專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法
一種轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于環(huán)境生物安全檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán) 境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，極大地推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因植物的培育和種植，轉(zhuǎn)基因植物的 商品化應(yīng)用，為農(nóng)作物產(chǎn)量的提高、減少農(nóng)藥的施用、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境以及糧食安全問題 帶來了新的機(jī)遇。我國已鎖定轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)為未來發(fā)展的重大目標(biāo)，將有更多的轉(zhuǎn)基因 植物品種培育出來。然而，轉(zhuǎn)基因植物商品化種植面臨的一個(gè)巨大瓶頸就是環(huán)境生物安全 的檢測(cè)和評(píng)價(jià)，特別是轉(zhuǎn)基因的逃逸及其可能帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，即轉(zhuǎn)基因通過基因漂移逃 逸到野生近緣物種之后，可能引起嚴(yán)重的雜草問題和野生近緣種群體的局部瀕危和滅絕等 一系列后果。這種環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的存在嚴(yán)重地制約了轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商品化種植的決策。因此， 在商品化種植之前必須對(duì)轉(zhuǎn)基因逃逸所帶來的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以確保轉(zhuǎn)基因植物 的安全和可持續(xù)利用。
轉(zhuǎn)基因植物釋放到環(huán)境之后，其外源基因通過基因漂移將會(huì)逃逸到轉(zhuǎn)基因植物的 野生近緣物種，對(duì)于轉(zhuǎn)基因逃逸是否具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，其風(fēng)險(xiǎn)的程度均必需進(jìn)行檢測(cè) 和評(píng)價(jià)。但是，到目前為止，只有對(duì)基因漂移頻率檢測(cè)比較有效的檢測(cè)方法，而對(duì)于基因漂 移逃逸后是否會(huì)帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)以及風(fēng)險(xiǎn)的程度尚缺乏有效的檢測(cè)方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)評(píng)價(jià)逃逸的轉(zhuǎn)基因是否導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的方法。
轉(zhuǎn)基因逃逸是否會(huì)帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，這在很大程度上取決于該基因是否引起野生近 緣物種適合度(指在一定條件環(huán)境下，生物體能夠生存并傳遞其基因給后代的能力)較大程 度的改變，當(dāng)適合度有較大程度的增加(適合度利益)或降低(適合度成本)均可能導(dǎo)致不同 的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因在人工受控的不同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)植物的野生近緣物種群體 帶來適合度“利益”和“成本”變化的關(guān)鍵性狀進(jìn)行分析，對(duì)轉(zhuǎn)基因逃逸是否導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn) 以及風(fēng)險(xiǎn)的程度進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到轉(zhuǎn)基因植物安全種植的目的。
本發(fā)明提出的轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法，具體步驟包括(1) 構(gòu)建含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因野生近緣物種實(shí)驗(yàn)群體；(2)設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境 風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的田間種植實(shí)驗(yàn)；(3)建立轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。其中所述的構(gòu)建含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因野生近緣物種實(shí)驗(yàn)群體，是按照一定的組合方 式，利用人工雜交獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物和野生近緣物種的雜種F1代和自交分離F2代實(shí)驗(yàn)群 體來實(shí)現(xiàn)。具體的方法為選擇目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物及其非轉(zhuǎn)基因親本品種分別與野生近緣物種的個(gè)體進(jìn)行雜交，獲 得含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物-野生種的雜種F1群體(A)和不含轉(zhuǎn)基因的親本品種-野生種的 雜種F1群體(B)；通過對(duì)含轉(zhuǎn)基因的雜種F1進(jìn)行套袋自交，分別獲得含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的F2代分離群體；利用目標(biāo)轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)的引物，對(duì)F2代分離群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定含 有轉(zhuǎn)基因的F2群體(C)和不含轉(zhuǎn)基因的F2群體(D)。
