專利名稱：一種防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌及其菌劑制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌及其菌劑制備。
背景技術(shù)：
中藥現(xiàn)代化對傳統(tǒng)醫(yī)藥發(fā)展的八字方針是“安全、有效、穩(wěn)定、可控”，衡量人參、 平貝、北五味子等中藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)除中藥自身的有效成分外，還包括化學(xué)農(nóng)藥和重金屬 等外來污染物的污染。我國人參中的農(nóng)殘及重金屬污染，是造成人參質(zhì)量下降的重要因素， 并成為制約我國人參走向國際的主要障礙。在人參的引種栽培過程中會遭受各種病蟲害的 危害，目前主要依靠化學(xué)農(nóng)藥防治。人參、平貝、北五味子等中藥材是人們用來防病、治病、 保健的特殊商品，過量施用農(nóng)藥，不但使中藥材中農(nóng)藥殘留超過國際上或我國規(guī)定的允許 標(biāo)準(zhǔn)，直接損害人體健康；而且研究表明，某些藥用植物施用農(nóng)藥不當(dāng)，也會使其有效成分 含量降低。因此，進(jìn)行人參、平貝、北五味子等中藥材生產(chǎn)無污染新技術(shù)的研究，生產(chǎn)無公 害、優(yōu)質(zhì)的綠色人參，是提高中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。藥用植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常會受到有害微生物的侵害，造成植株藥用部位的 產(chǎn)量降低、品質(zhì)變壞以致喪失藥用價值。人參、平貝、北五味子等均是我國北方地道藥材。近 年來，由于地道藥材在當(dāng)?shù)亟?jīng)多年栽培，病原菌經(jīng)多年積累，致使病害嚴(yán)重，尤其表現(xiàn)在土 傳病害上。如人參立枯病、枯萎病、根腐病、菌核病，平貝菌核病和五味子根腐、莖基腐病等 土傳病害的發(fā)生呈日益嚴(yán)重趨勢。通過化學(xué)殺菌劑對種子和土壤進(jìn)行處理，起到了緩解病 情和阻止病原菌侵染的作用，但也同時帶來以根、根莖、鱗莖等入藥的中藥材農(nóng)殘超標(biāo)、土 壤環(huán)境惡化等問題。因此，將高效安全的生防技術(shù)引入對上述幾種地道藥材土傳病害的防 治中，將起到標(biāo)本兼治、抗病增產(chǎn)提質(zhì)的多重作用，為地道藥材的高效優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供保證。藥用植物栽培過程中，常遭受各種病蟲害的危害，影響藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量，造成重 大的經(jīng)濟(jì)損失。因此有效控制病蟲害的危害，是保證中藥材高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)措施。目 前由于生產(chǎn)者缺乏有關(guān)的技術(shù)知識和安全有效的農(nóng)藥產(chǎn)品，因此在發(fā)生病蟲害時，只能移 植農(nóng)作物上的防治方法，造成農(nóng)藥的濫用、誤用，不但病蟲害得不到有效控制，病原菌、害蟲 的抗藥性不斷增加，而且農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重制約了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低殘留中藥材的生產(chǎn)，影響 了我國中藥的聲譽(yù)，降低了國際市場上的競爭力。21世紀(jì)倡導(dǎo)的綠色中藥材是指無污染、安 全、優(yōu)質(zhì)的中藥材。根據(jù)藥用植物自身的特點，開展生物防治等無污染新技術(shù)、新方法前景 廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌及其菌劑制備；目的是為 了解決目前采用化學(xué)農(nóng)藥防治中藥材病害，而誘發(fā)病原菌或病蟲的抗藥性、造成農(nóng)藥殘留 污染及傷害非靶標(biāo)生物的問題。防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌，它為防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌 XI，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 4037，保藏日期為2010 年7月26日；它為革蘭氏陽性菌，桿狀，長為1.211111 1.411111，寬為0.611111 0.811111，芽 孢中生，橢圓形，無鞭毛，不產(chǎn)色素；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣 不整齊，菌落中心突起呈脊?fàn)?。本發(fā)明中防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl淀粉水解呈陽性、油脂水解呈 陰性、明膠水解呈陽性、石蕊牛奶試驗呈陽性、尿素水解呈陰性、硫化氫試驗呈陰性、吲哚試 驗呈陽性、甲基紅試驗呈陰性、伏普試驗呈陽性、檸檬酸鹽試驗呈陽性、過氧化酶試驗呈陽 性、氧化酶試驗呈陰性、能利用葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、馬尿酸鹽試驗呈陽性、硝酸鹽還 原試驗呈陽性、好養(yǎng)生長、生長pH值為6. 0 8. 0、生長溫度為20 40°C。本發(fā)明中防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌，菌株號為XI，為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 4037，保藏日期為2010年7月26日。