專利名稱：一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法
一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種石油污染土壤生 物修復(fù)菌劑的篩選方法及修復(fù)方法。
背景技術(shù)：
石油作為“工業(yè)的血液”，其工業(yè)發(fā)展和應(yīng)用日益迅猛。然而，它同時(shí)帶來(lái)的 污染尤其是土壤污染問(wèn)題也備受關(guān)注。目前，國(guó)際上公認(rèn)的最有前途的石油污染土壤處 理方法是生物修復(fù)。
石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)研究始于上個(gè)世紀(jì)80年代，該技術(shù)是借助于大量 微生物利用石油中的烴類物質(zhì)作為碳源和能源而生長(zhǎng)，通過(guò)其新陳代謝作用，將土壤中 的石油污染物降解成二氧化碳和水或轉(zhuǎn)化成為其它無(wú)害物質(zhì)。微生物對(duì)石油污染物主要 的作用過(guò)程有三方面一是烴的直接吸收石油中的某些烴類能直接或間接溶于細(xì)胞膜 的親脂區(qū)而進(jìn)入膜內(nèi)；二是烷烴和環(huán)烷烴的生物降解；三是芳香烴、烯烴、炔烴的生物 降解。
微生物在修復(fù)過(guò)程中有諸多的影響和制約因素，主要包括微生物的降解能 力、石油污染土壤的理化性質(zhì)、環(huán)境條件等。目前研究?jī)?nèi)容主要集中在三方面一是選 育高效的石油烴降解菌；二是探究微生物修復(fù)的最佳環(huán)境條件；三是研發(fā)一系列原位和 異位的微生物修復(fù)技術(shù)。
國(guó)內(nèi)外進(jìn)行的生物修復(fù)未取得十分理想的效果，其原因在于油田污染的土壤不 僅含油量高而且含鹽量也很高(比如勝利油田的土壤含鹽量9-20g/Kg高達(dá)未污染土壤的 8-17倍)，高鹽度加大了土壤生物修復(fù)的難度，使得常規(guī)菌種達(dá)不到很好的處理效果。 如參考文獻(xiàn)1:姜昌亮，孫鐵衍，李培軍，等.石油污染土壤長(zhǎng)料堆式異位生物修復(fù)技術(shù) 研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，12(2) 279-282中記載了采用堆肥法對(duì)遼河油田4種不 同類型的石油污染土壤進(jìn)行了處理，當(dāng)土壤中石油烴總量(TPH)為4.16-7.72g/100g 土 時(shí)，經(jīng)過(guò)53天的運(yùn)行，TPH去除率達(dá)到45.2% 56.7%。如參考文獻(xiàn)2 Fllis B.Harold P.EnvironmentalTechnology, 1992，12 447-459 中記載了 Fllis 等用具有濾液收集和 水循環(huán)系統(tǒng)的預(yù)制床對(duì)斯德歌爾摩中部油污土壤進(jìn)行治理，土壤中多環(huán)芳烴的濃度從 1024.4mg/kg降至324.1mgAg，降解率為68%。參考文獻(xiàn)3 王丹昶，楊懷杰，劉勇， 等.油泥(砂)處理和綜合利用技術(shù)研究[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003， 29 19-23中記載了王丹昶等選擇2219井油泥砂，采用美國(guó)微生物公司提供的菌種(油 樂(lè)寶)和不投加菌種空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)，進(jìn)了現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)含油量為73660mg/ kg的油泥砂投加菌種(油樂(lè)寶)60天后含油最降解率為23.3%。
有研究表明當(dāng)土壤中鹽濃度為6g/Kg時(shí)，大多數(shù)植物，特別是栽培植物就不能 正常生長(zhǎng)或完全不能生長(zhǎng)了，此外，土壤本身屬于固相介質(zhì)，這一特點(diǎn)決定其中鹽度分 布的不均勻性，0-5cm的表層土壤往往鹽度最高，這不僅由于表層所受的污染最嚴(yán)重， 而且其中的水分蒸發(fā)量也最大；受油污、水分蒸發(fā)、植物吸收水分的影響，5-25cm的土層鹽分也比深層土壤的要高。上述原因?qū)е铝司植客寥烙绕涫怯宣}析出部位的鹽度大大 高出所測(cè)定的土壤平均鹽度。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，為解決石油污染土壤中的高鹽度對(duì)微生物的抑制作 用，普通微生物無(wú)法用于高鹽度石油污染土壤的生物處理，本發(fā)明提供一種石油污染土 壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，經(jīng)該篩選及修復(fù)方法所篩選得到的生物修復(fù)菌劑可 應(yīng)用于含鹽量10 20g/Kg石油污染土壤的生物降解；嗜鹽菌強(qiáng)化的石油污染土壤生物 修復(fù)菌劑篩選及修復(fù)方法具有很高的實(shí)用價(jià)值，可廣泛應(yīng)用在用于石油污染土壤、海岸 沙灘、采油廢水等生物修復(fù)領(lǐng)域。一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，具體包括以下幾個(gè)步驟步驟一石油降解土著菌與嗜鹽菌菌源的采集；取距油田采油廢水排放口處的石油污染土壤作為石油降解土著菌菌源；取距油 田采油廢水處理廠出水口的采油廢水和污水處理廠活性污泥作為嗜鹽菌菌源。步驟二 石油降解土著菌的篩選；(1)取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣2g，加入盛有IOOmL無(wú)菌水的錐形瓶 (內(nèi)含玻璃珠)中，并置于振蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩0.5 2h，振蕩頻率為200rpm。