專利名稱：碭山酥梨果實石細(xì)胞含量主效qtl的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，提供了 ‘碭山酥梨’果實石細(xì)胞含量主效QTL的分子標(biāo) 記，可用于梨果實石細(xì)胞含量性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率，屬于遺傳育種領(lǐng) 域。背景技術(shù)：
梨(/yr皿L.)原產(chǎn)我國，是我國第三大果樹樹種。我國梨樹分布廣，種類、品種繁多， 其中‘碭山酥梨’是當(dāng)前我國栽培面積最大的品種，栽培面積約400萬畝。梨鮮果因其營養(yǎng) 價值高，香甜多汁，而深受消費者喜愛。梨果實石細(xì)胞是影響其品質(zhì)的重要因素之一，其作 為梨果實中所特有的組成成分，不僅影響到鮮食品質(zhì)，而且影響到加工品質(zhì)。因此，降低梨 果實石細(xì)胞的含量，對改善梨果品質(zhì)至關(guān)重要。培育果實石細(xì)胞含量少的品種已經(jīng)成為梨 育種的重要目標(biāo)之一。由于梨為多年生果樹作物，與果實品質(zhì)相關(guān)的性狀大都是由多基因控制、易受環(huán) 境影響的數(shù)量性狀，在分離后代表現(xiàn)為廣泛的表型變異，其基因型與表現(xiàn)型間的對應(yīng)關(guān)系 難以確定。而以往的傳統(tǒng)育種是基于經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)理論，把控制某一性狀的多個基因作 為整體進(jìn)行研究和選擇，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上改良目標(biāo)性狀難度越來較大。近年來，隨著分子標(biāo) 記技術(shù)的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善，使 得數(shù)量性狀基因座(QTL)定位變成了現(xiàn)實，也為提高目標(biāo)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能 性、準(zhǔn)確性及預(yù)見性奠定了基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記定位數(shù)量性狀QTL，其實質(zhì)就是分析分子標(biāo) 記與目標(biāo)性狀QTL之間的連鎖關(guān)系，即利用已知座位的分子標(biāo)記來定位未知座位的QTL，通 過計算分子標(biāo)記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置。基于獲得的標(biāo)記基因型分 離與數(shù)量性狀的量之間的關(guān)系，可直接把握數(shù)量性狀基因，并開發(fā)可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助 選擇(MAS)育種的技術(shù)，這已在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應(yīng)用。目前有關(guān)梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些 病害或生長性狀，對重要品質(zhì)性狀梨石細(xì)胞的QTL定位及分子標(biāo)記的研究尚沒有開展。因 此，開展梨果實石細(xì)胞主效基因的QTL定位，篩選緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立雜交后代早期 輔助選擇技術(shù)體系，對于提高梨果石細(xì)胞品質(zhì)改良效率，縮短育種進(jìn)程，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得 尤為重要。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是定位‘碭山酥梨’果實石細(xì)胞主效QTL，并提供與QTL位點緊密連鎖的 分子標(biāo)記，為實現(xiàn)對該性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術(shù)支持。技術(shù)方案
一種碭山酥梨果實石細(xì)胞含量主效QTL的分子標(biāo)記，是通過下列步驟獲得的
a)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1代單株；
b)用梨基因組DNA，采用 SRAP 弓丨物 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3’ 和 fc3 5’ -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3’進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳 分離后，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其后代進(jìn)行分析，并統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的 位點在后代群體中的遺傳類型，將得到的多態(tài)性標(biāo)記位點導(dǎo)入J0inmap3. 0作圖軟件，構(gòu)建 ‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜；
l.c)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’的F1群體單株的果實石細(xì)胞含量進(jìn)行測定，利用 MapQTL5. 0作圖軟件的區(qū)間作圖法，將F1群體每個單株的果實石細(xì)胞含量與‘碭山酥梨’遺 傳連鎖圖譜中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，以LOD值彡2. 5為標(biāo)準(zhǔn)，大于2. 5說明存在 一個QTL位點，檢測到在父本‘碭山酥梨’的第13連鎖群DS13上檢測到石細(xì)胞含量的QTL 位點Pcc2，其LOD值為3. 7，是主效QTL,距離最近的標(biāo)記為fc3em4-195,大小為195bp,距 Pcc2的距離為0. 537cM,該標(biāo)記即為梨果實石細(xì)胞含量的標(biāo)記。所述QTL位點Pcc2位于 ‘碭山酥梨’第7連鎖群上，其解釋30. 7%的石細(xì)胞含量特征。所述分子標(biāo)記可在梨分子育種中得到應(yīng)用。其特征在于用梨基因組DNA，采用 SRAP 引物 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3’ 和 fc3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3，進(jìn)行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得大小為I^bp的分子 標(biāo)記，則標(biāo)志該梨品種該梨品種梨果實石細(xì)胞含量主效QTL，果實含有較高的石細(xì)胞含量。