根據(jù)上述方法所獲得的含有轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體(A)、不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體 (B)，含有轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體(C)和不含轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體(D)，進(jìn)行受控實(shí) 驗(yàn)條件下適合度分析實(shí)驗(yàn)。
所述設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的田間種植實(shí)驗(yàn)，是將獲得的A、B、C、 D實(shí)驗(yàn)群體分別按20cm X 20cm或40cm X 40cm的種植株距和行距，將含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因 的A和B群體或C和D群體在一個(gè)小區(qū)內(nèi)進(jìn)行單一種植和混合種植。即轉(zhuǎn)基因植株的單一 種植模式，非轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的相間混合種植模 式，見圖1 一圖3所示。
根據(jù)轉(zhuǎn)基因的類型或功能，將受控的實(shí)驗(yàn)環(huán)境分別設(shè)計(jì)為有選擇壓的環(huán)境和無選 擇壓的環(huán)境(例如針對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因植物將環(huán)境設(shè)置為有靶標(biāo)害蟲和無靶標(biāo)害蟲蟲壓的環(huán) 境)，將上述實(shí)驗(yàn)群體分別種植于有選擇壓的環(huán)境和無選擇壓的環(huán)境，并于實(shí)驗(yàn)群體植株生 活史的各生長(zhǎng)階段，分別進(jìn)行適合度相關(guān)性狀的測(cè)量。
用于檢測(cè)生態(tài)適合度所需進(jìn)行測(cè)量的形態(tài)和農(nóng)藝性狀，主要有株高(cm)、單株分 蘗數(shù)(個(gè))、單株穗數(shù)(個(gè))、單株種子產(chǎn)量(粒)、千粒重(g)、種子萌發(fā)率(％)、成苗率，等等，具 體應(yīng)根據(jù)所檢測(cè)植物的實(shí)際情況選定。
所述建立轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，即建立復(fù)合適合度指數(shù)， 來評(píng)價(jià)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)(％)的程度各形態(tài)性狀的適合度為含轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)量值/不含轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)量值X100%。
復(fù)合適合度為各形態(tài)性狀的適合度的平均數(shù)。
通過復(fù)合適合度的值(％)來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)(％)。
具體選擇如下適合度相關(guān)性狀進(jìn)行測(cè)量和分析根據(jù)受控實(shí)驗(yàn)中各處理含有轉(zhuǎn)基因的實(shí)驗(yàn)群體和不含轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)群體所測(cè)量的數(shù)據(jù) 的比較分析(A B和C D)，來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧壩锓N帶來的適合度利益(WB)或適 合度成本(WC)，并以此為依據(jù)確定轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。如轉(zhuǎn)基因?qū)?shí)驗(yàn)群體帶來 的適合度變化程度越高則轉(zhuǎn)基因逃逸的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越高，反之則風(fēng)險(xiǎn)低或無風(fēng)險(xiǎn)。
適合度利益(WB)或適合度成本(WC)的計(jì)算公式為W =(轉(zhuǎn)基因植株測(cè)量值-非轉(zhuǎn)基因植株測(cè)量值)/非轉(zhuǎn)基因植株測(cè)量值…(1) W的值變化在-ι 1之間，當(dāng)/f值為正值，表示存在適合度利益，當(dāng)/f值為負(fù)值，表示 存在適合度成本，當(dāng)/f值為0或接近于0，表示沒有適合度變化。
復(fù)合適合度指數(shù)為各性狀適合度的平均值，計(jì)算公式為Wcomp = Σ Wi-J /N ...........................................................................O)其中i_j為不同的適合度形狀，N為測(cè)量性狀的數(shù)目。