(2)從無(wú)菌水的錐形瓶中取5mL溶液，加入IOOmL梯度篩選培養(yǎng)液A中37°C， 150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液A為質(zhì)量濃度75%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和Ig/ L原油。(3)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液A中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL 梯度篩選培養(yǎng)液B中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液B為質(zhì)量濃度為 50%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和2g/L原油的混合溶液。(4)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液B中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL 梯度篩選培養(yǎng)液C中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液C為質(zhì)量濃度為 25%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和3g/L原油的混合溶液。(5)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液C中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基變渾濁時(shí)，得到以石油為唯一 碳源的石油降解土著菌，并冷藏。所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分每IOOOmL去離子水中含有NH4NO3Ig, K2HPO4 · 3H20 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H20 0.5g,無(wú)水 CaCl20.02g，F(xiàn)eSO4O-Olg, MnSO4 · H20 0.01g,原油 4g，pH = 7.0, 121°C滅菌 20min。步驟三嗜鹽菌的篩選；取活性污泥和采油廢水各lml，采用IOOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)梯度 馴化篩選得到可在1-10%鹽濃度環(huán)境下生長(zhǎng)良好的嗜鹽菌復(fù)合菌系，并利用嗜鹽菌復(fù)合 菌系制備菌體濃度IO8 IO9個(gè)/ml的混合嗜鹽菌培養(yǎng)液。步驟四石油降解嗜鹽菌的篩選；以石油為唯一碳源，以質(zhì)量濃度為1.0% 10.0%為鹽梯度，由嗜鹽菌復(fù)合菌系 和石油污染土壤，篩選耐鹽范圍廣的石油降解嗜鹽菌。
(1)嗜鹽度為1.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液的篩選(A)取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣2g，加入盛有IOOmL無(wú)菌水的錐形瓶 (內(nèi)含玻璃珠)中，并置于振蕩培養(yǎng)箱中200rpm，室溫振蕩0.5_2h。(B)從無(wú)菌水的錐形瓶中取5mL，加入IOOmL富集培養(yǎng)液A中，每瓶加入混合 嗜鹽菌培養(yǎng)液5mL，于37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)。所述的富集培養(yǎng)液A為質(zhì)量濃度75% 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、lg/L原油、質(zhì)量濃度1.0% NaCl的混合溶液。(C)當(dāng)富集培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL富集培養(yǎng)液B中， 37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的富集培養(yǎng)液B為質(zhì)量濃度50%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、 2g/L原油含質(zhì)量濃度1.0% NaCl的混合溶液。(D)當(dāng)富集培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL富集培養(yǎng)液C中搖瓶 培養(yǎng)，所述的富集培養(yǎng)液C為質(zhì)量濃度25%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、3g/L原油含質(zhì)量濃度 1.0% NaCl的混合溶液。(E)當(dāng)富集培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A中搖瓶培 養(yǎng)，所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和1.0% NaCl，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A變 渾濁時(shí)，得到以石油為唯一碳源的嗜鹽度為的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液。