有益效果
(1)本發(fā)明首次對決定‘碭山酥梨’果實石細(xì)胞含量的數(shù)量性狀位點進(jìn)行了 QTL定位， 這為實現(xiàn)基于分子育種的多基因控制性狀改良奠定了重要的基礎(chǔ)和必要的前提。(2)本發(fā)明中確定了 ‘碭山酥梨’果實石細(xì)胞含量的QTL位點，對該數(shù)量性狀決定 的貢獻(xiàn)率較高，位點的貢獻(xiàn)率為30. 7%。因此，基于此位點篩選連鎖分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀判 斷的準(zhǔn)確性大大提高。(3)目前普遍認(rèn)為可應(yīng)用于分子輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的距離需 (5cM,本發(fā)明中與主效QTL連鎖的標(biāo)記fC;3em4-195距離為0. 537cM,與目標(biāo)位點表現(xiàn)為緊 密連鎖，這對于提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性和效率具有重要意義。因此，以上標(biāo)記具有 良好的應(yīng)用價值，可加快對梨果實石細(xì)胞性狀改良的進(jìn)度
四

圖1為‘碭山酥梨’的石細(xì)胞性狀QTL定位。DS代表的是‘碭山酥梨’的連鎖群，DS后的數(shù)字代表連鎖群數(shù)。連鎖群上左側(cè)的數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位為cM，右側(cè)則表示的是分子標(biāo) 記的名稱。共有4種分子標(biāo)記，“E-M-”為AFLP標(biāo)記，E和M分別指限制性內(nèi)切酶Eco I和 Mse I酶切，其后的數(shù)字是該標(biāo)記多態(tài)性條帶的編號；其它為SRAP和SSR標(biāo)記。連鎖群右側(cè)的實心長方形指示QTL作圖區(qū)間Pcc2。右邊的曲線圖為QTL的LOD 分布圖，虛線為2. 5閾值。圖2為SRAP引物組合fC;3em4-195在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖。箭頭所 指的條帶即 fc!3em4-195，M 為 pBR322 DNA/ Msp I ladder。
五具體實施方式
實施例1 a)利用我國的兩個梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交組合，獲得其97株&群體。b)用 SSR (Simple sequence repeat)、 SRAP (Sequence related amplified polymorphism)禾口 AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子標(biāo)記方法分 析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。利用SSR、SRAP、AFLP分子標(biāo)記方法，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進(jìn)行分析， 并統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。SSR標(biāo)記的實驗操作程序參考 ^mamoto T.等(Euphytica，2002，1 1四_137)的 方法；SRAP標(biāo)記的實驗操作程序參考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 :455-461)的方 法；AFLP標(biāo)記分別使用I和ifes I兩種內(nèi)切酶，具體實驗操作程序參考Vos等(Nucleic Acids Res, 1995，23 :4407-4414)的方法。SSR和SRAP標(biāo)記用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠強 堿銀染法檢測，AFLP標(biāo)記用6%變性聚丙烯酰胺凝膠銀染檢測。將SSR、、AFLP電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的多態(tài)性條帶記為“ 1 ”，無帶記為“0”，不清楚 的帶或缺失記為“_”，根據(jù)已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)計算各多態(tài)性條帶的 分子量。將分離條帶按親本來源歸類，確定其來源及遺傳類型。利用χ2測驗分析各標(biāo)記 分離是否符合3:1或1:1的孟德爾分離比例，偏分離的在標(biāo)記末尾用“*”標(biāo)注。最終獲得 了 23個SSRs、S基因位點、2 個SRAPs和482個AFLPs等共732個多態(tài)性標(biāo)記位點，然后 利用Ji0nmap3. O作圖軟件對其進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建了一張包含216多態(tài)性標(biāo)記的‘碭山酥 梨’梨遺傳連鎖圖譜。SRAP 方法為
以梨DNA為模板，采用SRAP引物 em45' -GACTGCGTACGAATTTGA-3'
fc3 5，-GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3，
擴增條件=SRAP分析的PCR擴增體系為總體積20ul 其中包含0. 2mmol · L-I dNTP， 0. 3ymol ‘ L-I 上下游引物，2. Ommol · L-I MgC12，1 個單位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng， IXBuffer。PCR 反應(yīng)程序為94 °C 3min ;35 個循環(huán)94 °C 40s，55 °C 50s , 72 °C Imin ； 72 °C IOmin, 10 °C IOmin ；
擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。c)用Joinmap3. 0分析軟件構(gòu)建‘碭山酥梨’的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標(biāo)記位點按Joinmap3. 0分析軟件中適于cp群體構(gòu) 圖的格式導(dǎo)入J0inmap3. 0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點和顯著偏分離的位點，以L0D=4. 0 7.0，重組率=0.4，選擇Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖(Van Ooi jen，2001 )。d)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所試驗地的栽培條件下，對八月紅’ X ‘碭山 酥梨’F1群體的果實的石細(xì)胞含量進(jìn)行了測定。測定方法采用冷凍法(聶繼云，2006)。將石 細(xì)胞含量的表型值和‘碭山酥梨’連鎖圖譜的相關(guān)文件導(dǎo)入MapQTL5. 0作圖軟件，選擇區(qū)間 作圖法，以LOD值>2. 5為標(biāo)準(zhǔn)，對梨的石細(xì)胞含量在‘八月紅’的連鎖圖譜上進(jìn)行QTL分 析和定位。結(jié)果表明，在‘碭山酥梨’的第13連鎖群(DS13)上檢測到石細(xì)胞含量的QTL位 點Pcc2 (圖1)，LOD值為3. 7，與最近的分子標(biāo)記fc3em4-195的連鎖距離為0. 537cM，對該 性狀的貢獻(xiàn)率為30. 7%。該QTL位點為主效QTL，其最近標(biāo)記的距離也遠(yuǎn)小于可應(yīng)用于分子 輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的所要求的最大距離。分子標(biāo)記fC;3em4-195目標(biāo)條帶為
5195bp0實施例2
利用篩選到的與‘碭山酥梨’果實石細(xì)胞含量主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記對‘八月紅’ 與‘碭山酥梨’的97株F1雜交后代進(jìn)行初步檢測，以檢測該方法在梨果實石細(xì)胞含量分子 標(biāo)記輔助選擇中的實用價值。用該97株后代的基因組DNA及SRAP弓丨物fc3和em4進(jìn)行 PCR反應(yīng)，電泳后根據(jù)fC;3em4-195條帶的有無來確定是否存在相應(yīng)的標(biāo)記，如果存在標(biāo)記， 說明該植株的果實石細(xì)胞含量高，不存在則說明低，同時用實際測得的果實石細(xì)胞含量結(jié) 果與分子標(biāo)記檢測結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，在‘八月紅，和‘碭山酥梨，的97株F1雜交后代中，共有75株的DNA擴增 結(jié)果出現(xiàn)fC;3em4-195條帶，這75株當(dāng)中有49株的果實石細(xì)胞含量大于5 mg/g,所有這75 株的果實石細(xì)胞含量平均值為6. 5mg/g ；共有20株后代的DNA擴增結(jié)果不出現(xiàn)fc3em4-195 條帶，其中11株的石細(xì)胞含量小于5 mg/g,所有這20株的果實石細(xì)胞含量的平均值為 5. lmg/g ； 2個單株條帶缺失。用fC;3em4-195預(yù)測石細(xì)胞含量有較好的預(yù)測效果。
權(quán)利要求
1.碭山酥梨果實石細(xì)胞含量主效QTL的分子標(biāo)記，是通過下列步驟獲得的a)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1代單株；b)用梨基因組DNA，采用 SRAP 弓丨物 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3’ 和 fc3 5’ -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3’進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳 分離后，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其后代進(jìn)行分析，并統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的 位點在后代群體中的遺傳類型，將得到的多態(tài)性標(biāo)記位點導(dǎo)入J0inmap3. 0作圖軟件，構(gòu)建 ‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜；c)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’的&群體單株的果實石細(xì)胞含量進(jìn)行測定，利用 MapQTL5. 0作圖軟件的區(qū)間作圖法，將F1群體每個單株的果實石細(xì)胞含量與‘碭山酥梨’遺 傳連鎖圖譜中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，以LOD值彡2. 5為標(biāo)準(zhǔn)，大于2. 5說明存在 一個QTL位點，檢測到在父本‘碭山酥梨’的第13連鎖群DS13上檢測到石細(xì)胞含量的QTL 位點Pcc2，其LOD值為3. 7，是主效QTL,距離最近的標(biāo)記為fc3em4-195,大小為195bp,距 Pcc2的距離為0. 537cM，該標(biāo)記即為梨果實石細(xì)胞含量的標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述‘碭山酥梨’果實石細(xì)胞含量主效QTL的分子標(biāo)記，其特征在 于所述QTL位點Pcc2位于‘碭山酥梨’第7連鎖群上，其解釋30. 7%的石細(xì)胞含量特征。
3.權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用梨基因組DNA，采用SRAP引物em4 5，-GACTGCGTACGAATTTGA-3，和 fc3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3'進(jìn)行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物 在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得大小為I^bp的分子標(biāo)記，則標(biāo)志該 梨品種該梨品種梨果實石細(xì)胞含量主效QTL，果實含有較高的石細(xì)胞含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了碭山酥梨果實石細(xì)胞含量主效QTL的分子標(biāo)記，屬于遺傳育種領(lǐng)域。利用SRAP、SSR、AFLP構(gòu)建‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合對果實石細(xì)胞含量的表型鑒定，采用區(qū)間作圖法對此群體進(jìn)行分析，在‘碭山酥梨’的第13連鎖群上檢測到主效QTL的存在，可解釋30.7%的石細(xì)胞含量特征。距離主效QTL位點Pcc2最近的標(biāo)記為fc3em4-195，其距離為0.537cM。所獲得的石細(xì)胞主效QTL分子標(biāo)記對于加快梨品種的遺傳改良進(jìn)程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實踐指導(dǎo)意義。
文檔編號C12N15/10GK102071194SQ20101055104
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張瑞萍, 張紹鈴, 陶書田, 齊開杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)