制備防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑的方法按以下步驟進(jìn)行一、 取-70°C甘油保存的防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl的菌液，劃線接種于NYDA固體 培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，挑取單菌落接種于5ml的NYD液體培養(yǎng)基中，30°C、 頻率為150r/min條件下震蕩培養(yǎng)18 20h，得到活化菌液；二、取0. Iml活化菌液涂布于 裝NYDA培養(yǎng)基的茄瓶上，在30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，得活化菌種；三、將活化菌種接種 于裝有NYD液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度為25士0.5°C、攪拌速度為160r/min、發(fā)酵 罐內(nèi)氣壓為0. 5個大氣壓的條件下發(fā)酵24 48h，得菌數(shù)濃度達(dá)20 40億/毫升的菌液， 即完成防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑的制備；其中步驟三中發(fā)酵開始時通氣量 為0. 8VVM，發(fā)酵開始7h后至發(fā)酵結(jié)束通氣量為1VVM。本發(fā)明防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌XI，是從人參根部土樣中分離的對人 參根腐病、菌核病、立枯病、枯萎病、平貝菌核病和五味子根腐、莖基腐病等土傳病害具有較 高防效的生防菌株。本發(fā)明防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑，對人參、平貝和五味子等地 道藥材種子和栽種土壤進(jìn)行處理，使有益微生物菌群在種子表面、根表和根圍土壤中定殖、 生長，利用競爭和拮抗作用抑制病原菌的生長和繁殖，控制土傳病害的發(fā)生和蔓延；同時通 過提高根部防御酶活性而增強(qiáng)植株抗性；菌劑生防制劑對人、畜安全，不污染環(huán)境，不會傷 害非靶標(biāo)生物，不會誘發(fā)病原菌的抗藥性；改良中藥材品質(zhì)，防治中草藥土傳病害如人參根 腐病、立枯病、枯萎病和菌核病及平貝菌核病和五味子根腐、莖基腐病等病的防治達(dá)60% 80 %，提高中藥材產(chǎn)量，制劑生產(chǎn)成本低廉，操作簡單，易于實施，可批量生產(chǎn)和推廣應(yīng)用， 對我省綠色中藥材生產(chǎn)和持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展意義重大，具有一定開發(fā)應(yīng)用價值。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌，它為防治中 草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌XI，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，屬于芽孢桿菌屬 (Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 4037，保藏日期為2010年7月26日；它為革蘭氏陽性菌，桿狀，長為1.2μπι 1.4μπι， 寬為0. 6 μ m 0. 8 μ m，芽孢中生，橢圓形，無鞭毛，不產(chǎn)色素；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊，菌落中心突起呈脊?fàn)?。本實施方式中防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌是根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》 初步判定為芽孢桿菌屬，然后經(jīng)過SHERLOCK微生物系統(tǒng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。本實施方式中防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl是從黑龍江省鐵力林業(yè)局 鹿鳴農(nóng)場人參棚土樣分離得到的，其分離方法如下1、采用稀釋平板法分離土壤細(xì)菌，分別稱取采自黑龍江省鐵力林業(yè)局鹿鳴農(nóng)場人 參棚不同區(qū)域的人參根部土樣10g，放入盛有90mL無菌水的三角瓶中，置于搖床上充分振 蕩lOmin，使土壤中的細(xì)菌充分分散于稀釋液中，制成1 10濃度的土壤懸浮液；2、待土壤懸浮液沉淀后，用無菌的移液管吸取ImL上清液，移入盛有9mL無菌水的 試管中，充分震蕩搖勻，制成1 100的土壤懸浮液；以此類推，制成濃度分別為10_3、10_4、 10_5倍稀釋懸液，選擇10-3、10_4、10-5三個濃度的稀釋液各100 μ L，涂布于NYDA固體培養(yǎng) 基中，每個濃度作3個，然后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h ；統(tǒng)計每個平板上長出的菌 落數(shù)；挑取單菌落，在NYDA固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，直至得到純系菌株為止；將純系 菌株單菌落接種于NYD液體培養(yǎng)基中，37°C溫箱中培養(yǎng)18 20h，取菌液700 μ 1加入到 Eppendorf管中，然后加入50%甘油300μ 1，混勻后置于_70°C冰箱中冷凍保存。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是防治中草藥土傳病害 的枯草芽孢桿菌Xl淀粉水解呈陽性、油脂水解呈陰性、明膠水解呈陽性、石蕊牛奶試驗呈 陽性、尿素水解呈陰性、硫化氫試驗呈陰性、吲哚試驗呈陽性、甲基紅試驗呈陰性、伏普試驗 呈陽性、檸檬酸鹽試驗呈陽性、過氧化酶試驗呈陽性、氧化酶試驗呈陰性、能利用葡萄糖和 蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、馬尿酸鹽試驗呈陽性、硝酸鹽還原試驗呈陽性、好養(yǎng)生長、生長PH值為 6. 