使用發(fā)卡寡核苷酸擴(kuò)增核酸的方法
【專利說明】使用發(fā)卡寡核苷酸擴(kuò)増核酸的方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2013年3月15日、申請(qǐng)?zhí)枮?1/789，685的臨時(shí)申請(qǐng)的非臨時(shí)專利申請(qǐng)，所述非臨時(shí)專利申請(qǐng)此處全文納入。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦研究或發(fā)展資助的申明
[0004]無
[0005]以光盤形式提交的相關(guān)參考資料
[0006]無
[0007]發(fā)明背景
[0008](I)所述發(fā)明的領(lǐng)域
[0009]本發(fā)明與核酸擴(kuò)增的方法有關(guān)，具體地，使用發(fā)夾寡核苷酸擴(kuò)增核酸。
[0010](2)【背景技術(shù)】描述
[0011]對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言有許多已知的擴(kuò)增核酸的方法。提供從一樣本中特異性地捕獲一目標(biāo)核酸的方法，有助于純化、擴(kuò)增和/或檢測該特異性目標(biāo)。本發(fā)明提供了捕獲特異性核酸以進(jìn)行包括擴(kuò)增和測序在內(nèi)的進(jìn)一步操作的方法。
[0012]所述發(fā)明簡要總結(jié)
[0013]本發(fā)明提供了固定和擴(kuò)增一目標(biāo)核酸的方法。在一方法中，一發(fā)夾寡核苷酸與一目標(biāo)核酸混合。所述發(fā)卡寡核苷酸含有在所述3’端的一第一目標(biāo)結(jié)合區(qū)域和在所述5’端的一第二目標(biāo)結(jié)合區(qū)域和兩者之間的用戶定義的連接區(qū)域。所述連接區(qū)域可包括多種的用戶定義的序列或原件，譬如，所述連接區(qū)域可包括一個(gè)或多個(gè)下列原件或其任意的組合:一引物位點(diǎn)、一錨位點(diǎn)和/或一條形碼序列。優(yōu)選的，所述連接區(qū)域包括至少一個(gè)捕獲原件和至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。
[0014]所述發(fā)夾寡核苷酸的所述第一和第二目標(biāo)結(jié)合區(qū)域退火后與所述目標(biāo)核酸結(jié)合，所述發(fā)夾寡核苷酸通過聚合酶從其3’端向5’端延伸以產(chǎn)生一第一雙重核酸。所述第一雙重核酸包括一第一核酸和所述目標(biāo)核酸。所述第一核酸的末端由連接酶連接以產(chǎn)生一環(huán)狀核酸。所述環(huán)狀核酸從所述目標(biāo)核酸移除，然后通過由一固相載體所提供的一捕獲手段捕獲。捕獲也可由本領(lǐng)域已知的多種方法所實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的，所述捕獲手段與所述連接區(qū)域的所述捕獲原件結(jié)合。可選擇地，所述環(huán)狀第一核酸/目標(biāo)復(fù)合物可被捕獲至一固相載體上，然后所述第一核酸與所述目標(biāo)核酸分離。
[0015]能夠與所述連接區(qū)域的至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的一引物與所述環(huán)狀核酸混合，通過聚合酶延伸一產(chǎn)生一含有一第二核酸和一第一核酸的第二雙重核酸。所述第二核酸，或所述擴(kuò)增的目標(biāo)核酸，從所述第一核酸移除，現(xiàn)在可進(jìn)行后續(xù)操作步驟，包括使用PCR擴(kuò)增、捕獲、檢測和/或包括第二代測序的測序。
[0016]本發(fā)明的其他方面參見于所述說明書的全文中。
[0017]圖片簡述
[0018]圖1是本發(fā)明中一個(gè)方法的示意圖。
[0019]本發(fā)明詳細(xì)描述
[0020]除非特別說明，此處所用的所有術(shù)語都與本發(fā)明所屬的本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義相同。此處公開全文所引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物都以它們?nèi)牡男问奖灰?。若此處的某一術(shù)語含有多重的定義，則以本部分最通常的定義為準(zhǔn)。
