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      一種用于高gc含量基因的pcr擴(kuò)增添加劑組合物及高gc含量基因的pcr擴(kuò)增方法

      文檔序號(hào):472980閱讀:1034來(lái)源:國(guó)知局
      一種用于高gc含量基因的pcr擴(kuò)增添加劑組合物及高gc含量基因的pcr擴(kuò)增方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增添加劑組合物,其特征在于,所述的擴(kuò)增添加劑選自7-deaza-dGTP、甜菜堿或甜菜堿類似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2種或2種以上的組合。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下技術(shù)效果:1)應(yīng)用本發(fā)明中所述的PCR添加劑及擴(kuò)增方法,可以擴(kuò)增模板GC含量大于80%的目的基因,可以成功擴(kuò)增復(fù)雜基因用于臨床檢測(cè)。2)應(yīng)用本發(fā)明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高,條帶單一,無(wú)需純化,可直接用于后續(xù)操作。3)應(yīng)用本發(fā)明的PCR方法對(duì)DNA聚合酶要求低,可與各類商業(yè)化PCR試劑盒相匹配。
      【專利說(shuō)明】—種用于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增添加劑組合物及高GC含量基因的PCR擴(kuò)增方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及一種用于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增添加劑及高GC含量基因的PCR擴(kuò)增方法,屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
      【背景技術(shù)】
      [0002]聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR過(guò)程一般分為變性、退火、延伸3個(gè)階段,首先DNA在高溫條件下發(fā)生變性解鏈,在溫度降至55 °C左右時(shí)引物與模板DNA單鏈結(jié)合,然后在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行DNA合成。與之前常用的細(xì)菌擴(kuò)增靶基因相比,它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。PCR技術(shù)發(fā)展到今天已經(jīng)有近30年的時(shí)間,隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,使它更適合實(shí)際應(yīng)用,但其在擴(kuò)增高GC含量序列方面仍有不足之處。堿基A、T之間形成2對(duì)氫鍵,G、C之間形成3對(duì)氫鍵,因此高G、C含量基因解鏈所需能量高,變性困難,并且模板中容易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)妨礙DNA聚合酶在模板上進(jìn)行DNA合成而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。人們也嘗試了很多方法來(lái)提高高GC含量基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)率,包括熱啟動(dòng)、兩步PCR、Sl0Wd0WnPCR等方法。然而這些方法只針對(duì)某些靶基因擴(kuò)增有一定的效果,使用范圍較為局限。
      [0003]從PCR技術(shù)發(fā)明以來(lái),人們就開始了對(duì)PCR反應(yīng)添加其它化學(xué)物質(zhì)以提高靶基因產(chǎn)率的研究。到 目前為止,已經(jīng)報(bào)道了許多添加劑以其各自的特點(diǎn)在不同方面對(duì)PCR反應(yīng)起著促進(jìn)作用,包括甜菜堿、DMSO,甲酰胺、甘油、7-deaza-dGTP等。7-deaza-dGTP是一種dGTP類似物,經(jīng)它修飾后的模板,在PCR反應(yīng)過(guò)程中能夠避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,使引物易于與模板結(jié)合。甜菜堿是一種中性物質(zhì),在PCR反應(yīng)中,它可以與DNA大溝中的A、T對(duì)結(jié)合而影響延伸反應(yīng),或者通過(guò)與DNA小溝結(jié)合,使二級(jí)結(jié)構(gòu)易于打開,保證擴(kuò)增的順利進(jìn)行。甜菜堿的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是對(duì)酶的保護(hù)作用,它可以提高酶熱變性所需溫度,保證聚合酶在高溫變性過(guò)程中不失活。DMSO作為一種PCR增強(qiáng)劑,它的作用原理是通過(guò)破壞了模板DNA大溝與小溝里帶有供體和受體的互補(bǔ)氫鍵,降低DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成,增加引物與模板的特異性結(jié)合,降低非特異性擴(kuò)增。但有報(bào)道稱當(dāng)DMSO濃度過(guò)高時(shí)會(huì)影響DNA聚合酶活性,因此在使用時(shí),要平衡模板、引物、酶的用量。甲酰胺可以促進(jìn)引物與模板的退火,降低帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA的變性溫度,從而顯著提高PCR反應(yīng)的特異性。甘油可以提高產(chǎn)量,增加酶的穩(wěn)定性。
      [0004]現(xiàn)有技術(shù)中,采用有機(jī)溶劑如乙二醇、乙酸乙酯、正戊烷等增高GC含量DNA片段擴(kuò)增效率的方法,其缺點(diǎn)為所涉及有機(jī)溶劑對(duì)人體有害,使用不便。所以以對(duì)人體無(wú)害的化合物為研究對(duì)象,表明不同組分及比例搭配對(duì)擴(kuò)增高GC含量模板PCR產(chǎn)物效率作用的研究尤為重要。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處,提供一種用于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增添加劑組合物及高GC含量基因的PCR擴(kuò)增方法。
      [0006]本發(fā)明的用于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增添加劑組合物,所述的擴(kuò)增添加劑選自7-deaza-dGTP、甜菜堿、甜菜堿類似物、DMS0、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2種或2種以上的組合,所述的7-deaza-dGTP的工作濃度為0.05-0.2mmol/L ;所述的甜菜堿和甜菜堿類似物的工作濃度為0.05-0.5mol/L ;所述的DMSO的工作濃度為1-10% (v/v);所述的甘油的工作濃度為1-20% (v/v);所述的甲酰胺的工作濃度為1-10% (v/v);所述的聚乙二醇的工作濃度為 1-20% (v/v)。
      [0007]本發(fā)明中各個(gè)成分的“工作濃度”是指其在PCR體系中的濃度。
      [0008]本發(fā)明中的“甜菜堿類似物”為含有下列主干結(jié)構(gòu)的化合物。
      [0009]
      【權(quán)利要求】
      1.一種用于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增添加劑組合物,其特征在于,所述的擴(kuò)增添加劑選自7-deaza-dGTP、甜菜堿或甜菜堿類似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2種或2種以上的組合,所述的7-deaza-dGTP的工作濃度為0.05-0.2mmol/L,所述的甜菜堿或甜菜堿類似物的工作濃度為0.05-0.5mol/L,所述的DMSO的工作濃度為1_10% (v/v),所述的甘油的工作濃度為1-20% (v/v),所述的甲酰胺的工作濃度為1-10% (v/v),所述的聚乙二醇的工作濃度為1-20% (v/v)。
      2.使用如權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增添加劑組合物進(jìn)行高GC含量基因的PCR擴(kuò)增方法,其特征在于,包括如下步驟: 1)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系:包括DNA聚合酶、緩沖劑、dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板、雙蒸水和PCR擴(kuò)增添加劑組合物; 2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序: ①預(yù)處理:95°C變性8min后暫停,加入DNA聚合酶; ②PCR 反應(yīng):95°C變性 40-60s,在 50-65°C退火 40_60s,72°C 延伸 50s_120s,共 25-35個(gè)循環(huán); ③延伸:72°C延伸1Omin; ④擴(kuò)增結(jié)束后溫度降至4°C保存。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PCR擴(kuò)增方法,其特征在于,在PCR擴(kuò)增程序的步驟①和②中的變性溫度為95°C。
      4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PCR擴(kuò)增方法,其特征在于,只需在步驟①中加入一次DNA聚合酶。
      【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103981172SQ201410120471
      【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
      【發(fā)明者】潘海波, 邢楠楠, 謝陽(yáng), 華琴 申請(qǐng)人:江蘇佰齡全基因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司
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