(2)從嗜鹽度為的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液B中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為X的 石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液。所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為X 的NaCl溶液。(3)從嗜鹽度為X的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng) 液C中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液C變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為Y的石 油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為Y的 NaCl 溶液，且 1.0%< X < Y < 10.0%。(4)從嗜鹽度為Y的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng) 液D中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液D變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為Z的石 油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液D為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為Z的 NaCl 溶液，且 1.0%< X < Y < Z < 10.0%。(5)從嗜鹽度為Z的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液E中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液E變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為E 的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液E為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為 10.0% 的 NaCl 溶液。(6)將得到的嗜鹽度為1.0%、X、Y、Z和10.0%的石油降解嗜鹽菌按照相同體
積比混合，得到石油降解嗜鹽菌復(fù)合菌劑。步驟五石油污染土壤修復(fù)的高效菌劑篩選；(1)步驟三中得到的嗜鹽度石油降解嗜鹽菌復(fù)合菌劑利用相應(yīng)的鹽度平板活化， 并與步驟二中得到的石油降解土著菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至菌體濃度 均大于每毫升IO9個(gè)，離心收集菌體制備得到兩種發(fā)酵菌液。(2)取作為石油降解土著菌菌源的土壤，經(jīng)除雜、風(fēng)干、散碎、過(guò)200目篩、混 勻后，將土壤平鋪成2cm的薄層。
C3)將土壤分別裝入花盆中，測(cè)定土壤中的油含量和含鹽量，分別接種石油降 解土著菌的發(fā)酵菌液和石油降解嗜鹽菌復(fù)合菌劑的發(fā)酵菌液；投菌量為每克土壤中含有 IO6 IO8個(gè)菌落，并每10-15天投加一次。
(4)向土壤中每隔10 15天投加一次營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，充分混勻，并調(diào)節(jié)土壤的pH 值和濕度；所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為蔗糖和硝酸鉀，每次投加的量為每千克土壤中投加1 IOg 蔗糖，每千克土壤中投加2 16g硝酸鉀，并每天調(diào)節(jié)土壤的含水量，使土壤的濕度為 20% 40%，調(diào)節(jié)土壤的pH = 7 8。
(5)通過(guò)重量法測(cè)每個(gè)花盆中的含油量，利用平板技術(shù)法測(cè)定菌體的濃度，測(cè)定 并調(diào)節(jié)土壤的pH值，7周時(shí)間后，測(cè)定每個(gè)花盆中土壤中石油的降解率，得到降解率最 高的高效菌劑。
步驟六利用正交修復(fù)實(shí)驗(yàn)選取高效降解菌劑修復(fù)的優(yōu)化條件
利用正交修復(fù)實(shí)驗(yàn)分別選取投菌量、濕度、投加蔗糖量和加硝酸鉀量投菌量作 為高效菌劑修復(fù)的影響因素，其中投菌量為每克土壤中投加IO6 IO8個(gè)菌體，濕度為 20% 40%，投加蔗糖量為每千克土壤1 10g，投加硝酸鉀量為每千克土壤2 16g。 (1)利用篩選得到的高效菌劑進(jìn)行正交修復(fù)實(shí)驗(yàn)，首先用相應(yīng)的鹽度平板活化，再采用牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌體濃度大于每毫升IO9個(gè)，離心收集菌體制備得到發(fā)酵菌液。
(2)取作為石油降解土著菌菌源的土壤，經(jīng)除雜、風(fēng)干、散碎、過(guò)200目篩、混 勻后，將土壤平鋪成2cm的薄層，調(diào)節(jié)土壤的pH = 7 8。
(3)將土壤分別裝入花盆中，通過(guò)重量法測(cè)一下每個(gè)花盆中的含油量和含鹽量。
(4)控制每個(gè)花盆中投菌量為每克土壤中投加IO6 IO8個(gè)菌體，濕度為20% 40%,投加蔗糖量為每千克土壤中1 10g，投加硝酸鉀量為每千克土壤中2 16g ；并 每10 15天向土壤中投加高效菌劑、蔗糖和硝酸鉀來(lái)保證土壤中菌體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含 量，濕度通過(guò)早晚噴水控制。
