專利名稱：一種用于擴(kuò)增hsv-1堿性核酸酶基因的試劑盒和表達(dá)hsv-1堿性核酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得病毒蛋白的方法，具體涉及一種用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSV-I堿性 核酸酶基因，通過基因表達(dá)得到HSV-I堿性核酸酶的方法。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒I型(HSV-I)為有包膜的DNA病毒，是危害人類健康的常見病原體， 且容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染和潛伏感染。HSV-I感染部位廣泛，能引起口唇皰疹、生殖器皰疹、腦 炎、角膜炎等，并與宮頸癌和唇癌有關(guān)。HSV-I具有神經(jīng)毒性，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)、破壞神 經(jīng)細(xì)胞。堿性核酸酶是由HSV-I基因組中UL12基因編碼的，其具有5' 3'的核酸外切 酶和核酸內(nèi)切酶活性，因其反應(yīng)最適PH值較高，所以被認(rèn)為是堿性核酸酶。其在HSV-I的 復(fù)制中起著重要作用，有研究證實(shí)堿性核酸酶能正確修復(fù)DNA復(fù)制過程中的斷裂和缺口， 并能使處于復(fù)制狀態(tài)的病毒基因組易于包裝。該編碼基因被敲除后HSV-I突變體復(fù)制幾乎 停止，說明堿性核酸酶為病毒體內(nèi)繁殖所必需。還有實(shí)驗(yàn)證明，在非容納細(xì)胞中產(chǎn)生的UL12 基因缺陷病毒，由于基因異常而很難感染新的細(xì)胞。上述研究證明堿性核酸酶在病毒復(fù)制 及感染過程中非常關(guān)鍵，對于闡述抗HSV-I藥物作用機(jī)理以及建立一種新的干預(yù)手段提供 了思路，也為堿性核酸酶成為一種新的抗HSV-I藥物篩選靶點(diǎn)提供了證據(jù)。因此，純化得到 大量堿性核酸酶非常重要。然而，因UL12基因片段長，GC含量高，難以通過常規(guī)的PCR方法方便、準(zhǔn)確地獲得 全序列的UL12基因片段，進(jìn)而獲得大量純化且有活性的堿性核酸酶。文獻(xiàn)Purification and Characterization of Herpes Simplex Virus Type 1 Alkaline Exonuclease Expressed in Escherichia coli. JOURNAL OF VIROLOGY. 1996 (3) :2008_2013 中，報(bào)道了 以基因工程方法獲得堿性核酸酶的方法從HSV-I基因組中分離4. 3kb的HindIII-PstI片 段；將該片段克隆到PUC19中構(gòu)建pHP-AE ；通過三次亞克隆最終將目的基因片段插入表達(dá) 質(zhì)粒pET-25b(+)中；將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)；變性復(fù)性獲得活性蛋白。該方 法的技術(shù)方案復(fù)雜，且難以獲得大量堿性核酸酶，成本高，工業(yè)化應(yīng)用困難。也未見有堿性 核酸酶的市售品。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了用基因工程技術(shù)大量獲得HSV-I堿性核酸酶的 方法。因此，本發(fā)明目的之一是提供一種用于擴(kuò)增UL12基因片段的試劑盒，包括核苷酸 序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物對1和其他相關(guān)試劑。該試劑盒優(yōu)選還包含T載體。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)獲得有活性的堿性核酸酶的方法，其步驟如 下
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(1)擴(kuò)增目的基因提取HSV-I病毒基因組作為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的 核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C變 性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基 因片段；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒將獲得的UL12基因片段與表達(dá)質(zhì)粒連接，獲得重組表達(dá)質(zhì) 粒；(3)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(2)獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)含有重組表達(dá) 質(zhì)粒的大腸桿菌使其復(fù)制至處于對數(shù)期；加入異丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)表 達(dá)；離心收集菌體；(4)變性破碎步驟(3)獲得的菌體，離心收集沉淀，用包含變性劑的洗滌液洗滌 沉淀，獲得蛋白溶液；(5)復(fù)性用復(fù)性液復(fù)性步驟(4)獲得的蛋白溶液，獲得活性蛋白。上述步驟(1)所述擴(kuò)增目的基因的方法優(yōu)選為提取HSV-I病毒基因組作為模板， 以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序 為96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s, 68 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基因片段；將擴(kuò)增得到的UL12基因片段與T載體連接形成重組 T載體，再以該重組T載體為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物進(jìn)一步 擴(kuò)增得到核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的UL12目的基因片段，擴(kuò)增條件不變。所述退 火、延伸溫度均優(yōu)選為68 °C。上述步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒為pET系列質(zhì)粒，優(yōu)選為pET32a_UL12或者pET28a_UL12 質(zhì)粒。上述步驟(3)中大腸桿菌為E. coli BL12菌株，或者為E. coli Rosetta菌株。