0 8. 0、生長溫度為20 40°C。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑制備方 法按以下步驟進(jìn)行一、取-70°C甘油保存的防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl的菌 液，劃線接種于NYDA固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，挑取單菌落接種于5ml的 NYD液體培養(yǎng)基中，30°C、頻率為150r/min條件下震蕩培養(yǎng)18 20h，得到活化菌液；二、 取0. Iml活化菌液涂布于裝NYDA培養(yǎng)基的茄瓶上，在30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，得活化 菌種；三、將活化菌種接種于裝有NYD液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度為25士0. 5°C、攪 拌速度為160r/min、發(fā)酵罐內(nèi)氣壓為0. 5個大氣壓的條件下發(fā)酵24 48h，得菌數(shù)濃度達(dá) 20 40億/毫升的菌液，即完成防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑的制備；其中步 驟三中發(fā)酵開始時通氣量為0. 8VVM，發(fā)酵開始7h后至發(fā)酵結(jié)束通氣量為1VVM。本實施方式制備所得防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑加水稀釋50倍用 于人參浸種、灌根或噴灑；對其進(jìn)行防治人參土傳病害人參根腐病和菌核病的防治實驗如 下1、供試病原菌劑尖孢鐮刀菌和菌核病病原菌，在麥粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌絲長滿 后，磨碎待用；2、化學(xué)藥劑供試藥劑50%多菌靈可濕性粉劑，南京諾華化工有限公司；3、方法3. 1人參種子篩選，篩選均勻飽滿的人參種子；3. 2接種病原菌制備
將磨碎的病原菌用細(xì)沙按1 5比例稀釋后使用，除空白對照組每盆均勻撒上一 層病菌后放上人參種子，再撒一層土覆蓋。3.3實驗設(shè)計共做7個處理，種子處理后點播到整好的畦面上，穴距為 IOcmX IOcm,每穴2粒，覆土澆足水，作好標(biāo)記，每一處理3m2，重復(fù)3次；處理1 空白對照組，直接人參種子，不接種病原菌；處理2 病原菌對照，直接播種人參種子，接種尖孢鐮刀菌；處理3 化學(xué)藥劑對照，播種用的人參種子，接種尖孢鐮刀菌；處理4 播種防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑浸泡過的人參種子，接種 尖孢鐮刀菌；處理5 病原菌對照，直接播種人參種子，接種菌核菌；處理6 播種防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑浸泡過的人參種子，接種 菌核菌；處理7 化學(xué)藥劑對照，播種用的人參種子，接種菌核菌；4、防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑使用方法1)浸種用芽孢桿菌Xl菌劑50倍稀釋液各浸30分鐘，陰干后播種；2)灌根苗期和移栽期，用芽孢桿菌Xl菌劑50倍稀釋液各灌根一次，每株用量 100毫升；3)噴灑芽孢桿菌Xl菌劑50倍稀釋液在苗期和始花期各噴灑一次；5、試驗調(diào)查20天左右觀察出苗，記錄出苗率；人參出苗后每5天調(diào)查一次根腐病、菌核病發(fā)病 情況，計算發(fā)病率，實驗結(jié)果如表1所示，可見，本實施中所得防治中草藥土傳病害的枯草 芽孢桿菌菌劑對人參根腐病和菌核病的防治達(dá)76. 2%和87. 3%。表 1
處理出苗率 (%)發(fā)病率 (%)病情指數(shù) (%)相對防效 (%)處理195.310.39.6處理281.654.743.8處理392.722.711.673.8處理498.511.610.376.2處理583.652.644.7處理698.99.67.887.3處理794.815.711.376.9 采用上述方法對人參立枯病、枯萎病、平貝菌核病和五味子根腐、莖基腐病進(jìn)行實 驗，結(jié)果為本實施中所得防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑對人參立枯病、枯萎病、平貝菌核病和五味子根腐、莖基腐病的防治達(dá)60% 80%。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三不同的是步驟一中NYDA固體 培養(yǎng)基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏、IOg的葡萄糖和15g的瓊脂粉加入蒸餾水并定容至 IOOOmL組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟一中NYD液體培養(yǎng) 基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏和IOg的葡萄糖加入蒸餾水并定容至IOOOmL組成。其它步 驟及參數(shù)與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑制備方 法按以下步驟進(jìn)行一、取-70°C甘油保存的防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl的菌 液，劃線接種于NYDA固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，挑取單菌落接種于5ml的 NYD液體培養(yǎng)基中，30°C、頻率為150r/min條件下震蕩培養(yǎng)18 20h，得到活化菌液；二、 取0. Iml活化菌液涂布于裝NYDA培養(yǎng)基的茄瓶上，在30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，得活 化菌種；三、將活化菌種接種于裝有10 15L NYD液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度為 25士0. 