(5)每隔7天通過(guò)重量法測(cè)一下每個(gè)花盆中的含油量，每隔7天利用平板技術(shù)法 測(cè)定菌體的濃度，每隔3天測(cè)定并調(diào)節(jié)土壤的pH值，7周時(shí)間后，測(cè)定每個(gè)花盆土壤中 石油的降解率，得到降解率最高的修復(fù)條件。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明公開(kāi)的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，所篩選培 養(yǎng)的菌體可以在6% -10%鹽濃度環(huán)境下良好生長(zhǎng)，這為含鹽量高的石油污染土壤的修復(fù) 提供了菌源保證；
2、本發(fā)明公開(kāi)的石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法其最佳修復(fù)條 件為濕度40%;投菌量IO8個(gè)/g 土壤；在修復(fù)前2周的最佳投加硝酸鉀量為16g/kg 土 壤，中后期即修復(fù)第3周開(kāi)始后投加硝酸鉀量為相/kg 土壤；在修復(fù)前3周投加蔗糖量為 5-10g/kg 土壤，中后期即修復(fù)第4周開(kāi)始后最佳投加蔗糖量為l_5g/kg 土壤。修復(fù)7周 后對(duì)于含鹽量高達(dá)10g/Kg、油含量為16%的土壤除油率達(dá)64.31%，修復(fù)效果較高；
3、本發(fā)明公開(kāi)的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，可在含 鹽量較高的石油污染土壤中存活，并能利用石油作為碳源進(jìn)行代謝，在石油污染土壤修 復(fù)、含油廢水等環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。


圖1 本發(fā)明中石油降解土著菌與石油降解嗜鹽菌的降解率隨時(shí)間變化圖；圖2 本發(fā)明提出的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法中石油 降解土著菌的篩選流程圖；圖3 本發(fā)明提出的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法中石油 降解嗜鹽菌的篩選流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明提出的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，具體包括以 下幾個(gè)步驟步驟一石油降解土著菌與嗜鹽菌菌源的采集；取距油田采油廢水排放口處的石油污染土壤作為石油降解土著菌菌源；取距油 田采油廢水處理廠出水口的采油廢水和污水處理廠活性污泥作為嗜鹽菌菌源。步驟二 石油降解土著菌的篩選，如圖2所示；(1)從9處采樣點(diǎn)采集的土樣各取2g，分別加入9個(gè)盛有IOOmL無(wú)菌水的錐 形瓶(內(nèi)含玻璃珠)中，將9瓶土壤溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩0.5-2h，振蕩頻率 200rpm。(2)從每瓶無(wú)菌水的錐形瓶中取5mL溶液，分別加入IOOmL梯度篩選培養(yǎng)液A 中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液A為質(zhì)量濃度75%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基和lg/L原油的混合溶液。(3)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液A中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL 梯度篩選培養(yǎng)液B中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液B為質(zhì)量濃度為 50%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和2g/L原油的混合溶液。(4)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液B中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL 梯度篩選培養(yǎng)液C中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液C為質(zhì)量濃度為 25 %牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和3g/L原油的混合溶液。(5)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液C中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基變渾濁時(shí)，得到以石油為唯一 碳源的石油降解土著菌。(6)將得到的9組對(duì)應(yīng)為9處采樣點(diǎn)的以石油為唯一碳源的石油降解土著菌，分 別編號(hào)為 Bi、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8 和 B9，并于 4°C冷藏。所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分每IOOOmL水中含有NH4NO3Ig, K2HPO4 · 3H20 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H20 0.5g，無(wú)水 CaCl20.02g，F(xiàn)eS040.01g，MnSO4 · H2O O.Olg，原油 4g，pH = 7.0, 121°C滅菌 20min。步驟三嗜鹽菌的篩選取活性污泥和采油廢水各lml，采用IOOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)梯度 馴化篩選得到可在1-10%鹽濃度環(huán)境下生長(zhǎng)良好的嗜鹽菌復(fù)合菌系，并利用嗜鹽菌復(fù)合 菌系制備菌體濃度IO8 IO9個(gè)/ml的混合嗜鹽菌培養(yǎng)液。