上述步驟(4)中變性采用的方法為用洗滌液A兩次洗滌步驟(3)獲得的菌體；冷凍超聲破碎菌體，離心收集沉淀； 用洗滌液B、C、D依次洗滌、離心、收集沉淀；用洗滌液E洗滌沉淀，獲得蛋白溶液；所述的洗滌液A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA, IOOmMNaCl 的溶液；洗滌液B:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、1 % NP40 (乳化劑 NP40系列)的溶液；洗滌液C:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液D:包含 50mM Tris-HCl [pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、0· 5 % TritonX-lOOU. 5M鹽酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液E 包含 IOOmM Tri s-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、100mM NaClUOmM β-巰基乙 醇、ImM苯甲基磺酰氟和4 6Μ鹽酸胍的溶液。其中鹽酸胍濃度優(yōu)選為4Μ。上述步驟(5)中復(fù)性液為包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl,5% 甘油1 %甘氨酸和鹽酸胍濃度逐步減小的溶液，所述鹽酸胍濃度依次為4M、3M、2M、IM和0M。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)克服了現(xiàn)有技術(shù)的障礙，準(zhǔn)確擴(kuò)增了片段長度達(dá)1881bp，GC含量 高于71%的UL12基因片段，得到序列與GeneBank已公布序列同源性高達(dá)98. 2%。通過構(gòu) 建表達(dá)質(zhì)粒、誘導(dǎo)表達(dá)、變性和復(fù)性一系列步驟得到具有較高核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶活
5性的堿性核酸酶。這為進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)制有十分重要的意義，且為體外構(gòu)建堿性核 酸酶的藥物篩選分子模型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1實(shí)施例1中擴(kuò)增得到的UL12基因片段凝膠電泳結(jié)果。泳道M =DNA Marker DL2000 ；泳道1 :UL12基因；泳道2 :UL12基因。圖2進(jìn)一步擴(kuò)增得到的UL12基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為DL2，000DNA Marker,作為標(biāo)記；泳道2為用EcoR I/Hind III切割純化重組pMD19T載體；泳道3為 用 EcoR I/Hind III 切割純化 pET28a_UL12 ；泳道 4 是空載質(zhì)粒 pET28a(+)，用 EcoR I/ Hind III處理后作為對照；泳道5為沒有酶切處理的pET28a-UL12 ；泳道6為λ-Hind III digest DNAMarker,作為標(biāo)記。圖3進(jìn)一步擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段送大連 寶公司測序的彩色波形圖。圖3a中第259 1個(gè)堿基對應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸 序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第1 259個(gè)堿基，且為互補(bǔ)堿基； 圖3b中第663 1個(gè)堿基對應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示的 HSV-117毒株基因序列中第178 835個(gè)堿基，且為互補(bǔ)堿基；圖3c中1 703個(gè)堿基對 應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第 774 1476個(gè)堿基；圖3d中第1 436個(gè)堿基對應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸序列如 SEQ ID NO 4所示的HSV-117毒株基因序列中第1447 1881個(gè)堿基。圖4進(jìn)一步擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段序列與 核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的標(biāo)準(zhǔn)國際株序列對比結(jié)果。每一小組為3列，第一列為 GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ IDNO 4所示的HSV-117毒株基因序列的UL12基因序 列，即國際標(biāo)準(zhǔn)UL12基因序列，第二列為本發(fā)明擴(kuò)增得到的UL12基因序列，即實(shí)測UL12基 因序列，第三列為第一列和第二列的共有序列。圖5不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對表達(dá)量影響的結(jié)果圖。泳道3至泳道8對應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)間為 10h，8h，6h，4h，3h，0h。泳道2和泳道10作為對照，未添加IPTG，表達(dá)時(shí)間IOh0蛋白質(zhì)分 子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，在泳道1和泳道9，作為標(biāo)記。圖6pET32a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果圖。泳道1為pET32a_UL12的 E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道2為pET32a的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子 IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道3為pET32a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì) 菌培養(yǎng)液上清；泳道4為pET32a的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌培養(yǎng)液上清；泳 道5為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，作為標(biāo)記；泳道6為IPTG誘導(dǎo)后pET32a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道7為IPTG誘導(dǎo)后pET32a的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng) 超聲裂解后的上清；泳道8為pET32a-UL12的E. coliBL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂 解后的沉淀；泳道9為pET32a的E. coliBL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀。圖7pET28a_UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果圖。泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，作為標(biāo)記；泳道2為pET28a的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋 白；泳道3為pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白；泳道4為 pET28a的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀；泳道5為pET28a_UL12 的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀；泳道6為IPTG誘導(dǎo)后pET28a 的E. coliBL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道7為IPTG誘導(dǎo)后pET28a_UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清。圖8不同洗滌液變性處理后，堿性核酸酶存在形式鑒定圖。泳道1是用變性劑A 和變性劑C處理后的上清液；泳道2是經(jīng)過變性劑A和變性劑B處理后的上清液；泳道3是 用變性劑A、B、C、D和E處理后的沉淀，且變性劑E中鹽酸胍的濃度為4M ；泳道4是用變性 劑A、B、C、D和E處理后的沉淀，且變性劑E中鹽酸胍的濃度為6M ；泳道5是蛋白質(zhì)分子量 標(biāo)準(zhǔn)(低)，作為標(biāo)記；泳道6是經(jīng)過變性劑A和變性劑B處理后的沉淀；泳道7是用變性 劑A和變性劑C處理后的沉淀。圖9堿性核酸酶活力測定的結(jié)果圖。E. coli BL21和E. coli Rosetta產(chǎn)生的堿 性核酸酶對pcDNA3. O質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)的結(jié)果泳道M λ Hind IIIdigest DNA Marker ； 泳道1 :pcDNA3. O對照；Ε. coli Rosetta表達(dá)的堿性核酸酶與pcDNA3. O反應(yīng)于37°C孵育 5min (泳道 2)，20min (泳道 4)，40min (泳道 6)，60min (泳道 8) ；E. coli BL21 表達(dá)的堿性核 酸酶與pcDNA3. O反應(yīng)于37 0C孵育5min (泳道3)，20min (泳道5)，40min (泳道7)，60min (泳 道9)。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料和儀器以下實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料和儀器，除特別說明，均為市售購買。(1)材料標(biāo)準(zhǔn)單純皰疹病毒I型(HSV-I) SM44株，購自中國生物制品檢定所；Vero細(xì)胞購于四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)生部移植工程與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；E.coli BL12(DE3)plysS 菌株、Ε· coli Rosetta(DE3)、原核表達(dá)載體 pET32a(+)、 pET28a (+)，購自 Novagen 公司；高保真Taq 酶、T4DNA 連接酶、DL2, OOODNA Marker、λ -Hind III digestDNAMarker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindIII, E. coli JM109 菌株、pMD19-T 載體、dNTPs、LA Taq 酶、GC buffer, EDTA, NP-40、TritonX-100，購于 大連TaKaRa公司；核酸測序由大連TaKaRa公司完成；鹽酸胍、異丙基硫代-β -D半乳糖苷(IPTG)為美國AMRESC0產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自美國OMEGA公司；核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示的引物或者核苷酸序列，由上海Sangon Biotech公司合成；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司、LB培養(yǎng)基購自英國0X0ID公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)，購自Sigma公司；ddH20、MgCl2,乙醇、PBS 緩沖液、Tris-HCl 緩沖液、NaCl、甘油、甘氨酸、SDS-PAGE
7和瓊脂糖凝膠電泳的各種常規(guī)試劑。(2)儀器PCR儀，購自美國Thermo公司；紫外可見分光光度計(jì)，購自美國Bio-Rad公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱為青島海爾的產(chǎn)品；超濾管，購自美國MILLIP0RE公司；離心機(jī)，購自德國Eppendorf公司；超聲細(xì)胞破碎儀。實(shí)施例1擴(kuò)增UL12基因片段(1)提取病毒基因組用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)vero細(xì)胞，接 種HSV-I待細(xì)胞病變，即CPE達(dá)到+++ ++++，收獲細(xì)胞，用病毒DNA抽提試劑盒抽提HSV-I 全基因組；(2)依據(jù)GenBank公布的UL12基因片段的核苷酸序列，用PRIMER5. O軟件設(shè)計(jì)引 物，引物序列如SEQ ID NO :1 2所示；(3)擴(kuò)增目的基因以提取得到的HSV-I全基因組為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物對1為引物，擴(kuò)增目的基因UL12基因片段反應(yīng)體系模板Ιμ 核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示引物1 μ 1核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示引物1 μ 1GC buffer12. 5μ 1dNTP2 μ 1LAtaq 酶0. 25 μ 1ddH207· 25 μ 1反應(yīng)條件96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 IOmin0(4)產(chǎn)物回收0. 