專利名稱：一種特異識別單核細(xì)胞增生李斯特菌的核酸適配子及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)中的SELEX技術(shù) (指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))制備一種與單核細(xì)胞增生李斯特菌高特異性和高親和 力的核酸適配子，為該核酸適配子在檢測單增李斯特菌中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基 石出。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種常見、重要的人畜共患
病原菌。它能引起人、畜的李斯特菌病，嚴(yán)重感染后主要表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血 性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥直至死亡。它 廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李斯特菌對人類的安全具有危險，該菌在4°C環(huán) 境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。因此，如何快速、準(zhǔn) 確檢測單增李斯特菌具有重要研究意義。傳統(tǒng)檢測病原菌的方法往往是需要先分離病原微生物，然后通過微生物培養(yǎng)， 再用經(jīng)典的方法鑒定。耗時、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。因此發(fā)展快速、靈敏 檢測病原微生物的技術(shù)十分必要。利用抗體雖然能夠特異識別病原細(xì)菌，能夠迅速、準(zhǔn) 確的對待檢標(biāo)本作出鑒定，但該技術(shù)受特異性抗體制備難度的制約。因為按照伯杰分類 標(biāo)準(zhǔn)，生物學(xué)形狀基本相同的細(xì)菌群體構(gòu)成一個菌種，性狀相近關(guān)系密切的若干菌種組 成一個菌屬。從本質(zhì)上講，同一菌屬所含的表面抗原絕大多數(shù)是相同的，只有細(xì)微的差 別，找到這些差別并制備相應(yīng)特異性抗體顯然是一項耗時而艱巨的任務(wù)。近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人 注目。寡核苷酸適配子是通過SELEX過程篩選的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子DNA 或 RNA 片段。SELEX 技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系 統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，是一種研究核 酸結(jié)構(gòu)和功能的有效方法。其基本原理是體外化學(xué)合成一個隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫，用它 與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗去未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，分離與靶 物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行下輪的篩選過程。通 過數(shù)輪重復(fù)篩選與擴(kuò)增，最后得到高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子，即aptamer。 利用SELEX技術(shù)篩選獲得的aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗 體相比，適配子具有更明顯的優(yōu)越性，如不依賴動物細(xì)胞，不受免疫條件和免疫原性限 制，適配子的篩選完全在體外進(jìn)行，具有時間、質(zhì)量和數(shù)量上的選擇彈性，可以在合成 時粘確、定點、隨意連接其他功能基團(tuán)和分子；適配子變性與復(fù)性可逆且速度快，可反 復(fù)使用、長期保存和室溫運輸；靶分子范圍更廣，除蛋白質(zhì)、核苷酸大分子外，還有小 分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶堿等)、生長因子、肽鏈、類固醇、糖類、輔因子 (如FMN等)，甚至可用于完整的細(xì)胞、病毒、孢子等；與靶分子結(jié)合具有更強(qiáng)的特異性和親和力，不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾，可以在靶目標(biāo)性質(zhì)未知的情況下篩選 出其相應(yīng)的適配子；適配子通過占據(jù)靶物質(zhì)表位，使疾病得到控制，作為臨床藥物的治 療，已顯現(xiàn)了潛在的時的血管內(nèi)皮生長因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用， 以達(dá)到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對一些致病性細(xì)菌或病毒的研究，雖然不 知道其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過SELEX過程篩選到 與其對應(yīng)的適配子，檢測靶物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研究探索熱點。本發(fā)明以食品中和臨床上常見的單核細(xì)胞增生李斯特菌為靶標(biāo)，利用SELEX技 術(shù)獲得了與單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性結(jié)合的核酸適配子序列，該序列可以快速、準(zhǔn) 確檢測單增李斯特菌，由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩(wěn)定、合成方便且廉價、經(jīng)修 飾后可直接用于熒光或化學(xué)發(fā)光、發(fā)色方法檢測靶細(xì)菌，因此操作簡單、直接。該發(fā)明 可以在食品安全檢測、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種微生物分子生物學(xué)檢測方法，特別涉及一種利用適配 子技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法。本發(fā)明方法利用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX技術(shù))，以單核細(xì)胞增 生李斯特菌完整的菌細(xì)胞為靶標(biāo)，篩選獲得與靶細(xì)胞高親和性特異結(jié)合的適配子，通過 羧基熒光素(FAM)標(biāo)記方法將獲得的適配子轉(zhuǎn)為報告適配子，用于從臨床血、食品培養(yǎng) 上清中檢測到相應(yīng)的靶細(xì)菌，達(dá)到快速、準(zhǔn)確診斷的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(1)與蛋白類的抗體相比，單鏈寡核苷酸更為穩(wěn)定；aptamer可直接體外合成、 標(biāo)記，不需要標(biāo)記的二抗，使得操作更為簡單、迅速；aptamer的合成成本較抗體制備成 本低，周期短。(2)該序列是從結(jié)構(gòu)顯著、與靶細(xì)菌具有不同親和力的8條適配子序列中選取出 的親和力和特異性均最強(qiáng)的適配子序列，能夠特異識別單核細(xì)胞增生李斯特菌。