步驟四石油降解嗜鹽菌的篩選；以石油為唯一碳源，以質(zhì)量濃度為1.0%、2.5%, 5.0%, 7.5%, 10.0%為鹽梯
度，由嗜鹽菌復(fù)合菌系和石油污染土壤中篩選石油降解嗜鹽菌，如圖3所示。(1)嗜鹽度為的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液的篩選(A)將石油降解土著菌從9處采樣點(diǎn)采集的土樣各取2g，分別加入盛有IOOmL 無(wú)菌水的錐形瓶(內(nèi)含玻璃珠)中，將9瓶土壤溶液置于振蕩培養(yǎng)箱中200rpm，室溫振 蕩 0.5-2h。(B)每瓶土壤溶液各取5mL，分別加入9瓶IOOmL富集培養(yǎng)液A中，并向每瓶 加入混合嗜鹽菌培養(yǎng)液5mL，37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)。所述的富集培養(yǎng)液A為質(zhì)量濃度 75%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、lg/L原油、質(zhì)量濃度NaCl的混合溶液。(C)當(dāng)富集培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，每瓶取5mL各轉(zhuǎn)接至IOOmL富集培養(yǎng)液B中 37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的富集培養(yǎng)液B為質(zhì)量濃度50 %牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、 2g/L原油和質(zhì)量濃度NaCl的混合溶液。(D)當(dāng)富集培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL富集培養(yǎng)液C中37°C， 150rpm搖瓶培養(yǎng)，所述的富集培養(yǎng)液C為質(zhì)量濃度25%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、3g/L原油 和質(zhì)量濃度1.0% NaCl的混合溶液。(E)當(dāng)富集培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A中搖瓶培 養(yǎng)，所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為1.0% NaCl的溶液，當(dāng)無(wú) 機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A變渾濁時(shí)，得到9組以石油為唯一碳源，嗜鹽度為1.0%的石油降解嗜 鹽菌的培養(yǎng)液。(2)從9種嗜鹽度為1.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中各取5ml，分別依次轉(zhuǎn)接 至含鹽2.5%的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B 變渾濁時(shí)，得到9組以石油為唯一碳源，嗜鹽度為2.5%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液。所 述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為2.5% NaCl的溶液。(3)從嗜鹽度為2.5%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液C中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為5.0% 的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液。所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液C為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為 5.0%的NaCl溶液。(4)從嗜鹽度為5.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液D中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液D變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為7.5% 的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液D為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為 7.5%的NaCl溶液。(5)從嗜鹽度為7.5%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至無(wú)機(jī)鹽富集 培養(yǎng)液E中37°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液E變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為 10.