8%常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以膠回收試劑盒回收擴(kuò) 增產(chǎn)物。凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的DNA片段為1881bp，與已知UL12基因片段大小相 同。(結(jié)果見圖1)實(shí)施例2進(jìn)一步擴(kuò)增UL12基因片段(1)制備模板在T4DNA連接酶作用下將實(shí)施例1得到的UL12基因片段與pMD-19T 載體連接，構(gòu)建成重組PMD19T載體。(2)擴(kuò)增目的基因以步驟(1)得到的連接有UL12基因片段的重組pMD19T載體為 模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物對為引物擴(kuò)增目的基因UL12基因片段反應(yīng)體系模板1 μ 1核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示引物 1 μ 1核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示引物 1 μ 1
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GC buffer
12. 5μ 1 2μ 1dNTP 為LAtaq 為(！卿為
0. 25μ 1 7. 25 μ 1反應(yīng)條件96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 IOmin0(3)產(chǎn)物回收0. 8%常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以膠回收試劑盒回收擴(kuò) 增產(chǎn)物。(4)結(jié)果檢測將膠回收得到的UL12基因片段與pMD_19T載體連接，構(gòu)建成重組 PMD19T載體，瓊脂糖凝膠電泳并測序檢驗(yàn)擴(kuò)增得到的UL12基因片段。結(jié)果如圖2、圖3和圖4。圖2顯示凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的DNA片段大約 為1.9kb，與已知UL12基因片段大小相同。圖3為核苷酸序列測序的彩色波形圖，證明通過 本發(fā)明方法擴(kuò)增得到了核苷酸序列如SEQID N0:3所示的UL12基因片段。圖4為本發(fā)明擴(kuò) 增得到的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12基因片段序列與標(biāo)準(zhǔn)國際株UL12基因片 段序列對比結(jié)果，從圖4可知，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12實(shí)測序列核苷酸 序列如SEQ ID NO 4所示的UL12標(biāo)準(zhǔn)國際株序列=1866/1881 = 99. 20%，也就是說，本 發(fā)明擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ IDNO :3所示的UL12基因片段與核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的標(biāo)準(zhǔn)國際株序列的同源性為99. 20%，證明本發(fā)明準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增了 UL12目的基因 片段。實(shí)施例3堿性核酸酶的表達(dá)和存在形式的鑒定(1)重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建將實(shí)施例1或者實(shí)施例2得到的UL12基因片段在EcoRI、HindIII內(nèi)切酶作用下 與pET28a(+)質(zhì)粒或者pET32a(+)連接形成pET28a_UL12重組表達(dá)質(zhì)?；蛘遬ET32a_UL 12 重組表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，控制堿性核酸酶的表達(dá)，并包含 有2個(gè)His標(biāo)簽，可以用來純化蛋白。(2)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(1)得到的pET28a_UL 12重組表達(dá)質(zhì)粒通過CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)于含有50μ g/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)板上，220r/min振搖過夜；挑取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌克?。粚⒋竽c桿菌克隆直接接種到50ml含有50 μ g/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C 搖瓶培養(yǎng)，直到0D600值為0. 4 0. 6 ；加入終濃度為0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C搖瓶1 10小時(shí)后，離心收集菌體。(3)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(1)得到的pET32a_UL 12重組表達(dá)質(zhì)粒通過CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)于含有30 μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml的氯霉素LB培養(yǎng) 板上，220r/min振搖過夜培養(yǎng)；挑取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌克?。粚⒋竽c桿菌克隆直接接種到50ml含有30 μ g/ml氨芐青霉素和34 μ g/ml的氯霉 素的LB培養(yǎng)基中，在37°C搖瓶培養(yǎng)，直到OD6tltl值為0. 4 0. 6 ；
