從動物提取泛素及類泛素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從動物提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟：首先將節(jié)肢動物、環(huán)節(jié)動物、刺胞動物、可食用魚類或家禽的組織、皮、肉及家畜的組織、皮、肉清洗干凈，得到原料；然后將原料絞碎后濕磨，得到漿液；混勻漿液，加入碳酸氫鈉或氫氧化鈉，攪拌、離心收集上清液；將所述上清液濃縮至原體積的1/10～1/25，得到蛋白濃縮液；加入乙醇，靜置后離心收集沉淀；用Tris-Gly緩沖液溶解沉淀配成溶液，將溶液經兩次過濾收集分子量在6000～14000之間的截留液，即所述泛素及類泛素。該方法生產工藝簡單、成本低，能制得安全性高、營養(yǎng)價值好的泛素及類泛素產品。
【專利說明】從動物提取泛素及類泛素的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種從動物提取泛素及類泛素的方法。
【背景技術】
[0002]泛素(Ubiquitin，Ub)是一種多肽，由76個氨基酸構成，其分子量約8.5kDa，1975年首次從小牛的胰臟中分離出來，隨后在許多不同有機體和組織中被發(fā)現，泛素的氨基酸序列具有高度保守性。在真核細胞內，泛素以共價鍵結合到底物蛋白質的賴氨酸殘基上，被4個以上泛素標記的蛋白質將被送到“垃圾處理廠”，被26S蛋白酶體識別并迅速降解。近年來，隨著對泛素研究的不斷深入，發(fā)現泛素不僅僅是蛋白質降解的標記，還是細胞維持對那些受組成型調節(jié)和環(huán)境刺激產生的蛋白質水平的基本調節(jié)方式，細胞內蛋白質泛素化參與細胞的多種生理過程，比如:細胞周期進程、細胞器的發(fā)生、細胞凋亡、細胞增生和分化調節(jié)、內質網蛋白質的質控、蛋白轉運、炎癥反應、抗原提呈和DNA修復，以及細胞應激反應等等，在各個生命活動中發(fā)揮著重要的作用。
[0003]隨著越來越多的泛素蛋白被報道，各種類似泛素的修飾蛋白也不斷地被發(fā)現，如:SUM0、Rubl、Apgs和ApglZ等。類泛素蛋白(Ubls)作為信號使者與類泛素共同控制著多種細胞功能，諸如細胞增殖、凋亡、細胞周期及DNA修復，與泛素在人體自我修復功能系統(tǒng)中扮演著重要的角色。
[0004]泛素及類泛素蛋白有著廣泛的生物學功能，泛素的開發(fā)應用價值將逐漸受到重視，從泛素及類泛素的研究中尋找治療腫瘤疾病、心臟疾病、神經疾病等多種疾病的新途徑將是未來醫(yī)學的趨勢之一，泛素及類泛素在植物基因工程技術和提高植物抗逆性等方面的探索及應用將為未來的農業(yè)提供新的線索與方向。
[0005]自1975年泛素在小牛胰臟中分離出來，目前對泛素及類泛素的研究主要集中在作用機理方面，隨著科學技術和現代的分析手段的發(fā)展，越來越多的不同種類動物中的泛素及類泛素的作用機理正在被研究，但是目前利用動物為原料提取及純化泛素的方法存在提取工藝復雜、成本高等缺點。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供一種從動物提取泛素及類泛素的方法，該方法生產工藝簡單、成本低，能制得安全性高、營養(yǎng)價值好的泛素及類泛素產品。
[0007]為此，本發(fā)明的技術方案為:
[0008]一種從動物提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟:
[0009]I)將節(jié)肢動物、環(huán)節(jié)動物、刺胞動物、可食用魚類或家禽的組織、皮、肉及家畜的組織、皮、肉用水或質量濃度低于0.3%的有機酸鈉鹽水溶液清洗干凈，得到原料；所述有機酸鈉鹽為十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酸鈉、甲酸鈉或硬脂酸鈉；
[0010]2)將所述原料絞碎后進行濕磨，濕磨過程中加入質量為所述原料5~7倍的濃度為25mmol/L、pH=7.6~8.0的Tris-Gly緩沖液；濕磨后進行勻漿，得到粒度為50~150目的漿液；
[0011]3)將所述漿液在4~10°C條件下置于恒溫搖床中處理5~10h，或者在4~10°C條件下攪拌I~2h，得到均勻漿液；
[0012]4)向所述均勻漿液中加入質量濃度為0.2~1.0%的碳酸氫鈉或者0.1~0.5%的氫氧化鈉，充分攪拌，然后離心分離收集上清液；
[0013]5)將所述上清液濃縮至原體積的1/10~1/25，得到蛋白濃縮液；
[0014]6)向所述蛋白濃縮液中加入質量濃度為95%的乙醇直至其中乙醇質量濃度為75%時停止添加，靜置后離心并收集沉淀；
[0015]7)向所述沉淀中加入pH=7.6~8.0、濃度為25mmol/L的Tris-Gly緩沖液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0016]8)將步驟7)得到的溶液用截留分子量為14000的超濾膜過濾并收集濾過液；然后將所述濾過液用截留分子量為6000的超濾膜過濾并收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0017]步驟5)濃縮上清液的方法是利用孔徑為0.0001~0.001 μ m的透析膜循環(huán)過濾。 [0018]所述節(jié)肢動物為蜂、蟻、蛾、家蟬、蟋蟀、蟈蟈、蜈蚣、全蝎或蝗蟲；所述環(huán)節(jié)動物為蚯蚓或水蛭；所述刺胞動物為海蜇；所述家畜為豬、牛或羊；所述家禽為雞或鴨。
