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      動物組織dna提取方法

      文檔序號:587288閱讀:1550來源:國知局
      專利名稱:動物組織dna提取方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種動物組織DNA提取方法,尤其是一種操作簡單,不但提取速度快, 而且所提起的DNA純度高的動物組織DNA提取方法。
      背景技術(shù)
      核酸和蛋白質(zhì)在生物體中以核蛋白的形式存在,其中DNA主要存在于細胞核中, RNA主要存在于核仁及胞質(zhì)中。通常在制備核酸時應(yīng)防止過酸、過堿及其他能引起核酸降解 的因素作用,如全部操作過程應(yīng)在低溫(4°C)下進行,必要時要加入檸檬酸、氰化物、硝酸 鹽、乙二胺四乙酸(EDTA)等酶抑制劑,同時還要避免SDS或苯酚等蛋白變性劑等使核酸降 解酶被破壞。傳統(tǒng)提取DNA的方法是先將DNA與RNA分開,再將DNA與蛋白質(zhì)分開。作用原 理是由于動植物DNA核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液(如lmol/L NaCl),但在0. 14mol/ L的鹽溶液中溶解度很低,而RNA核蛋白則溶于0. 14mol/L鹽溶液,因此可利用不同濃度的 氯化鈉溶液,將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽離出來。再將脫氧核糖核蛋 白SDS(十二烷基硫酸鈉)處理,DNA即與蛋白質(zhì)分開,可用氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除 去,而DNA則溶解與溶液中,向含有DNA的水中加入冷乙醇,DNA即呈纖維狀沉淀出來。提 取過程所用材料、試劑較多,操作復(fù)雜而且耗時較長。特別是除去蛋白質(zhì)的操作,若震蕩劇 烈可使DNA斷裂,致使提取含量降低,可震蕩不夠,則蛋白質(zhì)不能很好除去,所提取的DNA不 純。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題,提供一種操作簡單、不但提 取速度快,而且所提起的DNA純度高的動物組織DNA提取方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種動物組織DNA提取方法,其特征在于按如下步驟 進行a.取動物組織50mg,剪碎后置于勻漿器中,加入300 μ 1勻漿液冰浴研磨,所述勻 漿液為 0. 06Μ EDTA、0. IM Tris_HCl、0. 16M 蔗糖、0. 08M NaCl ;b.力口入3μ1 10mg/mlde蛋白酶Κ、15μ 1 10% SDS,混勻后于55°C水浴中置2 4小時至溶液呈透明粘稠狀;c.加5M乙酸鉀至終濃度1M,混勻,4°C放置30min ;d. 4°C,12000r/min離心IOmin ;取上清液移至另一離心管中,加入二倍體積預(yù)冷 的無水乙醇,4°C放置Ih ;e. 4°C,12000r/min離心IOmin ;棄上清,用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次后室溫 干燥,50 μ 1 TE溶解;f.向e步驟所得溶液中加入1/50體積的10mg/ml的RnaseA,37°C恒溫lh。本發(fā)明先用蛋白酶將核蛋白中的蛋白質(zhì)除去,再用乙醇對核酸進行粗提純,最后 再用RnaseA消化RNA,進而使DNA與RNA分開,操作簡單,不但提取速度快,而且所提起的DNA純度高


      圖1是本發(fā)明實施例所提取DNA的電泳圖譜。
      具體實施例方式a.取魚肝臟組織50mg,剪碎后置于勻漿器中,加入300 μ 1勻漿液冰浴研磨,所述 勻菜液為 0. 06Μ EDTA、0. IM Tris-HCl、0. 16M 蔗糖、0. 08M NaCl ;b.加入3“11011^/1111(16蛋白酶1(、15“110%505,混勻后于551水浴中置2 4 小時至溶液呈透明粘稠狀;c.加5M乙酸鉀至終濃度1M,混勻,4°C放置30min ;d. 4°C,12000r/min離心IOmin ;取上清液移至另一離心管中,加入二倍體積預(yù)冷 的無水乙醇,4°C放置Ih ;e. 4°C,12000r/min離心IOmin ;棄上清,用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次后室溫 干燥,50 μ 1 TE溶解;f.向e步驟所得溶液中加入1/50體積的10mg/ml的RnaseA,37°C恒溫lh。作用原理制備過程中加入酶抑制劑,如二胺四乙酸(EDTA),防止核酸降解;核蛋白用蛋白酶處理,可去除其中的蛋白質(zhì);向核酸的水相中加入冷乙醇,核酸即 呈纖維狀沉淀出來。RnaseA能消化RNA而不能消化DNA,故用RnaseA消化去除核算中的RNA。電泳分析取所提取的DNA樣品2 μ 1與2 μ 1溴酚藍混合,HindIII DNA marker 作標準分子量,1 %瓊脂糖凝膠電泳(含0. 5 μ g/ml EB)檢測其完整性,電壓為80V,電泳40 分鐘。用凝膠成像系統(tǒng)拍照,估計樣品DNA的分子量并初步估計DNA樣品的濃度,如圖1所 示完整的DNA在電泳時呈現(xiàn)出一條清晰的高亮度主帶。紫外分光光度計檢測取所提取的DNA樣品10 μ 1稀釋至2ml,在紫外分光光度計 上測A260和A280OD值,其0D26。/0D28。的值應(yīng)在1. 8左右。
      權(quán)利要求
      1. 一種動物組織DNA提取方法,其特征在于按如下步驟進行a.取動物組織50mg,剪碎后置于勻漿器中,加入300μ1勻漿液冰浴研磨,所述勻漿液 為 0. 06Μ EDTA、0. IM Tris-HCl、0. 16M 蔗糖、0. 08M NaCl ;b.加入3μ110mg/mlde蛋白酶Κ、15μ 110% SDS,混勻后于55°C水浴中置2 4小時 至溶液呈透明粘稠狀;c.加5M乙酸鉀至終濃度1M,混勻,4°C放置30min;d.4°C,12000r/min離心IOmin ;取上清液移至另一離心管中,加入二倍體積預(yù)冷的無 水乙醇,4°C放置Ih;e.4°C,12000r/min離心IOmin ;棄上清,用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次后室溫干燥, 50 μ ITE 溶解;f.向e步驟所得溶液中加入1/50體積的10mg/ml的foiaseA,37°C恒溫lh。
      全文摘要
      本發(fā)明公開一種操作簡單,不但提取速度快,而且所提取的DNA純度高的動物組織DNA提取方法,按如下步驟進行取動物組織50mg,剪碎后置于勻漿器中,加入300μl勻漿液冰浴研磨;加入3μl 10mg/mlde蛋白酶K、15μl 10%SDS,混勻后于55℃水浴中置2~4小時至溶液呈透明粘稠狀;加5M乙酸鉀至終濃度1M,混勻,4℃放置30min;4℃,12000r/min離心10min;取上清液移至另一離心管中,加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇,4℃放置1h;4℃,12000r/min離心10min;棄上清,用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次后室溫干燥,50μlTE溶解;向e步驟所得溶液中加入1/50體積的10mg/ml的RnaseA,37℃恒溫1h。
      文檔編號C12N15/10GK102140448SQ20101055915
      公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
      發(fā)明者劉珊, 王偉, 石磊 申請人:大連海洋大學(xué)
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