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加入終濃度為0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C搖瓶1 10小時(shí)后，離心收集菌體。將誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5顯示，泳道3 8中目的蛋白條帶依 次減弱，也就是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的減少，其蛋白表達(dá)量逐漸降低。因此，確定最優(yōu)的誘導(dǎo)時(shí)間 為 IOh0(4)堿性核酸酶存在形式的鑒定將步驟(2)或者(3)所得菌體，加500 μ 1 PBS溶液重懸，50 μ 1菌液留樣，其余菌 液進(jìn)行超聲破碎(3min，400w)，冷凍離心(4°C，12000rmp, 15min)，分別收集上清和沉淀，沉 淀用PBS重懸。菌液留樣、上清和沉淀各加等體積2XSDS加樣緩沖液，100°C加熱5min變 性，取樣用12% SDS-PAGE檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組堿性核酸酶存在于包涵體中。結(jié)果如圖6和圖7 所示。已知堿性核酸酶大小為86kDa，圖6顯示pET32a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié) 果；圖7顯示pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子表達(dá)結(jié)果。圖6泳道1顯示pET32a_UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白； 泳道6顯示IPTG誘導(dǎo)后pET32a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后的上清；泳道8 顯示pET32a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀(包涵體)。 泳道1和泳道8中有大小為86kD的目的條帶，而在其他泳道則沒有。結(jié)果證明，目的蛋白 存在于重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液和經(jīng)超聲裂解后的沉淀中，也就是說，目的蛋白以 包涵體的形式存在，用Bio-Rad公司提供的Quantity One圖像分析軟件對圖6第1泳道的 目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，堿性核酸酶表達(dá)量占菌體總蛋白的17.4% .圖7泳道3顯示pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌總蛋白； 泳道5顯示pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解后的沉淀(包 涵體)；泳道7顯示pET28a-UL12的E. coli BL21轉(zhuǎn)化子經(jīng)超聲裂解后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的上 清。泳道3和泳道5中有大小為86kD的目的條帶，而在其他泳道則沒有。結(jié)果證明，目的 蛋白存在于重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液和經(jīng)超聲裂解后的沉淀中，也就是說，目的蛋 白以包涵體的形式存在，用Bio-Rad公司提供的Quantity One圖像分析軟件對圖7第3泳 道的目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，堿性核酸酶表達(dá)量占總表達(dá)量28%以上。實(shí)施例4堿性核酸酶的變性、復(fù)性和活力測定(1)變性1)將實(shí)施例3步驟⑵或者(3)所得菌體用5ml洗滌液A(50mMTris-HCl [pH8. 0]、 2mM EDTAUOOmM NaCl)洗兩次；2) 4°C下，收集細(xì)菌在冰浴上經(jīng)過4min超聲處理，破碎細(xì)胞，得到菌液；3)4°C 下，用 5ml 洗滌液 B(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaClU % NP-40,即乳化劑NP-40系列)的超聲洗滌菌液；4)4°C下，12000rpm 離心 15min，收集沉淀；5)4°C 下，用 5ml 洗滌液 C(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、3% TritonX-IOOUmM PMSF,即甲基磺酰氟)超聲洗滌沉淀；6) 12000rpm 離心 15min，收集沉淀；7)41下，用51111洗滌液0(501111 Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTA, IOOmM NaCl、0· 5% TritonX-lOOU. 5Μ鹽酸胍和ImM PMSF)超聲洗滌沉淀；8) 12000rpm 離心 15min，收集沉淀；
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9)用 5ml 洗滌液 E(4M 或者 6M 鹽酸胍、IOOmM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM β巰基乙醇、和ImM PMSF)洗滌沉淀；10)收集上清在-80°C保存，蛋白質(zhì)濃度用Bio-Rad分光光度計(jì)進(jìn)行測量。變性最優(yōu)條件如圖8所示，當(dāng)洗滌液E中的鹽酸胍濃度為4M時(shí)，處理后的沉淀幾 乎沒有目標(biāo)蛋白，目標(biāo)蛋白溶于洗滌液，非常有利于復(fù)性。(2)復(fù)性取Iml步驟(1)得到的蛋白溶液，用復(fù)性液(50mMTr i s-HCl [pH8. 0],2mM EDTA, 50mM NaCl、5 %甘油、1 %甘氨酸和濃度遞減的鹽酸胍，鹽酸胍的濃度依次為4M、3M、2M、IM和 0M)將其稀釋到0. 1-lmg/ml，在透析袋中復(fù)性，復(fù)性時(shí)間為24h，最后用超濾管(4500rpm， 10min,4°C )離心收集復(fù)性蛋白溶液，放置-20°C冰箱保存。(3)活力檢測取步驟⑵得到的復(fù)性蛋白溶液稀釋到0. 12mg/ml，用pcDNA3. 0質(zhì)?；蛘呔€性 UL12基因片段作為底物，進(jìn)行酶活性測定。反應(yīng)體系為6. 5 μ 1 200mM Tris-HCl [pH = 9. 0]1. 5μ 1 50mM MgCl22μ 1 pcDNA3. 0 質(zhì)粒15 μ 1 ddH2010 μ 1 復(fù)性蛋白溶液反應(yīng)條件37°C，5/20/40/60min。反應(yīng)相應(yīng)時(shí)間后取出5μ 1反應(yīng)液，用1μ 1 6 X Loading Buffer終止反應(yīng)，放 于-20°C冰箱，取樣做瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。pcDNA3. 0質(zhì)粒用于檢測堿性核酸酶的外切酶活性，線性UL12基因片段用于檢測 堿性核酸酶的內(nèi)切酶活性。結(jié)果如圖9所示，本發(fā)明得到的堿性核酸酶可以有效的降解核酸，酶活性比較高， 且反應(yīng)時(shí)間為60min時(shí)，降解效果最好。綜上所述，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的方法操作簡便、成本低廉，得到的產(chǎn)品活性較高 且量大，為堿性核酸酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。
1權(quán)利要求
