專利名稱：一種多活性肽的串聯(lián)dna、構(gòu)建方法、表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地說涉及構(gòu)建一種多活性肽串聯(lián)DNA，利用其表 達(dá)載體制備所述多活性肽的方法，和所述的多活性肽的醫(yī)學(xué)用途。
背景技術(shù)：
生物活性肽是蛋白質(zhì)中天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到 復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物?；钚噪木哂卸喾N 人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血 脂等作用，食用安全性高，是當(dāng)前國際食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因 子。在治療原發(fā)性高血壓藥物研究中，目前已從天然食物蛋白質(zhì)中分離出了具有 降血壓功能的生物活性肽，此類活性肽則是通過抑制血漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素酶 (Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)的活性，達(dá)到降低血壓的目的。因其降血壓效 果明顯、安全無毒副作用，已成為活性肽研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在已陸續(xù)從多種動(dòng)植物原料及下 腳料中，如蝮蛇蛇毒、沙丁魚、乳酪、大豆豆粕、發(fā)酵豆奶、玉米渣膠、原蛋白(參見黃家音. 等人，食品與發(fā)酵工業(yè)，32: 81-86 (2006))等分離出了多種具有降血壓功能的活性多肽。目前從牛乳蛋白酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種具有降血壓功能的多肽，其中研究比 較多的是多肽 CEI-12 (Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Glu-Val-Phe-Gly-Lys),多肽 CEI-5 (Phe-Phe-Val-Ala-
Pro),多肽 CEI-7 (Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg)、多肽 CEI-3 7 (Ala-Leu-Pro-Met-His-IIe-Arg)等(參見董開發(fā).等人，中國食品學(xué)報(bào)，4 86-90 (2004)) 具有良好的降血壓效果。由于牛乳蛋白酶解產(chǎn)物為多肽混合物，種類繁多，活性差異很大，真正具有高 活性的多肽的產(chǎn)率并不很高，對此分離純化是活性富集的重要操作，但實(shí)踐證明要達(dá)到對 高活性多肽有效的分離純化非常困難，成本大幅度增高。因此酶解產(chǎn)物很難成為制備高活 性降血壓藥物的原料，限制了該產(chǎn)業(yè)的深入發(fā)展。生物工程技術(shù)的快速發(fā)展為克服上述問題，實(shí)現(xiàn)活性肽的高效制備提供了可能。 利用工程菌高效表達(dá)單一活性肽在抗菌肽、腫瘤抑制肽等的應(yīng)用(參見胡學(xué)軍.等人，中國 生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，18 (3) 287-292 (2002);馬洪星.等人，國際遺傳學(xué)雜志，30: 169-172 (2007)。)，已經(jīng)取得了成功。在對乳源性降血壓肽CEI-12研究中，有研究者使用 較大的融合蛋白(分子量為29 kDa左右)融合表達(dá)未串聯(lián)的12個(gè)氨基酸CEI-12序列(分 子量為1. 3 kDa左右)，表達(dá)效率極低(參見Lv，G. S.等人，J. Dairy Sci.，86 1927-1931 (2003))，同時(shí)因?yàn)榕Ｈ榈鞍酌附猱a(chǎn)物為多肽混合物，包含了多種高活性多肽成分，僅僅利 用工程菌表達(dá)其中單一活性肽可能達(dá)不到很好的降血壓效果。因此研究構(gòu)建利用較小的融 合蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)兩種或兩種以上串聯(lián)降血壓肽基因，以期提高降血壓肽表達(dá)效率和降 血壓活性，就顯得很有必要。目前利用工程菌表達(dá)乳源性降血壓活性肽的研究很少，利用工程菌同時(shí)表達(dá)兩種或兩種以上的降血壓肽的研究更未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以兩種乳源性降血壓肽的制備為例，說明多活性肽的交替串聯(lián)DNA的構(gòu)建 與表達(dá)。本發(fā)明的第一方面提供了編碼兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7的串聯(lián)DNA， 該基因具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第二方面提供了構(gòu)建上述兩種降血壓肽串聯(lián)DNA的方法，該方法將編碼 降血壓肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串聯(lián)3次，該核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列可 在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7兩個(gè)多肽片段。本發(fā)明的第三方面提供了含有上述兩種降血壓肽串聯(lián)DNA的表達(dá)載體 pET30a-CEI-12, 7。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用pET_30a上較小的His標(biāo)簽片斷融合表達(dá)交替串聯(lián)3次 CEI-12和CEI-7多肽，增加了重組蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加表達(dá)效率和減小 了小肽的分離難度。