[0021]此處所用術(shù)語“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，長度至少為2，通常在約5至約200，或者更常見地至約100。因此，該術(shù)語包含雙鏈和單鏈DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’ -O-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。
[0022]此處所用術(shù)語“目標(biāo)”、“目標(biāo)序列”或者“目標(biāo)核苷酸”指一含有一所關(guān)注的多聚核苷酸的核酸，需要對(duì)其進(jìn)行純化、分離、捕獲、固定、擴(kuò)增、鑒定、檢測、定量、質(zhì)量測定和/或測序以及類似操作。所述目標(biāo)序列就其實(shí)際序列而言可已知或未知。
[0023]此處所用術(shù)語“引物”或“引物序列”是指含有挑選到的與將擴(kuò)增的每一特定序列基本上互補(bǔ)的序列的核酸。更具體地，引物是與它們相應(yīng)的目標(biāo)雜交充分互補(bǔ)的。因此，所述引物序列不需要準(zhǔn)確地反映所述目標(biāo)的精確的序列。所述引物中可散布非互補(bǔ)堿基或更長的序列，只要所述引物序列與所述目標(biāo)核酸的序列具有足夠的互補(bǔ)性以允許雜交和延伸。
[0024]此外，引物可抗核酸酶并包括經(jīng)過修飾以阻止核酸外切酶降解的引物。在一些實(shí)施方案中，所述引物已經(jīng)過修飾以保護(hù)不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。這些修飾包括但不限于2’ -O-甲基核糖核苷酸修飾、硫代骨架修飾、二硫代骨架修飾、磷酰胺骨架修飾、甲基膦酸酯骨架修飾、3’端磷酸修飾和3’烷基取代。在一些實(shí)施方案中，在一擴(kuò)增反應(yīng)中施用的所述引物和/或探針通過一種或多種修飾保護(hù)不被3’或5’端核酸外切酶的活性所降解。
[0025]技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備適于延伸一目標(biāo)序列的引物。此處提供的應(yīng)用于所述方法和組分的引物的長度取決于多種因素，包括鑒定所述核苷酸序列特性及這些核酸在雜交或在體外核酸延伸時(shí)的溫度。對(duì)具備通常手段的人員而言，其知曉決定上述針對(duì)具有一特定序列特性的所述引物的優(yōu)選長度所要考慮的事宜。
[0026]術(shù)語“載體”或“固相載體”指傳統(tǒng)的載體，其包括，如微量滴定孔、玻璃粉、微?；蚶w維的聚合物，和諸如載玻片、試管等捕獲分子與之共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合的硅烷或硅酸鹽載體。
[0027]此處所用術(shù)語“樣本”指本質(zhì)上任何含有所期望的目標(biāo)核酸的樣本，包括但不限于分離自一人或一動(dòng)物的組織或體液，包括但不限于，譬如，血液、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、眼淚或唾液、尿液、精子、糞便、痰液、嘔吐物、胃吸出物、支氣管吸出物、棉簽拭樣(鼻咽的、直腸的、眼的、泌尿生殖器的等)、器官、肌肉、骨髓、石蠟包埋組織、皮膚、腫瘤和/或獲取自所述生物體任何部分的細(xì)胞；植物材料、細(xì)胞、液體等；一單獨(dú)的細(xì)菌、菌群及其培養(yǎng)物、食物、化妝品、藥品/藥物、通過生物工藝準(zhǔn)備的材料(終產(chǎn)品和中間材料)、水、環(huán)境樣品，包括但不限于，譬如，土壤、水和空氣；從以上所列所述來源中獲得的半純化或純化的核酸，諸如，作為一過程的結(jié)果的核酸，如測序的模板形成，包括下一代測序、樣本處理、核酸酶消化、限制酶消化、復(fù)制或類似。
[0028]此處所用術(shù)語“擴(kuò)增”指產(chǎn)生與一完整的目標(biāo)核酸序列或其一部分或作為所述目標(biāo)核酸序列的一替代物的通用序列的相同或互補(bǔ)的核酸鏈的過程。
[0029]此處所用術(shù)語“固定”指一分子，諸如所述第一和第二寡核苷酸與一固相載體相連接。本領(lǐng)域通常已知的廣泛的方法能用于連接。一優(yōu)選的方法是共價(jià)鍵相連。
[0030]此處所用術(shù)語“核酸”指一多核苷酸化合物，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包括核苷或含有含氮雜環(huán)堿基或其堿基類似物的核苷類似物，通過標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵或其他鍵合共價(jià)連接而成。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物及其類似物。在一核酸中，所述骨架由多種鍵合方式構(gòu)成，包括一個(gè)或多個(gè)糖-磷酸二酯鍵、肽核酸鍵(PCT N0.WO95/32305)、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵或其組合。在一核酸中，糖部分可為核糖、脫氧核糖或帶有如2’甲氧基和2’鹵素(如2’ -F)取代基的相似化合物。
