專利名稱：一種液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓甾體和多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于真菌發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓留體和多糖的方法和 用于該方法培養(yǎng)基的制備及分離留體化合物和多糖的方法。
背景技術(shù)：
豬苓[辦斤/7仗狀umbellatus (Pers. )Fries]別名野豬筌、豬屎、雞屎筌、地烏桃 等，系層菌綱多孔菌科多孔菌屬真菌，以菌核入藥，在我國(guó)入藥已有2000年的歷史，其菌核 性平味淡，具有利尿、抗腫癌、增強(qiáng)免疫等功能，是臨床常用而又緊缺的藥物之一，具有很好 的發(fā)展前景。目前對(duì)豬苓的研究利用主要集中在豬苓多糖上，研究發(fā)現(xiàn)豬苓多糖具有很好的生 物活性，例如鄭虎占、曾星等許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)豬苓多糖有抗腫癌的活性；梅力等學(xué)者研 究發(fā)現(xiàn)豬苓多糖有很好的免疫調(diào)劑能力；研究還發(fā)現(xiàn)豬苓多糖還具有保肝、抗菌、抗衰老、 抗輻射等作用。然而從豬苓中分離得到的50余個(gè)化合物中甾體類化合物就有33個(gè)之多，占有相 當(dāng)大的比例(ZHAO Y Y，J Chem Res-S, 2009, (11) :699_701·)。但是關(guān)于豬苓甾體類化合 物的研究少有報(bào)道。近期研究發(fā)現(xiàn)，豬苓中大量的留體化合物具有很好的生物活性。研究表明豬苓中甾體化合物在其藥理活性中具有非常重要的作用，如麥角 甾_4，6，8 (14)，22_四烯-3-酮為豬苓中利尿作用成份之一；日本學(xué)者OHSAWA Τ.等人 (Chem Pharm Bull (Tokyo)，1992，40 (1 ):143_147·)研究發(fā)現(xiàn)豬苓酮 A-G 對(duì)白血病 L-1210 細(xì)胞的增殖均有劑量依賴性的抑制作用；WEILU E A. (Chem Pharm Bull (Tokyo), 1985， 33(11): 5083.)研究發(fā)現(xiàn)麥角甾-7，22_ 二烯-3-醇、麥角甾醇和5α，8α-過(guò)氧麥角 甾-6，22-二烯-3-醇對(duì)膠原蛋白誘導(dǎo)的血小板聚集有促進(jìn)作用；STAO Μ. (pharmbull, 2002,25 (1) :81-86.)等人研究發(fā)現(xiàn)豬苓酮A可促進(jìn)荷蘭豬角質(zhì)層的代謝更新，作為代謝 促進(jìn)劑可用于延緩皮膚的衰老；INAOKA Y.等人(Chem Pharm Bull (Tokyo)，1994，42 (3) 530-533.)研究發(fā)現(xiàn)豬苓酮A、豬苓酮B均為促進(jìn)毛發(fā)再生的活性物質(zhì)；Wei Lu等人研究發(fā) 現(xiàn)麥角留-7,22- 二烯-3-醇和麥角留醇對(duì)血小板凝聚有促進(jìn)作用等等。這些都顯示出了 豬苓留體化合物具有重要的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。然而野生豬苓菌核中留體類化合物和多糖的含量很低，分離過(guò)程復(fù)雜，并且豬苓 是多年生，生長(zhǎng)三年以上才能到達(dá)生長(zhǎng)旺盛期，野生豬苓資源及其匱乏，很難用于工業(yè)化生 產(chǎn)；人工栽培豬苓又存在一定的困難；利用發(fā)酵方法生產(chǎn)豬苓多糖的報(bào)道很多，但是普遍 存在必須與蜜環(huán)菌一起發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程復(fù)雜，周期長(zhǎng)，產(chǎn)物分離效果差等問(wèn)題；并且關(guān)于發(fā) 酵法生產(chǎn)豬苓留體的研究還沒(méi)有報(bào)道。因此開發(fā)一種提高豬苓中留體化合物和多糖含量的 方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓留體和多糖的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓留體和多糖的方法，該方法 發(fā)酵周期短，豬苓的菌絲體產(chǎn)率高，其中留體化合物含量和多糖含量很高。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)路線實(shí)現(xiàn)的
一種液體培養(yǎng)基，其特征在于，制得的該液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖20g/L 42g/L，磷 酸二氫鉀0. 5g/L 1. Og/L,硫酸鎂0. 5g/L 1. Og/L,酵母膏:0 30g/L，硝酸胺:0 1· Og/L, 氯化鈣(Tl.0g/L，蛋白胨(T4g/L，維生素 B1 :(T0. lg/L。一種液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓留體和多糖的方法，其特征在于依次包括以下步驟
a)在適合豬苓生長(zhǎng)環(huán)境條件下，利用權(quán)利要求1所述液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓留體和多 糖的的液體培養(yǎng)基對(duì)豬苓進(jìn)行培養(yǎng)，得到豬苓的液體菌種；
b)將步驟a)制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，在合適的環(huán)境條件下，繼續(xù)利用權(quán)利要 求1的液體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物；