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液E為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃 度為10.0%的NaCl溶液。(6)將從9處采樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)的五種嗜鹽度1%、2.5%, 5.0%, 7.5%和10.0%的45 組石油降解嗜鹽菌按照同一采樣點(diǎn)的石油降解嗜鹽菌進(jìn)行混合，得到對(duì)應(yīng)于9處采樣點(diǎn) 的9組石油降解嗜鹽菌，編號(hào)分別為Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9，且4°C冷藏。步驟五石油污染土壤修復(fù)高效菌劑的篩選；(1)將嗜鹽度為1.0%、2.5%, 5.0%, 7.5%和10%的石油降解嗜鹽菌用相應(yīng)的 嗜鹽度平板活化，并與石油降解土著菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在30°C，150rpm條 件下振蕩培養(yǎng)至菌體濃度均大于每mL109個(gè)，離心收集菌體制備得到兩種發(fā)酵菌液。(2)取作為石油降解土著菌菌源的土壤，經(jīng)除雜、風(fēng)干、散碎、過(guò)200目篩、混 勻后，將土壤平鋪成2cm的薄層。(3)將土壤分別裝入花盆中，測(cè)定土壤中的油含量和含鹽量。設(shè)定其中1個(gè)花盆 為對(duì)照盆，不接菌，其余花盆中分別接種石油降解土著菌的發(fā)酵菌液和嗜鹽度為1.0%、 2.5%, 5.0%, 7.5%和10.0%的石油降解嗜鹽菌的發(fā)酵菌液；投菌量為每克土壤中含有 IO6 IO8個(gè)菌落(CFU)，且每10-15天投加一次。向土壤中每隔10-15天投加一次營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)，充分混勻。所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為蔗糖和硝酸鉀，每次投加的量為每千克土壤中投加 1 IOg蔗糖，每千克土壤中投加2 16g硝酸鉀；并每天調(diào)節(jié)土壤的含水量，使土壤的 濕度為20% 40%，調(diào)節(jié)土壤的pH = 7 8。試驗(yàn)條件如表1所示，試驗(yàn)過(guò)程中測(cè)定 的參數(shù)如表2所示表1 土壤修復(fù)試驗(yàn)條件
權(quán)利要求
1. 一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，其特征在于包括以下幾個(gè)步驟步驟一石油降解土著菌與嗜鹽菌菌源的采集；取距油田采油廢水排放口處的石油污染土壤作為石油降解土著菌菌源；取距油田采 油廢水處理廠出水口的采油廢水和污水處理廠活性污泥作為嗜鹽菌菌源；步驟二石油降解土著菌的篩選；(1)取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣2g，加入盛有IOOmL無(wú)菌水的錐形瓶，并 置于振蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩0.5 2h，振蕩頻率為200rpm ；(2)從無(wú)菌水的錐形瓶中取5mL溶液，加入IOOmL梯度篩選培養(yǎng)液A中搖瓶培養(yǎng)， 所述的梯度篩選培養(yǎng)液A為質(zhì)量濃度75%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和lg/L原油的混合溶液；(3)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液A中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL梯度 篩選培養(yǎng)液B中搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液B為質(zhì)量濃度為50%牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基和2g/L原油的混合溶液；(4)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液B中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL梯度 篩選培養(yǎng)液C中搖瓶培養(yǎng)，所述的梯度篩選培養(yǎng)液C為質(zhì)量濃度為25%牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基和3g/L原油的混合溶液；(5)當(dāng)梯度篩選培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，從梯度篩選培養(yǎng)液C中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL無(wú)機(jī) 鹽培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基變渾濁時(shí)，得到以石油為唯一碳源的石油降解土 著菌，并冷藏；步驟三嗜鹽菌的篩選；取活性污泥和采油廢水各lml，采用IOOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)梯度馴化 篩選得到鹽度為 20%嗜鹽菌復(fù)合菌系，并利用嗜鹽菌復(fù)合菌系制備菌體濃度IO8 IO9個(gè)/ml的混合嗜鹽菌培養(yǎng)液；步驟四石油降解嗜鹽菌的篩選；(1)嗜鹽度為1.