本發(fā)明為一種利用適合度分析檢測(cè)轉(zhuǎn)基因逃逸到農(nóng)作物野生近緣種帶來環(huán)境風(fēng) 險(xiǎn)的方法。本發(fā)明具體利用抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻及其野生近緣種(野生稻/雜 草稻)群體為分析材料，用轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因親本分別與野生稻和雜草稻進(jìn)行人工雜 交，獲得含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體以及含轉(zhuǎn)基因雜種F1代的自交分離F2代 群體。將含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體以及F2分離群體在有蟲壓和無蟲壓的環(huán)境下進(jìn)行田間種植，并對(duì)各群體的適合度相關(guān)性狀株高、單株分蘗數(shù)、單株穗數(shù)、單株結(jié)實(shí)數(shù) 和千粒重進(jìn)行測(cè)量。通過比較分析在有蟲壓環(huán)境下轉(zhuǎn)基因群體的適合度利益(WB)和無蟲 壓環(huán)境下轉(zhuǎn)基因群體的適合度成本(WC)，計(jì)算逃逸的轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧壏N帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn) (%)。本發(fā)明在受控條件下檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、效率高，對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻 商品化生產(chǎn)的環(huán)境安全保證具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為轉(zhuǎn)基因植株(X)的單一種植模式。
圖2為非轉(zhuǎn)基因植株(〇)的單一種植模式。
圖3為轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的相間混合種植模式。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 利用本發(fā)明的方法檢測(cè)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻Bt基因逃逸到雜草稻群體的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn) 材料如表1所示。
構(gòu)建環(huán)境生物安全檢測(cè)的含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因野生近緣種雜種實(shí)驗(yàn)群體的步 驟如下(1)確定雜交組合A.轉(zhuǎn)基因水稻X野生稻，B.非轉(zhuǎn)基因水稻親本X野生稻，C.轉(zhuǎn)基因水稻X雜草稻，D.非轉(zhuǎn)基因水稻X雜草稻；(2)通過人工雜交，分別獲得含轉(zhuǎn)基因(雜交組合A和C)以及不含轉(zhuǎn)基因(雜交組合B 和D)的雜種F1群體；(3)對(duì)組合A和C的雜種F1群體進(jìn)行套袋自交和轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)，鑒定F2分離群體的個(gè) 體是否包含轉(zhuǎn)基因；(4)分別獲得含轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(+)和不含轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(_)。
利用人工雜交方法，以轉(zhuǎn)基因栽培稻品系MFl和非轉(zhuǎn)基因栽培稻親本明恢86為 父本( )分別與雜草稻母本W(wǎng)l或W2 (早)進(jìn)行雜交，獲得含有Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因的F1代雜種 (MF1/W1和MF1/W2)和不含Si抗蟲轉(zhuǎn)基因的F1雜種(M86/W1和M86/W2)。同時(shí)，對(duì)含有轉(zhuǎn) 基因的F1雜種進(jìn)行套袋自交，獲得自交F2代分離群體，利用根據(jù)抗蟲轉(zhuǎn)基因(M) DNA序列 設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)，對(duì)F2分離群體進(jìn)行PCR鑒定，凡是含有轉(zhuǎn)基因的植株鑒定為Bt (+)， 不含轉(zhuǎn)基因的植株鑒定為Bt (-)。
在田間實(shí)驗(yàn)時(shí)，設(shè)置2個(gè)含價(jià)基因的F1代、2個(gè)不含Bt基因的F1代，2個(gè)F2代 Bt⑴群體和2個(gè)F2RBt㈠群體的單種模式，4個(gè)F1代和F2代價(jià)⑴和價(jià)㈠群體均勻 混合競(jìng)爭(zhēng)種植模式。因此本實(shí)驗(yàn)共包括12種處理，對(duì)每種處理設(shè)置4次重復(fù)(48個(gè)小區(qū))。 每個(gè)小區(qū)種植8行Χ8列植株，株間距20cm。小區(qū)完全隨機(jī)(區(qū)組)的方案進(jìn)行田間布局和 種植。將此實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)不同的蟲壓環(huán)境中進(jìn)行1)通過常規(guī)噴灑化學(xué)農(nóng)藥的極低蟲壓環(huán)境， 和2)不施用任何化學(xué)農(nóng)藥的自然蟲壓環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)材料不同的生育期，分別對(duì)拔節(jié)期的單株分蘗數(shù)、成熟期的株高、植株成熟后的單株穗數(shù)、單種種子數(shù)、千粒重和種子萌發(fā)率等適 合度性狀進(jìn)行測(cè)量，即選擇如下性狀(1)株高(cm)從植株的地面到最長(zhǎng)莖葉(穗)的高度；(2)單株分蘗數(shù)(個(gè))每一單個(gè)植株的所有分蘗總合；(3)單株穗數(shù)(個(gè))每一單個(gè)植株所有的穗數(shù)總合；(4)單株種子產(chǎn)量(粒)每一單個(gè)植株的所有飽滿果實(shí)數(shù)總合；(5)千粒重(g):1000粒種子的重量;(6)種子萌發(fā)率(％):萌發(fā)種子數(shù)/用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的種子數(shù)X100%;(7)成苗率(％)幼苗數(shù)/用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的種子數(shù)X100%。