5°C、攪拌速度為160r/min、發(fā)酵罐內(nèi)氣壓為0. 5個大氣壓的條件下發(fā)酵24 48h， 得菌數(shù)濃度達(dá)20 40億/毫升的菌液，即完成防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑 的制備；其中步驟三中活化菌種的接種量為發(fā)酵罐內(nèi)NYD液體培養(yǎng)基體積的1%;步驟三中 發(fā)酵開始時通氣量為0. 8VVM，發(fā)酵開始7h后至發(fā)酵結(jié)束通氣量為1VVM。
權(quán)利要求
一種防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌，其特征在于它為防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌X1，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.4037，保藏日期為2010年7月26日；它為革蘭氏陽性菌，桿狀，長為1.2μm～1.4μm，寬為0.6μm～0.8μm，芽孢中生，橢圓形，無鞭毛，不產(chǎn)色素；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊，菌落中心突起呈脊?fàn)睢?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌，其特征在于防治中草 藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl淀粉水解呈陽性、油脂水解呈陰性、明膠水解呈陽性、石蕊 牛奶試驗呈陽性、尿素水解呈陰性、硫化氫試驗呈陰性、吲哚試驗呈陽性、甲基紅試驗呈陰 性、伏普試驗呈陽性、檸檬酸鹽試驗呈陽性、過氧化酶試驗呈陽性、氧化酶試驗呈陰性、能利 用葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、馬尿酸鹽試驗呈陽性、硝酸鹽還原試驗呈陽性、好養(yǎng)生長、生 長PH值為6. 0 8. 0、生長溫度為20 40°C。
3.如權(quán)利要求1中所述防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征 在于防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑制備方法按以下步驟進(jìn)行一、取-70°C 甘油保存的防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌Xl的菌液，劃線接種于NYDA固體培養(yǎng)基 上，30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，挑取單菌落接種于5ml的NYD液體培養(yǎng)基中，30°C、頻率為 150r/min條件下震蕩培養(yǎng)18 20h，得到活化菌液；二、取0. Iml活化菌液涂布于裝NYDA 培養(yǎng)基的茄瓶上，在30°C恒溫箱中培養(yǎng)18 20h，得活化菌種；三、將活化菌種接種于裝 有NYD液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度為25士0.5°C、攪拌速度為160r/min、發(fā)酵罐內(nèi) 氣壓為0. 5個大氣壓的條件下發(fā)酵24 48h，得菌數(shù)濃度達(dá)20 40億/毫升的菌液，即 完成防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌菌劑的制備；其中步驟三中發(fā)酵開始時通氣量為 0. 8VVM,發(fā)酵開始7h后至發(fā)酵結(jié)束通氣量為1VVM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征 在于步驟一中NYDA固體培養(yǎng)基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏、IOg的葡萄糖和15g的瓊脂粉 加入蒸餾水并定容至IOOOmL組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征 在于步驟一中NYD液體培養(yǎng)基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏和IOg的葡萄糖加入蒸餾水并定 容至IOOOmL組成。
全文摘要
一種防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌及其菌劑制備，它涉及一種枯草芽孢桿菌及其菌劑制備。本發(fā)明防治中草藥土傳病害的枯草芽孢桿菌X1，為芽孢桿菌屬(Bacillus)，保藏編號為CGMCC No.4037，保藏日期為2010年7月26日。菌劑是通過活化菌種接種于NYD液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)得菌數(shù)濃度達(dá)20～40億/毫升的菌液即完成。本發(fā)明中菌X1是對土傳病害具有較高防效的生防菌株；其菌劑防治中草藥土傳病害人參根腐病和菌核病、平貝菌核病及五味子根腐、莖基腐病等病害的防治達(dá)60％～80％，菌劑生防制劑安全，不污染環(huán)境，不傷害非靶標(biāo)生物和誘發(fā)病原菌的抗藥性。
文檔編號C12N1/20GK101974462SQ201010515678
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者姜竹, 孟利強(qiáng), 張云湖, 張先成, 張淑梅, 李晶, 王玉霞, 趙曉宇 申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所