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液的篩選(A)取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣2g，加入盛有IOOmL無(wú)菌水的錐形瓶中， 并置于振蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩；(B)從無(wú)菌水的錐形瓶中取5mL，加入IOOmL富集培養(yǎng)液A中，并向其中加入混合 嗜鹽菌培養(yǎng)液5mL中搖瓶培養(yǎng)，所述的富集培養(yǎng)液A為質(zhì)量濃度75%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基、lg/L原油和1.0% NaCl的混合溶液；(C)當(dāng)富集培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL富集培養(yǎng)液B中搖瓶培養(yǎng)， 所述的富集培養(yǎng)液B為質(zhì)量濃度50%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、2g/L原油和1.0% NaCl的混 合溶液；(D)當(dāng)富集培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL富集培養(yǎng)液C中搖瓶培養(yǎng)， 所述的富集培養(yǎng)液C為質(zhì)量濃度25%牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、3g/L原油和1.0% NaCl的混 合溶液；(E)當(dāng)富集培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，從中取5mL轉(zhuǎn)接至IOOmL無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A中搖瓶 培養(yǎng)，所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和質(zhì)量濃度為1.0% NaCl的混合溶液， 當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液A變渾濁時(shí)，得到以石油為唯一碳源的嗜鹽度為1.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液；(2)從嗜鹽度為1.0%的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至IOOmL無(wú)機(jī)鹽富 集培養(yǎng)液B中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為X的石油降解 嗜鹽菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液B為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為X的NaCl溶 液，且 1.0%< X < 10.0% ；(3)從嗜鹽度為X的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至IOOmL無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液C中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液C變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為Y的石油降解嗜鹽 菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液C為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為Y的NaCl溶液， 且 1.0%< X < Y < 10.0% ；(4)從嗜鹽度為Y的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至IOOmL無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液D中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液D變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為Z的石油降解嗜鹽 菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液D為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為Z的NaCl溶液， 且 1.0%< X < Y < Z < 10.0% ；(5)從嗜鹽度為Z的石油降解嗜鹽菌的培養(yǎng)液中取5ml，轉(zhuǎn)接至IOOmL無(wú)機(jī)鹽富集培 養(yǎng)液E中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液E變渾濁時(shí)，得到嗜鹽度為E的石油降解嗜鹽 菌的培養(yǎng)液；所述的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)液E為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含質(zhì)量濃度為10.0%的NaCl溶 液；(6)將得到的嗜鹽度為1.0%、X、Y、Z和10.0%的石油降解嗜鹽菌按照相同體積比 進(jìn)行混合，得到石油降解嗜鹽菌復(fù)合菌劑；步驟五石油污染土壤修復(fù)的高效菌劑篩選；(1)步驟三中得到的石油降解嗜鹽菌復(fù)合菌劑利用相應(yīng)的鹽度平板活化，并與步驟二 