圖1是合成的SSDNA文庫2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2是部分SELEX篩選的PCR產(chǎn)物2 %瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖3是單增李斯特菌適配子F1-F8 二級結(jié)構(gòu)圖譜圖4是單增李斯特菌適配子F1-F8親和力飽和結(jié)合曲線表1是F2適配子與九種對照細(xì)菌的結(jié)合率
具體實施例方式下面是通過SELEX技術(shù)篩選特異結(jié)合單核細(xì)胞增生李斯特菌的核酸適配子制備 方法及其快速檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌方面的應(yīng)用。1、合成隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)隨機(jī)單鏈DNA (ssDNA)文庫5 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA (N35) TTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘,構(gòu)建了 長度為 78nt 的隨機(jī) ssDNA 文庫，兩端為固定引物序列，中間為35個堿基的隨機(jī)序列，庫容量為IO14以上；引物I: 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3‘；引物II 5' —GATCCGGGCCTCATGTCG AA-3 ‘，將隨機(jī)ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100 μ mol/L貯存液_20°C 貯存?zhèn)溆谩?、雙鏈 DNA (dsDNA)及單鏈 DNA (ssDNA)文庫的 PCR 擴(kuò)增每輪篩選前先將ssDNA文庫擴(kuò)增為dsDNA文庫，并以dsDNA文庫為模板擴(kuò)增出 下一輪篩選的ssDNA文庫，為了穩(wěn)定條件，不改變反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。PCR反應(yīng)體系 為隨機(jī)ssDNA模板2yL，引物I和引物II各2yL(20y mol/L)，含Mg2+dNTP混合物 2yL(25mmol/L), IOXPCR 緩沖液 5 μ L，Taq 聚合酶 0.5 μ L，力口超純水至 50 μ L ； PCR 反應(yīng)程序為97°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行循環(huán)，96°C變性40s，59°C退火40s，72°C延伸 40s,循環(huán)30次，最后72°C延伸9min，12°C冷卻5min，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳 檢測，置4°C環(huán)境儲存?zhèn)溆谩?、篩選所用靶標(biāo)細(xì)菌的獲取與處理LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞增生李斯特菌，37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD_ 約為0.3)，停止培養(yǎng)，收集OD6c 為0.3左右的菌液ImL，4°C, 8000rpm離心lOmin，棄 上清，用結(jié)合緩沖液(IXBB)沖洗兩次，洗去多余的培養(yǎng)基成分，置4°C環(huán)境儲存?zhèn)溆谩?、SELEX技術(shù)篩選獲得特異識別單增李斯特菌的核酸適配子第一輪篩選時，反應(yīng)體系為600 μ L，取2nmol擴(kuò)增后的隨機(jī)dsDNA文庫加入 適量的IXBB于95°C變性5min，立即冰浴lOmin。將其加入處理好的菌細(xì)胞(IXlO8 個)離心管中，再加入5倍于隨機(jī)ssDNA文庫摩爾數(shù)的5% BSA溶液和酵母tRNA，以 降低結(jié)合背景，于37°C振蕩孵化lh。孵化后需更換離心管，以去除與離心管壁結(jié)合的 ssDNA，將新離心管于4°C，6000rpm離心lOmin，棄上清，去除未結(jié)合或結(jié)合不緊密的 隨機(jī)ssDNA文庫，隨后用含0.05% BSA的IXBB通過重懸浮和離心沖洗2次，最后加 入 100 μ L IXPCR 緩沖液，于 95°C變性 5min，0°C立即冷卻 lOmin，經(jīng) 4°C，8000rpm 離 心lOmin，吸取上清至另一潔凈的離心管中，即為第一輪篩選所得的適配子。以此為模 板PCR擴(kuò)增為dsDNA文庫，用于第二輪篩選。第二輪至第八輪反應(yīng)體系為350 μ L，其 中隨機(jī)ssDNA文庫為lOOpmol，每輪篩選需用新鮮菌液，重復(fù)篩選8次獲得單核細(xì)胞增生 李斯特菌的適配體庫。將每輪篩選PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。上述篩選結(jié)合緩沖液(IXBB)為50mMTris-HCl(pH 7.4)，5mM KCl, IOOmM NaCl, ImMMgCl2 ；沖洗緩沖液為含0.05%的1 XBB ；洗脫緩沖液為1 XPCR緩沖液。5、克隆和測序?qū)⒌诎溯喐患膕sDNA文庫，PCR擴(kuò)增為雙鏈，送上海博尚生物技術(shù)有限公司 進(jìn)行DNA序列測定，獲得20條適配子序列。6、適配子序列結(jié)構(gòu)分析采用DNAMAN軟件和RNA Structure 4.2軟件分別對適配子序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)和
二級結(jié)構(gòu)分析，獲得20條序列的同源性信息和二級結(jié)構(gòu)圖譜。結(jié)合一級結(jié)構(gòu)同源性和二 級結(jié)構(gòu)將序列分為8個家族，從每個家族中選出1條結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能級較低的序列為代表進(jìn) 行下一步鑒定，共8條，如圖3所示，每條適配子中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能是適配子 與靶細(xì)菌結(jié)合的基礎(chǔ)