一種用于擴(kuò)增單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12的試劑盒，包含核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的引物對和其他相關(guān)試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12的試 劑盒，其特征在于還包含T載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于擴(kuò)增單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12的試 劑盒，其特征在于所述T載體為pMD19-T載體。
4.一種表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其特征在于包括如 下步驟(1)擴(kuò)增目的基因提取單純皰疹病毒I型病毒基因組作為模板，以SEQID NO :1 2 所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min， 95°C變性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ；膠回收擴(kuò)增的 UL12基因片段；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒將獲得的UL12基因片段與表達(dá)質(zhì)粒連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；(3)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(2)獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)含有重組表達(dá)質(zhì)粒 的大腸桿菌使其復(fù)制至處于對數(shù)期；加入異丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)；離心收 集菌體；(4)變性破碎步驟(3)獲得的菌體，離心收集沉淀，用包含變性劑的洗滌液洗滌沉淀， 獲得蛋白溶液；(5)復(fù)性用復(fù)性液復(fù)性步驟(4)獲得的蛋白溶液，獲得活性蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于步驟(1)所述擴(kuò)增目的基因的方法為提取單純皰疹病毒I型病毒基因組作為 模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-I的UL12基因片段，擴(kuò)增 程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延 伸IOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基因片段；將擴(kuò)增得到的UL12基因片段與T載體連接形成重 組T載體，再以該重組T載體為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物進(jìn)一 步擴(kuò)增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12目的基因片段，擴(kuò)增條件不變。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于所述退火、延伸溫度均為68°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒為pET系列質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于所述表達(dá)質(zhì)粒為pET32a-UL12或者pET28a_UL12質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于步驟(3)中大腸桿菌為E. coli BL12菌株，或者為E. coli Rosetta菌株。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于步驟(4)中變性采用的方法為用洗滌液A兩次洗滌步驟(3)獲得的菌體；冷凍超聲破碎菌體，離心收集沉淀；用洗滌 液B、C、D依次洗滌、離心、收集沉淀；用洗滌液E洗滌沉淀，獲得蛋白溶液；所述的洗滌液 A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmMNaCl 的溶液；洗滌液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl U % NP40 的溶液； 洗滌液 C:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-IOOUmM 苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液 D:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、0. 5 % TritonX-100、 1. 5M鹽酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液E 包含 IOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM β -巰基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和4 6Μ鹽酸胍的溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法， 其特征在于所述洗滌液E中鹽酸胍濃度為4Μ。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)獲得有活性的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶的方法，其 特征在于步驟(5)中復(fù)性液為包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘 油、甘氨酸和鹽酸胍濃度逐步減小的溶液，所述鹽酸胍濃度依次為4M、3M、2M、1M和0M。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12的試劑盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的引物對和其他相關(guān)試劑。本發(fā)明還提供一種利用前述試劑盒獲得具有生物活性的HSV-1堿性核酸酶的方法。本發(fā)明以基因工程的方法獲得大量生物性活性較高的HSV-1堿性核酸酶，為進(jìn)一步尋找抗病毒藥物以及闡明藥物作用機(jī)制有十分重要的意義，也體外構(gòu)建HSV-1堿性核酸酶的藥物篩選分子模型奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N9/22GK101979538SQ201010508268
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者代富英, 張磊, 曹康, 郭洪秀, 陳恬 申請人:成都醫(yī)學(xué)院