結(jié)果如表2所示。從對(duì)各個(gè)適合度性狀的單獨(dú)分析來看，在低蟲壓環(huán)境中，含轉(zhuǎn)基 因的材料與不含轉(zhuǎn)基因的材料在各性狀上都基本一致，僅有少數(shù)性狀有顯著差異，說明抗 蟲轉(zhuǎn)基因在沒有蟲壓的情況下，對(duì)雜草稻群體的適合度幾乎沒有影響。而在高蟲壓環(huán)境中， 含轉(zhuǎn)基因材料的適合度性狀值要較非轉(zhuǎn)基因材料高，尤其是在單株種子產(chǎn)量性狀上呈現(xiàn)出 顯著差異，由此可以說明抗蟲轉(zhuǎn)基因在高蟲壓條件下會(huì)對(duì)雜草稻帶來適合度的優(yōu)勢(shì)。
而采用復(fù)合適合度指數(shù)法，先將含轉(zhuǎn)基因材料適合度各性狀的值轉(zhuǎn)化成相對(duì)于非 轉(zhuǎn)基因材料增加或減少的比例(W值)，通過計(jì)算復(fù)合適合度指數(shù)考察抗蟲轉(zhuǎn)基因?qū)m合度 的影響(表3)。轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻的外源價(jià)基因逃逸到雜草稻以后，含轉(zhuǎn)基因F1和F2群體 在低蟲壓的環(huán)境中，除了在單株穗數(shù)上比其不含轉(zhuǎn)基因的F1和F2群體要高以外，其它適合 度性狀均沒有統(tǒng)一的趨勢(shì)，含轉(zhuǎn)基因的F1代和F2代在單種和混種條件下的復(fù)合適合度指數(shù) 也僅比后者的復(fù)合適合度高5. 5%、1. 8%、5. 0%和4. 8%，這表明含有轉(zhuǎn)基因的雜種F1和F2群 體在低蟲壓的環(huán)境中與其不含轉(zhuǎn)基因的群體的適合度基本一致(<5%)。而在自然高蟲壓 的環(huán)境中，含轉(zhuǎn)基因的F1和F2群體在重要的單株種子產(chǎn)量性狀上較其非轉(zhuǎn)基因群體遠(yuǎn)高以 外，其它適合度性狀也都有一定程度的提高，因此含轉(zhuǎn)基因的F1代和F2代在高蟲壓的單種 和混種條件下的復(fù)合適合度指數(shù)也比后者的復(fù)合適合度高10. 8%、7. 7%,22. 0%和12. 0%，這 表明含有轉(zhuǎn)基因的雜種F1和F2群體的適合度在高蟲壓的環(huán)境中遠(yuǎn)高于其不含轉(zhuǎn)基因的群 體(>10%)。也表明含有轉(zhuǎn)基因的分離群體比其不含轉(zhuǎn)基因的群體具有更高的生存和競(jìng)爭(zhēng) 優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步推斷，轉(zhuǎn)抗蟲Bt基因逃逸到雜草稻群體，會(huì)在有蟲害的情況下導(dǎo)致雜草稻的 更旺盛生長(zhǎng)，帶來一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例2 利用本發(fā)明方法檢測(cè)抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻Jroa基因逃逸到普通野生稻的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。 實(shí)驗(yàn)材料如表4所示。
利用人工雜交的方法，以抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻MA和非轉(zhuǎn)基因水稻M86為父本($ ) 分別與普通野生稻W(wǎng)2 (作為母本早)進(jìn)行雜交，獲得包含有抗除草劑轉(zhuǎn)基因的F1 (W2-MA) 和不含抗除草劑轉(zhuǎn)基因的F1 (W2-M86)雜種群體。
在進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)時(shí)，設(shè)置含抗除草劑的F1群體(W2-MA)單種、不含抗除草劑的F1 群體(W2-M86)單種及W2-MA和W2-M86均勻混合競(jìng)爭(zhēng)種植的處理，種植于不噴灑除草劑和 噴灑除草劑的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)包括6種處理，每一處理包括4次重復(fù)(共M個(gè)小區(qū))，每個(gè)小 區(qū)種植8行X8列植株，株間距40cm。小區(qū)完全隨機(jī)(區(qū)組)的方案進(jìn)行田間布局和種植。 在實(shí)驗(yàn)材料不同的生育期，分別對(duì)拔節(jié)期的單株分蘗數(shù)、成熟期的株高、植株成熟后的單株穗數(shù)、單種種子數(shù)、千粒重和種子萌發(fā)率等適合度性狀進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如表4所示。
從對(duì)各個(gè)適合度性狀的單獨(dú)分析來看，在噴灑除草劑的環(huán)境中，由于非轉(zhuǎn)基因水 稻受到除草劑影響，大多數(shù)不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育，在生殖性狀很低；而轉(zhuǎn)基因材料則基本不 受影響，兩者田間表現(xiàn)差異巨大。而在沒有噴灑除草劑的環(huán)境中，抗除草劑基因依舊表現(xiàn)出 一定的適合度優(yōu)勢(shì)，這主要體現(xiàn)在單株分蘗數(shù)、單株穗數(shù)和單株種子數(shù)上(表5)。