7、適配子與單核細(xì)胞增生李斯特菌親和力和特異性測定7.1適配子親和力分析將上述8條適配子序列5'端標(biāo)記FAM，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 合成，用于親和力測定。FAM-Fl5 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGGGCCTAGACTAGGGGGAGAG GGTGGGACGGTTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F25 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATACTATCGCGGAGACAGCGCGGGAG GCACCGGGGATTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F35 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGCGGCGGCGGTGGTACGGGGT TGGGAGCGGGCT TCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘FAM-F45 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCGTATGCGCAGCGAGGGCGGCC GGGCGACGTCGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F55 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCACGGGAACAACATCGTGGCAGG GACGAGCGTCCTTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F65 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGCGCGCTGCCGACGCGGGGGGGCT GATTAGCGTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'FAM-F75 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAACTGAGGGGCGGCGGACGGGATGG GAAATGTAGGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘FAM-F85 ‘ -GGGAGCTCAGAAFAAACGCTCAATAGCGTGGGTAACCGTGTTGGGGGG TGCCACGGTCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3'將八條適配子分別用IXBB稀釋為不同的濃度梯度(10，20，50，100，150， 200，250，300nmol/L),與1 X IO8個單核細(xì)胞增生李斯特菌在37°C溫育結(jié)合lh，4°C, 6000rpm,離心lOmin，棄上清，用IXBB沖洗兩次，加入IOOyL 1XBB，避光混勻，用 FL-7000熒光分光光度計測定熒光值(測三次取平均值)，利用Sigma Plotl 1.0軟件計算 各適配子的解離常數(shù)Kd值，并繪制其飽和結(jié)合曲線，如圖4所示。7.2特異性分析與單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞親和力最強(qiáng)即Kd值最小的適配子序列為F2序 列，Kd值為58.85nmol/L，將IOpmol F2適配子(100nmol/L，1 XBB)分別與金黃色葡 萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、枯草芽孢桿菌、鏈球 菌、綠膿桿菌、嗜酸乳桿菌于37°C溫肓結(jié)合lh，4°C, 6000rpm,離心lOmin，棄上清， 用IXBB沖洗兩次，將菌細(xì)胞重溶于100 μ L 1XBB，用FL-7000熒光分光光度計測定熒光值(測三次取平均值)。結(jié)果顯示F2適配子與九種對照菌的結(jié)合率不超過5%，如表 1所示，表明F2適配子與單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性良好，因此，利用SELEX技術(shù) 篩選的單核細(xì)胞增生李斯特菌高親和性特異核酸適配子檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌，具 有廣泛的應(yīng)用前景。表1F2適配子與九種對照細(xì)菌的結(jié)合率(％ )
權(quán)利要求
1.一種特異識別單核細(xì)胞增生李斯特菌的核酸適配子及其篩選方法與應(yīng)用，其特征 在于所述寡核苷酸適配子的核苷酸序列如序列表中序列1-8所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向單核細(xì)胞增生李斯特菌的寡核苷酸適配子的制備方法， 按照下列步驟步驟進(jìn)行(1)隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫的構(gòu)建和引物隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫5 ‘ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA (N35) TTCGACATGAGGCCCGGATC-3 ‘；弓丨物 I 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3‘；引物 II: 5' -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'；(2)PCR制備隨機(jī)ssDNA文庫；(3)SELEX篩選單核細(xì)胞增生李斯特菌的核酸適配子；(4)DNA克隆和測序；(5)適配子序列一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)分析；(6)適配子親和力和特異性鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向單核細(xì)胞增生李斯特菌的寡核苷酸適配子在檢測單核細(xì) 胞增生李斯特菌方面的應(yīng)用，其特征在于所述寡核苷酸適配子是體外化學(xué)合成的，或是 通過PCR或其他分子生物學(xué)方法制備的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，其特征在于所述寡核苷酸適配子的5'端或3'端 可以經(jīng)過FITC (FAM)、生物素、地高辛等標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單核細(xì)胞增生李斯特菌的核酸適配子及其篩選方法與應(yīng)用。通過SELEX技術(shù)獲得了能夠特異識別單核細(xì)胞增生李斯特菌的單鏈DNA寡核苷酸適配子，該適配子可以通過熒光素標(biāo)記等轉(zhuǎn)為報告適配子用于檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌，該適配子序列在準(zhǔn)確、快速檢出食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌方面具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/04GK102010865SQ20101029576
公開日2011年4月13日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者丁曉瑩, 王周平 申請人:江南大學(xué)