c)對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，得到發(fā)酵液和菌絲體；
d)對(duì)豬苓菌絲體進(jìn)行真空冷凍干燥，粉碎，過(guò)40目篩，然后用二氯甲烷浸提、過(guò)濾，濾 液減壓濃縮得到豬苓留體化合物；濾渣用水浸提、過(guò)濾、濾液減壓濃縮得到豬苓多糖。其中，步驟a)中，所述的豬苓生長(zhǎng)環(huán)境為培養(yǎng)溫度為23士2°C、pH5 7、培養(yǎng)時(shí)間 為5 10天；步驟b)中，所述的合適的環(huán)境條件是培養(yǎng)溫度25士21、？!15 7、通氣量1:0.3、 每8小時(shí)攪拌lOmin，攪拌速度為120r/min，培養(yǎng)時(shí)間為2 8天。豬苓留體化合物提取時(shí)，二氯甲烷的體積用量為豬苓菌絲體質(zhì)量的1(Γ20倍，提 取溫度為35°C，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間為廣3h ；豬苓多糖多糖提取時(shí)水的體積用量為豬 苓菌絲體質(zhì)量的1(Γ20倍，提取溫度為100°C，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為廣3h。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)
1、利用生物工程技術(shù)，采用液體懸浮發(fā)酵的培養(yǎng)方法，縮短了發(fā)酵的周期，提高了豬苓 菌絲體的產(chǎn)量、增加了豬苓中留體化合物和多糖的含量。一般野生的豬苓中留體化合物和 多糖含量分別為0. lmg/g和5mg/g ；利用本發(fā)明的到的豬苓菌絲體中留體化合物和多糖含 量分別大于3. 5mg/g和llmg/g，在很大程度上提高了留體化合物和多糖的含量。2、本發(fā)明的到的豬苓菌絲體可以通過(guò)簡(jiǎn)單的操作直接從中提取留體化合物和多 糖，簡(jiǎn)化了次生代謝產(chǎn)物的分離和純化步驟，減低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)難度，為工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng) 造了條件。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先制備一種液體培養(yǎng)基，利用該液體培養(yǎng)基采用搖瓶法培養(yǎng)出液體菌 種，接著將液體菌種接種于發(fā)酵罐中繼續(xù)使用上述液體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，然后 通過(guò)過(guò)濾得到豬苓菌絲體，最后利用不同極性的溶劑對(duì)其進(jìn)行提取濃縮，得到大量的甾體 和多糖。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明內(nèi)容的實(shí)施方式不限于 這些實(shí)施例。實(shí)施例1:
(1)液體養(yǎng)基的制備制備的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖28g/L，磷酸二氫鉀1. Og/L，硫酸鎂1. Og/L，酵母膏 4g/L，維生素 B1O. lg/L。(2)液體菌種的培養(yǎng)取等量同一種的豬苓菌種，接種到裝有IOOmL步驟(1)制備 的液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23士2°C、pH為5、培養(yǎng)時(shí)間為8天的條件下，在恒溫?fù)u床(搖 床速度100次/min)中對(duì)豬苓進(jìn)行培養(yǎng)，得到豬苓的液體菌種。(3)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)將制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，利用步驟(1)制備的 液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為25士2°C、pH7、通氣量1:0. 3、每8小時(shí)攪拌IOmin (攪拌速度 120r · mirT1)，培養(yǎng)時(shí)間為7天的條件下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物。(4)對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，得到發(fā)酵液和菌絲體，對(duì)豬苓菌絲體進(jìn)行真空冷凍干燥。(5)豬苓菌絲體中豬苓留體化合物和豬苓多糖的制備
A、豬苓留體化合物制備將干燥的豬苓菌絲體粉碎，過(guò)40目篩備用。用豬苓菌絲體質(zhì) 量12倍的二氯甲烷(二氯甲烷體積mL 豬苓菌絲體質(zhì)量g=12)于35°C下回流提取3次，每 次lh，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓留體化合物，測(cè)得菌絲體中留體化合物含 量為 3. 864mg/g。B、豬苓多糖的制備將二氯甲烷提取后的濾渣用15倍的水(水的體積mL 豬苓菌 絲體質(zhì)量g=15)于100°C下回流提取3次，每次lh，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬 苓多糖，測(cè)得菌絲體中多糖含量為11.542 mg/g。實(shí)施例2
(1)液體培養(yǎng)基的制備