圖1顯示了大腸桿菌BL21-MF3A3菌落PCR電泳圖，說明該工程菌的質(zhì)粒插入了大 小為120bp左右目的基因；其中注:l、pET-30a+目的基因，2、pET_30a空載體，3、Marker ；
圖2顯示了大腸桿菌BL21-MF3A3表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖，說明該工程菌成功表 達(dá)了大小為12kDa左右的目的蛋白；其中注1、蛋白質(zhì)Marker，2、BL21-MF3A3 (不加IPTG 誘導(dǎo))，3、BL21-MF3A3 (力口 IPTG 誘導(dǎo))，4、BL21-MF3A3 (力口 IPTG 誘導(dǎo))超聲破碎上清，5、 BL21-MF3A3 (加IPTG誘導(dǎo))超聲破碎沉淀；
圖3顯示了原發(fā)性高血壓大鼠灌胃一定量的乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7混合肽 血壓變化圖，說明了本發(fā)明制備的CEI-12和CEI-7混合肽具有很好的降血壓效果。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施 例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。從下面給出的說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上面和其他目的和特征將變得明了。實(shí)施例1 兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7串聯(lián)DNA設(shè)計(jì)與合成 a、兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7串聯(lián)多肽序列設(shè)計(jì)
本發(fā)明涉及的乳源性降血壓肽CEI-12 (SEQ ID N03)和CEI-7 (SEQ ID N04)分別對 應(yīng)于牛乳α-酪蛋白23-34的殘基序列和牛乳β-酪蛋白的177-183殘基序列。CEI-12和CEI-7的N段氨基酸殘基分別為Lys和Arg，同為胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，將CEI-12和CEI-7 的氨基酸序列交替串聯(lián)3次，在所得氨基酸序列的N段添加Asp- Asp- Asp- Asp-Lys序列， 序列如SEQ ID N02所示。b、兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7串聯(lián)多肽基因設(shè)計(jì)
將所得氨基酸序列(SEQ ID N02)根據(jù)大腸桿菌(fecAericAia cWi) BL-21菌株密碼 子偏愛性轉(zhuǎn)化成核苷酸序列并在3’端添加TAATAATAA序列和I限制性內(nèi)切酶識(shí)別序 列GGATCC，在5’端添加式 I限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列GGTACC，所得核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。實(shí)施例2 表達(dá)載體pUC18-CEI-12，7的構(gòu)建及大腸桿菌BL21-MF3A3工程菌的構(gòu)
建
a、實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的核苷酸序列SEQ ID NOl由上海旭冠生物技術(shù)發(fā)展有限公司合成 得到，克隆至pUC18(購自Novagen公司)，酶切位點(diǎn)為幻w I和漢I，將此重組載體命名 為 pUC18-CEI-12, 7，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(fecAericAia coli ) DH5 α (購自 Novagen 公司)。b、將含有pUC18-CEI-12，7的大腸桿菌DH5a提取質(zhì)粒，進(jìn)行幻7/ I和召a H I (購 自TaKaRa公司)雙酶切，回收200bp左右的片段。C、對表達(dá)載體pET_30a (購自Novagen公司)進(jìn)行幻7/ I和召柳H I (購自TaKaRa 公司)雙酶切，回收大片段。d、將步驟b所得具有粘性末端的回收片段與步驟c中回收的大片段相連，轉(zhuǎn)入 DH5 α菌株，利用常規(guī)菌落PCR獲得克隆子，引物為5’ -ACGACTCACTATAGGGGAATTGTGA-3’和 5’ -CGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCA-3，(上海生工生物工程有限公司合成)，結(jié)果如圖1所示。e、將步驟d獲得的克隆子送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致。f、將測序正確的克隆子提取質(zhì)粒，命名為pET30a-CEI-12，7，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 ^Escherichia co7i)BL-21 (購自Novagen公司)，將這樣制備的轉(zhuǎn)化體命名為“大腸桿菌 BL21-MF3A3”。 該菌種于2010年8月19日在中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏， 保藏編號為fecAericAai coli BL21-MF3A3 CCTCC NO: M 2010204。實(shí)施例3 兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7串聯(lián)多肽的表達(dá)和檢測 將實(shí)例2獲得的大腸桿菌BL21-MF3A3按體積比為1%接種量接種于50mL含卡那霉素