中得到的石油降解土著菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至菌體濃度均大于每毫 升IO9個(gè)，離心收集菌體制備得到兩種發(fā)酵菌液；(2)取作為石油降解土著菌菌源的土壤，經(jīng)除雜、風(fēng)干、散碎、過(guò)200目篩、混勻 后，將土壤平鋪成薄層；(3)將土壤分別裝入花盆中，測(cè)定花盆中土壤的含油量和含鹽量，調(diào)節(jié)土壤的pH值 和濕度；向花盆中分別接種石油降解土著菌的發(fā)酵菌液和石油降解嗜鹽菌復(fù)合菌劑的發(fā) 酵菌液；投菌量均為每克土壤中含有IO6 IO8個(gè)菌落，并每10 15天投加一次；(4)向花盆中每隔10 15天投加一次營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，充分混勻，并每天調(diào)節(jié)土壤的pH 值和濕度；(5)通過(guò)重量法測(cè)每個(gè)花盆中的含油量，利用平板技術(shù)法測(cè)定菌體的濃度，測(cè)定并調(diào) 節(jié)土壤的pH值，7周時(shí)間后，測(cè)定每個(gè)花盆中土壤中石油的降解率，得到降解率最高的 高效菌劑；步驟六高效菌劑的修復(fù)；利用正交修復(fù)實(shí)驗(yàn)分別選取投菌量、濕度、投加蔗糖量和硝酸鉀量作為高效菌劑的 修復(fù)條件，其中投菌量為每克土壤中投加IO6 IO8個(gè)菌體，濕度為20% 40%，投加蔗 糖量為每千克土壤1 10g，投加硝酸鉀量為每千克干土 2 16g;最后得到石油污染土 壤生物修復(fù)菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分每IOOOmL去離子水中含有NH4NO3Ig, K2HPO4 · 3H20 lg, KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H20 0.5g,無(wú)水 CaCl20.02g，F(xiàn)eSO4O-Olg, MnSO4 · H20 0.01g,原油 4g，pH = 7.0, 121°C滅菌 20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，其特征 在于所述的步驟六中所述的修復(fù)具體過(guò)程為(1)利用篩選得到的高效菌劑進(jìn)行正交修復(fù)實(shí)驗(yàn)，首先用相應(yīng)的鹽度平板活化，再采 用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌體濃度大于每毫升IO9個(gè)，離心收集菌體制備得到發(fā)酵菌 液；(2)取作為石油降解土著菌菌源的土壤，經(jīng)除雜、風(fēng)干、散碎、過(guò)200目篩、混勻 后，將土壤平鋪成2cm的薄層，調(diào)節(jié)土壤的pH = 7 8;(3)將土壤分別裝入花盆中，通過(guò)重量法測(cè)定每個(gè)花盆中的含油量和含鹽量；(4)控制每個(gè)花盆中投菌量為每千克土壤中投加IO6 IO8個(gè)菌體，濕度為20% 40%,投加蔗糖量為每千克土壤中1 10g，投加硝酸鉀量為每千克土壤中2 16g ；并 每10 15天向土壤中投加高效菌劑、蔗糖和硝酸鉀來(lái)保證土壤中菌體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含 量，濕度通過(guò)早晚噴水控制；(5)每隔7天通過(guò)重量法測(cè)定每個(gè)花盆中的含油量，每隔7天利用平板技術(shù)法測(cè)一下 菌體的濃度，每隔3天測(cè)定并調(diào)節(jié)土壤的pH值，7周時(shí)間后，測(cè)定每個(gè)花盆土壤中石油 的降解率，得到降解率最高的修復(fù)條件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，其 特征在于所述的石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的修復(fù)條件為應(yīng)用石油降解嗜鹽菌復(fù)合 菌劑降解時(shí)濕度為40%，投菌量為IO8個(gè)/g 土壤；在修復(fù)前2周的硝酸鉀投加量為16g/ kg土壤，第3周開(kāi)始后硝酸鉀投加量為8g/kg 土壤；在修復(fù)前3周蔗糖投加量為5 IOg/ kg 土壤，第4周開(kāi)始后蔗糖投加量為1 5g/kg 土壤。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，其特征 在于所述的步驟四中X = 2.5%，Y = 5.0%, Z = 7.5%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，具體包括石油降解土著菌與嗜鹽菌菌源的采集、石油降解土著菌的篩選、嗜鹽菌的篩選、石油降解嗜鹽菌的篩選、石油污染土壤修復(fù)的高效菌劑篩選和利用正交修復(fù)實(shí)驗(yàn)選取高效降解菌劑修復(fù)的優(yōu)化條件六個(gè)步驟。經(jīng)該篩選及修復(fù)方法所篩選得到的生物修復(fù)菌劑可應(yīng)用于含鹽量10～20g/Kg石油污染土壤的生物修復(fù)；本發(fā)明公開(kāi)的石油污染土壤生物修復(fù)菌劑篩選及修復(fù)方法具有很高的實(shí)用價(jià)值，可廣泛應(yīng)用在用于石油污染土壤、海岸沙灘、采油廢水等生物修復(fù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102021132SQ20101055249
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者楊玉楠, 韓冬 申請(qǐng)人:北京航空航天大學(xué)