而釆用復(fù)合適合度法對(duì)含轉(zhuǎn)基因的Fl代群體和不含轉(zhuǎn)基因的Fl代群體進(jìn)行綜合 評(píng)估時(shí)，發(fā)現(xiàn)含在使用除草劑的情況下，轉(zhuǎn)基因的F1代群體的適合度在單種和混種模式下 要相較于不含轉(zhuǎn)基因群體的適合度分別高172. 9%和255. 3% (表6)，這表明抗除草劑Xtt^ 基因在逃逸后如果遇到除草劑選擇壓，將會(huì)提供巨大的適合度優(yōu)勢(shì)。而在不使用除草劑情 況下，轉(zhuǎn)基因材料的復(fù)合度指數(shù)相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因材料為8. 8%和12. 0%，表明基因在逃 逸到?jīng)]有除草劑使用的環(huán)境中后，也為野生稻群體提高期適合度，導(dǎo)致相應(yīng)的生態(tài)結(jié)果。
表1、實(shí)施例1中所包含的實(shí)驗(yàn)材料。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法，其特征在于具體步驟為(1)構(gòu) 建含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因野生近緣物種實(shí)驗(yàn)群體；(2)設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng) 險(xiǎn)檢測(cè)的田間種植實(shí)驗(yàn)；(3)建立轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；其中所述構(gòu)建含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因野生近緣物種實(shí)驗(yàn)群體，是按照一定的組合方式， 利用人工雜交獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物和野生近緣物種的雜種F1代和自交分離F2代實(shí)驗(yàn)群體 來實(shí)現(xiàn)，具體步驟為選擇目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物及其非轉(zhuǎn)基因親本品種，分別與野生近緣物種的個(gè)體進(jìn)行雜交， 獲得含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物-野生種的雜種F1群體(A)和不含轉(zhuǎn)基因的親本品種-野生種 的雜種F1群體(B)；通過對(duì)含轉(zhuǎn)基因的雜種F1進(jìn)行套袋自交，分別獲得含有轉(zhuǎn)基因和不含 轉(zhuǎn)基因的F2代分離群體；利用目標(biāo)轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)的引物，對(duì)F2代分離群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定 含有轉(zhuǎn)基因的F2群體(C)和不含轉(zhuǎn)基因的F2群體(D)；根據(jù)上述方法所獲得的含有轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體(A)、不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體(B)， 含有轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體(C)和不含轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體(D)，進(jìn)行受控實(shí)驗(yàn)條 件下適合度分析實(shí)驗(yàn)；所述設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的田間種植實(shí)驗(yàn)，是將獲得的A、B、C、D實(shí) 驗(yàn)群體分別按20cmX 20cm或40cmX 40cm的種植株距和行距，將含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的 A和B群體或C和D群體在一個(gè)小區(qū)內(nèi)進(jìn)行單一種植和相間混合種植；即分為3種種植模 式轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，非轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植 株的相間混合種植模式；根據(jù)轉(zhuǎn)基因的類型或功能，將受控的實(shí)驗(yàn)環(huán)境分別設(shè)計(jì)為有選擇壓的環(huán)境和無選擇壓 的環(huán)境，將上述實(shí)驗(yàn)群體分別種植于有選擇壓的環(huán)境和無選擇壓的環(huán)境，并于實(shí)驗(yàn)群體植 株生活史的各生長(zhǎng)階段，分別進(jìn)行適合度相關(guān)性狀的測(cè)量；所述建立轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，即建立復(fù)合適合度指數(shù)，來評(píng) 價(jià)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的程度，用％表示各形態(tài)性狀的適合度為含轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)量值/不含轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)量值X 100% ；復(fù)合適合度為各形態(tài)性狀的適合度的平均數(shù)；通過復(fù)合適合度的值(％)來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)(％)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法，其特征在于所 述按照一定的組合方式，利用人工雜交獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物和野生近緣物種的雜種F1代和 自交分離F2代實(shí)驗(yàn)群體來實(shí)現(xiàn)，具體步驟為(1)確定雜交組合A.