Kan (50yg/mL)W LB 液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0) 中，37°C、200r · mirT1恒溫?fù)u床培養(yǎng)至0D600為1. 5時(shí)，添加異丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至終濃度Immol · IZ1JSt:誘導(dǎo)12 h,5000r · mirT1離心收集菌體，將菌體反復(fù)凍 溶3次，在PBS緩沖溶液(pH為7. 0)進(jìn)行超聲破碎(3001，28/28，211^11)，800(^ .mirT1離心 取沉淀，溶于8mL上柱緩沖溶液，通過活化的Ni-柱(購自Novagen公司)純化得到His標(biāo)記 的重組蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖2所示。電泳表明在大腸桿菌誘導(dǎo)后目的蛋白主要 存在于大腸桿菌超聲破碎液離心后的沉淀中，分子量大小為12kDa左右，與設(shè)計(jì)的分子量 大小吻合。實(shí)施例4 兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7串聯(lián)多肽酶切純化
將實(shí)施例2所述方法制備的經(jīng)冷凍干燥的重組蛋白充分溶解6M尿素中，加入兩倍體 積pH8. O的0. 1%腸激酶溶液(購自Novagen公司)，37°C溫浴8h，進(jìn)行活化的Ni-柱(購自Novagen公司))純化去除His標(biāo)記融合標(biāo)簽，制得去融合標(biāo)簽的串聯(lián)多肽，將所得到的串聯(lián) 多肽溶液加入一倍體積pH8. O的0. l%(w/v)胰蛋白酶(購自Sigma公司)，37°C溫浴8h，，通 過截留分子量7000Da的透析袋(購自上海歐偉達(dá)儀器科技有限公司)去除腸激酶和胰蛋白 酶，透過液經(jīng)濃縮后用CELLUFINE GH-25柱(購自CHISSO公司)脫鹽得到純化的多肽，經(jīng)考 馬斯亮藍(lán)法檢測CEI-12和CEI-7混合多肽的表達(dá)量為0. 2g · L ]。實(shí)施例5 混合多肽CEI-12和CEI-7活性檢測
活性檢測所用混合多肽CEI-12和CEI-7按照實(shí)施例3和實(shí)施例4方法制備。a.混合多肽CEI-12和CEI-7體外活性檢測
體外活性檢測采用Vermeirssen等改進(jìn)的以FAPGG為血管緊張素I模擬物的分光光度 法，如表1，測得混合多肽CEI-12和CEI-7的IC5tl值為0. 012g/L，活性高于CEI-12(IC5tl值 為 0. 099g/L)和 CEI-7 (IC5tl 值為 0. 036g/L)其中單獨(dú)任意一種(參見Richard J. F.等 人，J Nutr, 134(4) 980- 988. (2004))。
表1 ACE抑制活性的測定操作參數(shù)
空白孔(μι)樣品孔(μι)ACE (0.lU/mL)1010FAPGG (mmol/L) 15050基質(zhì)緩沖液2400混合多肽(CEI-12和CEI-7)040
注1. FAPGG (1. Ommol/L)取3. 994mg FAPGG加基質(zhì)緩沖液，定容至IOmL,溶解混合， 置4°C避光放置；2.基質(zhì)緩沖液HEPES 1. 910g, NaCl 1. 755g，用雙蒸餾水溶解后，用NaOH 調(diào)到ρΗ8· 3，再補(bǔ)充水到IOOmL,置4°C備用。
b.混合多肽CEI-12和CEI-7體內(nèi)活性檢測
實(shí)驗(yàn)材料為SPF級10周齡雄性原發(fā)性高血壓模型Wistar大鼠20只，體重180 240 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量給 藥后在4h至6h，舒張壓有大幅下降，其中中劑量組在4h血壓下降值最大，達(dá)到32mmHg，此 劑量對原發(fā)性高血壓大鼠良好的降血壓效果。
權(quán)利要求
1.一種多活性肽的串聯(lián)DNA，該基因具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。
2.一種多活性肽的串聯(lián)DNA的構(gòu)建方法，將編碼降血壓肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序 列交替串聯(lián)3次，該核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12 和CEI-7兩個(gè)多肽片段。
3.含有權(quán)利要求1所述的多活性肽的串聯(lián)DNA的表達(dá)載體pET30a-CEI-12，7。
全文摘要
本發(fā)明多活性肽的串聯(lián)DNA、構(gòu)建方法、表達(dá)載體。提供了編碼乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7的串聯(lián)DNA，其具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列。及含有串聯(lián)DNA的表達(dá)載體pET30a-CEI-12,7。本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述兩種降血壓肽串聯(lián)DNA的方法，該方法將編碼降血壓肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串聯(lián)3次，該核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7兩個(gè)多肽片段。本發(fā)明利用pET-30a較小的His標(biāo)簽片斷融合表達(dá)交替串聯(lián)3次CEI-12和CEI-7多肽，增加了重組蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加表達(dá)效率和減小了小肽的分離難度。
文檔編號C12N15/12GK102102104SQ201010546969
公開日2011年6月22日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者任曉鋒, 曲文娟, 李云亮, 馬海樂, 黃六容 申請人:江蘇大學(xué)