)體系中，各種物質(zhì)在體 系中的濃度滿(mǎn)足如下三個(gè)條件馬來(lái)酰丙酮酸的濃度分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品中最高濃度> 6. 7X104， 馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的濃度分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品中最高濃度> llU/mL :lnM, 富馬酰丙酮酸水解酶的濃度分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品中最高濃度> 1. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述酶活反應(yīng)體系由馬來(lái)酰丙 酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶、分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品、富馬酰丙酮酸水解酶和緩沖液組成；所述酶活反應(yīng)體系中，馬來(lái)酰丙酮酸的濃度為120 u M,馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的濃度為 19. 73U/mL,富馬酰丙酮酸水解酶的濃度為2. 78U/mL ；所述分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品在所述酶活反應(yīng)體系中的濃度為0. 05nM、0. 07nM、0. 09nM、0.llnM、0. 14nM、0. 18nM、0. 22nM、0. 28nM、0. 37nM、0. 45nM、0. 56nM、0. 74nM、0. 89nM、l. 12nM、1.49nM、l. 78nM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液 或磷酸緩沖液；禾口 /或，所述緩沖液濃度為20-100mM，具體為20mM、50mM或100mM ； 所述酶活反應(yīng)體系的PH值為7. 0-8. 0，具體為7. 0、7. 5或8. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶 酶活的方法包括如下步驟檢測(cè)酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)酶活反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其 記作吸光度值I ；檢測(cè)酶反應(yīng)后酶活反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其記作吸光度值 II，吸光度值I與吸光度值II之差為吸光度差值，根據(jù)吸光度差值得到馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu) 酶酶活值；所述酶反應(yīng)后為自酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起1分鐘內(nèi)，具體為自酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起第30秒； 將酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)記作第0秒； 所述酶反應(yīng)的溫度為25°C ；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示； 所述富馬酰丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
7.一種輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的方法，包括以下步驟(1)配制酶反應(yīng)體系，進(jìn)行酶反應(yīng)；(2)檢測(cè)所述酶反應(yīng)體系中馬來(lái)酰丙酮酸的濃度是否變化，若馬來(lái)酰丙酮酸的濃度降 低，則確定所述待測(cè)樣品中含有分枝硫醇；若不變化，則確定所述待測(cè)樣品中不含有分枝硫所述酶反應(yīng)體系由馬來(lái)酰丙酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶、待測(cè)樣品溶液和緩沖液組成；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分枝硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮 酸的酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)所述酶反應(yīng)體系中馬來(lái)酰丙酮 酸的濃度是否變化的方法包括如下步驟檢測(cè)酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)酶反應(yīng)體系在330nm處的吸光 度值，將其記作吸光度值I ；檢測(cè)酶反應(yīng)后酶反應(yīng)體系在330nm處的吸光度值，將其記作吸 光度值II，若與吸光度值I相比，吸光度值II降低，則確定馬來(lái)酰丙酮酸的濃度降低；若與 吸光度值I相比，吸光度值II不變，則確定馬來(lái)酰丙酮酸的濃度不變；所述酶反應(yīng)后為自酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起5分鐘內(nèi)，具體為酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)計(jì)起第5分鐘，將 酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)記作第0分鐘；所述酶反應(yīng)體系中，所述馬來(lái)酰丙酮酸的濃度為90 u M-150 u M，具體為90 u M、120 u M 或150 ii M ；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的濃度為0. 3U/mL-l. 3U/mL,具體為0. 3U/mL、0. 8U/mL 或 1. 3U/mL ；所述緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液；所述緩沖液濃度為20mM-100mM，具體 為 50mM 、20mM 或 lOOmM;所述酶反應(yīng)體系的PH值為7. 0-8. 0，具體為7. 0、7. 5或8. 0 ； 所述酶反應(yīng)的溫度為25°C ；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
9.權(quán)利要求1-6中任一所述方法在輔助檢測(cè)分枝硫醇產(chǎn)生菌中分枝硫醇含量中的應(yīng)用；權(quán)利要求7或8所述方法在輔助檢測(cè)菌中是否含有分枝硫醇中的應(yīng)用； 馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶在檢測(cè)分枝硫醇中的應(yīng)用，所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分 枝硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸的酶；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸 序列具體如SEQ ID NO 1所示；所述應(yīng)用中包括如下制備菌粗提物的步驟用質(zhì)量百分比為3%高氯酸水溶液和待測(cè) 菌體細(xì)胞混勻，25°C或30°C或25°C _30°C反應(yīng)30分鐘，離心，取上清液，上清液即為菌粗提 物。
10.一種輔助鑒別待測(cè)樣品中是否含有分枝硫醇的試劑盒，包括獨(dú)立包裝的馬來(lái)酰丙 酮酸異構(gòu)酶、馬來(lái)酰丙酮酸和緩沖液；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶為依賴(lài)于分枝硫醇的且將 馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸的酶；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列具體如 SEQ ID NO 1 所示；一種輔助檢測(cè)樣品中分枝硫醇含量的試劑盒，包括獨(dú)立包裝的馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶、 馬來(lái)酰丙酮酸、緩沖液、富馬酰丙酮酸水解酶和標(biāo)準(zhǔn)品分枝硫醇，所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶 為依賴(lài)于分枝硫醇的且將馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)為富馬酰丙酮酸的酶；所述馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶的氨基酸序列具體如SEQ ID NO :1所示，所述富馬酰丙酮酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了定性和定量測(cè)定分枝硫醇的方法。該定量方法包括如下步驟(1)用酶活反應(yīng)體系測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活，制作反應(yīng)體系中分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)應(yīng)馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活的一元線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；所述酶活反應(yīng)體系包括馬來(lái)酰丙酮酸、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶和分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品；(2)將所述酶活反應(yīng)體系中的分枝硫醇標(biāo)準(zhǔn)品替換為待測(cè)樣品，測(cè)定馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶酶活，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到所述待測(cè)樣品中分枝硫醇的濃度。本發(fā)明所提供定性和定量測(cè)定放線(xiàn)菌中的方法，操作簡(jiǎn)單，對(duì)分枝硫醇的特異性高，檢測(cè)靈敏度較高，檢測(cè)時(shí)間短，可以進(jìn)行大規(guī)模的產(chǎn)分枝硫醇菌株的篩選，并且對(duì)臨床應(yīng)用也有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK101974615SQ20101028294
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者劉雙江, 周楠, 姜成英, 尹雅潔, 王保軍, 趙志萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所