[0031]含氮堿基可為傳統(tǒng)的堿基(A、G、C、T、U)，諸如異胞嘧啶和異鳥嘌呤的非天然核苷酸及其類似物(如肌苷，The B1chemistry of the Nucleic Acids5_36, Adams etal.，ed.，Ilth ed.，1992)，嘌呤和嘧啶堿基的衍生物，如N4_甲基脫氧鳥苷、氮雜或吖嘌呤、氮雜或吖嘧啶、在任意一系列化學(xué)位上有改變或取代的取代基的嘌呤或嘧啶，例如2-氨基-6甲氨基嘌呤、O6-甲基鳥嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4- 二甲肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶或者吡唑啉酮化合物，如非取代或3-取代吡唑啉酮[3，4-d]嘧啶(如U.S.Pat.Nos.5，378，825，6，949，367 和 PCT N0.WO 93/13121)。
[0032]核酸可包括“非堿基的”位置，其骨架在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上不包括一含氮堿基(U.S.Pat.N0.5，585，481)，如一個(gè)或多個(gè)非堿基位置可形成一個(gè)結(jié)合分散的寡核苷酸序列的結(jié)合區(qū)域。一核酸可僅包括傳統(tǒng)的糖、堿基和在傳統(tǒng)的RNA和DNA中的結(jié)合方式，或者可包括傳統(tǒng)組分和取代基(如由一 2’甲氧基骨架相連的傳統(tǒng)堿基，或者一含有傳統(tǒng)的堿基及一種或多種類似物的一混合物的聚合物)。所述術(shù)語包括“鎖核酸”(LNA)，其含有一個(gè)或多個(gè)帶有閉合于一類似RNA的糖構(gòu)型中的一雙環(huán)呋喃糖單位的LNA核苷酸單體，其提高了與 ssRNA、ssDNA 或 dsDNA 的互補(bǔ)序列雜交的親和力(Vester et al., 2004, B1chemistry43(42):13233-41)。
[0033]此處所用術(shù)語“釋放”指通過將所述雙重核酸升溫至一變性溫度，使所述核酸雙重形成兩條分散的寡核苷酸，從而將所述期望擴(kuò)增的核酸從它的模板中分離。
[0034]此處所用術(shù)語“移除”指一系列從一雙重核酸中分離或通過其他方法移除或分開一條核酸鏈的方法，譬如酶解、升溫和/或化學(xué)分解、降解和/或切割所述雙重核酸中的一條鏈，或通過加熱、聲能量、化學(xué)物、酶及其結(jié)合變性/解離所述鏈。
[0035]此處所用術(shù)語“標(biāo)簽區(qū)域”或“標(biāo)簽序列”指一條或多條用戶定義的被包含在一寡核苷酸內(nèi)的核酸序列或其他核酸結(jié)構(gòu)，如一引物，以提供一種或多種期望的功能。這樣的原件包括，譬如，銜接子、測序引物、擴(kuò)增引物、捕獲和/或錨定原件、雜交位點(diǎn)、啟動(dòng)子原件、核酸內(nèi)切酶抑制位點(diǎn)、檢測原件、質(zhì)譜標(biāo)簽、條形碼序列、結(jié)合原件和/或非天然核苷酸。其他原件包括在一混合物中能夠清楚地區(qū)分和/或鑒定一個(gè)或多個(gè)含有來自其他核酸或核酸片段的一段標(biāo)簽序列的核酸或核酸片段的原件，在一核酸混合物中獨(dú)特的以最大程度減少交叉反應(yīng)以及類似情況的原件和有助于確定序列方向的原件。在一標(biāo)簽序列中部分或所有所述原件能夠包含于擴(kuò)增產(chǎn)物中。
[0036]此處所用術(shù)語“雜交”、“退火”指在合適的條件下，通過Watson&Cr i ck堿基配對(duì)，具有與基本上互補(bǔ)的序列的核酸互相結(jié)合的能力。核酸退火或雜交技術(shù)在本領(lǐng)域?yàn)橐阎⒁?，例如，Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, SecondEdit1n, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.(1989) ；Ausubel, F.M., etal., Current Protocols in Molecular B1logy,John ffiley&Sons, Secaucus,