制備的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀0. 5g/L、硫酸鎂0. 5g/L、硝酸胺 1. Og/L、氯化鈣 0. 5g/L、蛋白胨 1. 25g/L。(2)液體菌種的培養(yǎng)取等量同一種的豬苓菌種，接種到裝有IOOmL步驟(1)制備 的液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23士2°C、pH7、培養(yǎng)時(shí)間為5天的條件下，在恒溫?fù)u床(搖床 速度100次/min)中對(duì)豬苓進(jìn)行培養(yǎng)，得到豬苓的液體菌種。(3)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)將制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，在培養(yǎng)溫度為 25士2°C、pH6、通氣量1:0. 3、每8小時(shí)攪拌IOmin (攪拌速度120r .mirT1),培養(yǎng)時(shí)間為4天 的條件下，繼續(xù)利用上述步驟(1)的液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物。(4)對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，得到發(fā)酵液和菌絲體，對(duì)豬苓菌絲體進(jìn)行真空冷凍干燥。(5)豬苓菌絲體中豬苓留體化合物和豬苓多糖的制備
A、豬苓留體化合物制備將干燥的豬苓菌絲體粉碎，過(guò)40目篩備用。用豬苓菌絲體質(zhì) 量15倍的二氯甲烷(二氯甲烷體積mL 豬苓菌絲體質(zhì)量g=15)于35°C下回流提取3次，每 次2 h，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓留體化合物，測(cè)得菌絲體中留體化合物含 量為 3. 491mg/g。B、豬苓多糖的制備將二氯甲烷提取后的濾渣用10倍的水(水的體積mL 豬苓菌 絲體質(zhì)量g)于100°c下回流提取3次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓 多糖，測(cè)得菌絲體中多糖含量為11.007mg/g。實(shí)施例3
(1)液體培養(yǎng)基的制備
制備的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖30g/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸鎂lg/L、酵母膏2. 73g/L、維生素 B1O. lg/L。(2)液體菌種的培養(yǎng)取等量同一種的豬苓菌種，接種到裝有IOOmL步驟(1)制備 的液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23士2°C、pH6、培養(yǎng)時(shí)間為7天的條件下，對(duì)豬苓進(jìn)行培養(yǎng)， 得到豬苓的液體菌種。(3)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)將制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，在培養(yǎng)溫度為 25士2°C、pH6、通氣量1:0. 3、每8小時(shí)攪拌IOmin (攪拌速度120r .HiirT1X培養(yǎng)時(shí)間為6天 的條件下，繼續(xù)利用上述步驟(1)的液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物。(4)對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，得到發(fā)酵液和菌絲體，對(duì)豬苓菌絲體進(jìn)行真空冷凍干燥。豬苓菌絲體中豬苓留體化合物和豬苓多糖的制備
A、豬苓留體化合物制備將干燥的豬苓菌絲體粉碎，過(guò)40目篩備用。用豬苓菌絲體質(zhì) 量的10倍二氯甲烷(二氯甲烷體積mL 豬苓菌絲體質(zhì)量g=10)于35°C下回流提取3次，每 次3h，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓留體化合物，測(cè)得菌絲體中留體化合物含 量為 4. 252mg/g。B、豬苓多糖的制備將二氯甲烷提取后的濾渣用20倍的水(水的體積mL 豬苓菌 絲體質(zhì)量g)于100°c下回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓 多糖，測(cè)得菌絲體中多糖含量為14. 215mg/g。實(shí)施例4
(1)液體培養(yǎng)基的制備
制備的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖42g/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸鎂lg/L、酵母膏30g/ L、氯化鈣lg/L。(2)液體菌種的培養(yǎng)取等量同一種的豬苓菌種，接種到裝有IOOmL步驟(1)制備 的液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23士2°C、pH6、培養(yǎng)時(shí)間為10天的條件下，在恒溫?fù)u床(搖 床速度100次/min)中對(duì)豬苓進(jìn)行培養(yǎng)，得到豬苓的液體菌種。(3)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)將制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，利用步驟(1)制備的 液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為25士2°C、pH7、通氣量1:0. 3、每8小時(shí)攪拌IOmin (攪拌速度 120r · mirT1)、培養(yǎng)時(shí)間為2天的條件下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物。(4)對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，得到發(fā)酵液和菌絲體，對(duì)豬苓菌絲體進(jìn)行真空冷凍干燥。豬苓菌絲體中豬苓留體化合物和豬苓多糖的制備