轉(zhuǎn)基因水稻X野生稻；B.非轉(zhuǎn)基因水稻親本X野生稻；C.轉(zhuǎn)基因水稻X雜草稻；D.非轉(zhuǎn)基因水稻X雜草稻；(2)通過人工雜交，分別獲得含轉(zhuǎn)基因包括雜交組合A和C，以及不含轉(zhuǎn)基因包括雜交 組合B和D的雜種F1群體；(3)對(duì)組合A和C的雜種F1群體進(jìn)行套袋自交和轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)，鑒定F2分離群體的個(gè) 體是否包含轉(zhuǎn)基因；(4)分別獲得含轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(+ )和不含轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(_)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法，其特征在于所 述適合度相關(guān)性狀選擇如下株高，cm 從植株的地面到最長(zhǎng)莖葉或穗的高度； 單株分蘗數(shù)，個(gè)每一單個(gè)植株的所有分蘗總合； 單株穗數(shù)，個(gè)每一單個(gè)植株所有的穗數(shù)總合； 單株種子產(chǎn)量，粒每一單個(gè)植株的所有飽滿果實(shí)數(shù)總合； 千粒重，g :1000粒種子的重量；種子萌發(fā)率，% 萌發(fā)種子數(shù)/用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的種子數(shù)X 100% ； 成苗率，% 幼苗數(shù)/用于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的種子數(shù)X100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法，其特征在于所 述具體選擇如下適合度相關(guān)性狀進(jìn)行測(cè)量和分析根據(jù)受控實(shí)驗(yàn)中各處理含有轉(zhuǎn)基因的實(shí)驗(yàn)群體和不含轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)群體所測(cè)量的數(shù)據(jù) 的比較分析，來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧壩锓N帶來的適合度利益或適合度成本，并以此為依 據(jù)確定轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)；如轉(zhuǎn)基因?qū)?shí)驗(yàn)群體帶來的適合度變化程度越高則轉(zhuǎn) 基因逃逸的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越高，反之則風(fēng)險(xiǎn)低或無風(fēng)險(xiǎn)； 適合度利益或適合度成本的計(jì)算公式為W =(轉(zhuǎn)基因植株測(cè)量值-非轉(zhuǎn)基因植株測(cè)量值)/非轉(zhuǎn)基因植株測(cè)量值…(1) W的值變化在-1 1之間，當(dāng)/f值為正值，表示存在適合度利益，當(dāng)/f值為負(fù)值，表示 存在適合度成本，當(dāng)/f值為0或接近于0，表示沒有適合度變化； 復(fù)合適合度指數(shù)為各性狀適合度的平均值，計(jì)算公式為Wcomp = Σ Wi^J /N ...........................................................................O)其中i_j為不同的適合度形狀，N為測(cè)量性狀的數(shù)目。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境生物安全檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明利用抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻及其野生近緣種群體為分析材料，經(jīng)過組合，進(jìn)行人工雜交，獲得含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體以及含轉(zhuǎn)基因雜種F1代的自交分離F2代群體。將F1群體以及F2分離群體在有蟲壓和無蟲壓的環(huán)境下進(jìn)行田間種植，并對(duì)各群體的適合度相關(guān)性狀進(jìn)行測(cè)量。通過比較分析轉(zhuǎn)基因群體的適合度利益和適合度成本，計(jì)算逃逸的轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧壏N帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)(%)。本發(fā)明在受控條件下檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，效率高，對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻商品化生產(chǎn)的環(huán)境安全保證具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102031303SQ201010504128
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者盧寶榮, 夏輝, 楊簫, 汪魏, 蔡星星 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)