A、豬苓留體化合物制備將干燥的豬苓菌絲體粉碎，過(guò)40目篩備用。用豬苓菌絲體質(zhì)量20倍的二氯甲烷(二氯甲烷體積mL 豬苓菌絲體質(zhì)量g=20)于 35°C下回流提取3次，每次lh，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓留體化合物，測(cè)得 菌絲體中留體化合物含量為3. 572mg/g。B、豬苓多糖的制備將二氯甲烷提取后的濾渣用15倍的水(水的體積mL 豬苓菌 絲體質(zhì)量g)于100°c下回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液，將濾液減壓濃縮得到豬苓 多糖，測(cè)得菌絲體中多糖含量為12. 428mg/g。
權(quán)利要求
一種液體培養(yǎng)基，其特征在于，制得的該液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖20g/L~42g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L~1.0g/L，硫酸鎂0.5g/L~1.0g/L，酵母膏0~30g/L，硝酸胺0~1.0g/L，氯化鈣0~1.0g/L，蛋白胨0~4g/L，維生素B10~0.1g/L。
2.一種液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓留體和多糖的方法，其特征在于依次包括以下步驟a)在適合豬苓生長(zhǎng)環(huán)境條件下，利用權(quán)利要求1所述液體培養(yǎng)基對(duì)豬苓進(jìn)行培養(yǎng)，得 到豬苓的液體菌種；b)將步驟a)制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，在合適的環(huán)境條件下，繼續(xù)利用權(quán)利要 求1的液體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物；c)對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，得到發(fā)酵液和菌絲體；d)對(duì)豬苓菌絲體進(jìn)行真空冷凍干燥，粉碎，過(guò)40目篩，然后用二氯甲烷浸提、過(guò)濾，濾 液減壓濃縮得到豬苓留體化合物；濾渣用水浸提、過(guò)濾、濾液減壓濃縮得到豬苓多糖。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟a)中，所述的豬苓生長(zhǎng)環(huán)境為培養(yǎng)溫 度為23士2°C、pH5 7、培養(yǎng)時(shí)間為5 10天；步驟b)中，所述的合適的環(huán)境條件是培養(yǎng)溫度 25士2°C、pH5 7、通氣量1:0. 3、每8小時(shí)攪拌lOmin，攪拌速度為120r/min，培養(yǎng)時(shí)間為2 8 天。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，豬苓留體化合物提取時(shí)，二氯甲烷的體積用 量為豬苓菌絲體質(zhì)量的10 20倍，提取溫度為35°C，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間為廣3h ；豬苓 多糖多糖提取時(shí)水的體積用量為豬苓菌絲體質(zhì)量的1(Γ20倍，提取溫度為100°C，提取次 數(shù)為3次，提取時(shí)間為廣3h。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的二氯甲烷回收后反復(fù)利用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬苓甾體和多糖方法，包括以下步驟(a)液體培養(yǎng)基的制備；(b)在適合豬苓生長(zhǎng)條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到豬苓的液體菌種；(c)將步驟(b)制得的液體菌種接種到發(fā)酵罐中，在合適的條件下，在液體培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵；(d)對(duì)發(fā)酵液和菌絲體進(jìn)行分離，然后對(duì)菌絲體中甾體化合物和多糖進(jìn)行分離。本發(fā)明具有發(fā)酵周期短，產(chǎn)率高，菌絲體中甾體和多糖含量高，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。減低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)難度，為工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。
文檔編號(hào)C12P33/00GK101948760SQ20101028434
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者吳進(jìn), 李同臣, 杜宏濤, 王俊儒 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)