[0019]所述蜂為胡蜂、黃蜂或蜜蜂；所述蟻為白蟻或螞蟻；所述蛾為天蛾、夜蛾或螟蛾。
[0020]本發(fā)明利用動物為原料，通過磨漿、脫脂、濃縮、沉淀、超濾等步驟獲得泛素及類泛素蛋白，本發(fā)明方法的優(yōu)點體現在以下兩點:
[0021]I)從生產工藝上看，本發(fā)明在利用醇沉之前對粗蛋白液首先進行了濃縮，提高了沉淀前粗蛋白液的濃度，提高了醇沉效率，繼而提高了泛素及類泛素蛋白的提取效率，在脫脂、醇沉步驟中使用的試劑成本低廉，且在提取過程中不引進有機溶劑等有毒物質，保證了提取泛素及類泛素蛋白的安全性。
[0022]2)從獲得的產品上看，生產的泛素及類泛素蛋白與普通的蛋白粉相比更有效的增加免疫功效、促進免疫細胞的增殖，提高了原料利用價值的同時獲得了有更高的實用價值和經濟價值產品。
【具體實施方式】
[0023]以下結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行描述。
[0024]實施例1
[0025]以水蛭為原料提取泛素及類泛素，包括如下步驟:
[0026]I)將水蛭用水清洗，不僅除去其軀體表面的污物，也去除消化道內的污物，得到原料；
[0027]2)將所述原料絞碎后進行濕磨，濕磨過程中加入質量為所述原料7倍的濃度為25mmol/L、pH=7.6的Tris-Gly緩沖液；濕磨后進行勻漿，得到粒度為50~150目的漿液；
[0028]3)將所述漿液在10°C條件下置于恒溫搖床中處理5h ；
[0029]4)向所述均勻漿液中加入質量濃度為1.0%的碳酸氫鈉充分攪拌，然后利用碟式離心機進行離心分離，收集上清液；
[0030]5)將所述上清液濃縮用0.0001 μ m的透析膜循環(huán)過濾，濃縮為原體積的1/20，得到蛋白濃縮液；
[0031]6)向所述蛋白濃縮液中加入質量濃度為95%的乙醇直至其中乙醇質量濃度為75%時停止添加，靜置2h,在10000/min條件下離心15min,收集沉淀；
[0032]7)向所述沉淀中加入pH=7.6、濃度為25mmol/L的Tris-Gly緩沖液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0033]8)將步驟7)得到的溶液用截留分子量為1.4萬的超濾膜過濾并收集濾過液；然后將所述濾過液用截留分子量為6000的中性超濾膜過濾并收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0034]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制成膠囊或片劑:
[0035]將上述泛素及類泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機內調節(jié)適宜溫度噴制成細粉，將粉進行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
[0036]實施例2
[0037]以蚯蚓原料提取泛素及類泛素，包括如下步驟:
[0038]I)將蚯蚓用濃度為0.29%的聚丙烯酸鈉水溶液進行清洗，不僅除去其軀體表面的污物，也去除消化道內的污物，得到原料； [0039]2)將所述原料絞碎后進行濕磨，濕磨過程中加入質量為所述原料6倍的濃度為25mmol/L、pH=7.6的Tri s-Gly緩沖液；濕磨后進行勻漿，得到粒度為50~150目的漿液；
[0040]3)將所述漿液在4°C條件下置于恒溫搖床中處理7h ；
[0041]4)向所述均勻漿液中加入質量濃度為0.8%的氫氧化鈉充分攪拌，然后利用碟式離心機進行離心分離，收集上清液；
[0042]5)將所述上清液濃縮用0.001 μ m的透析膜循環(huán)過濾，濃縮為原體積的1/20，得到蛋白濃縮液；
[0043]6)向所述蛋白濃縮液中加入質量濃度為95%的乙醇直至其中乙醇質量濃度為75%時停止添加，靜置2h,在8000/min條件下離心20min,收集沉淀；
[0044]7)向所述沉淀中加入pH=7.6、濃度為25mmol/L的Tris-Gly緩沖液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0045]8)將步驟7)得到的溶液用截留分子量為1.4萬的超濾膜過濾并收集濾過液；然后將所述濾過液用截留分子量為6000的中性超濾膜過濾并收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0046]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制成膠囊或片劑:
[0047]將上述泛素及類泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機內調節(jié)適宜溫度噴制成細粉，將粉進行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
[0048]實施例3
[0049]以蜜蜂為原料提取泛素及類泛素，包括如下步驟:
[0050]I)將蜜蜂用濃度為0.1%的甲酸鈉水溶液進行清洗，不僅除去其軀體表面的污物，也去除消化道內的污物，得到原料；
[0051]2)將所述原料絞碎后進行濕磨，濕磨過程中加入質量為所述原料6倍的濃度為25mmol/L、pH=8的Tris-Gly緩沖液；濕磨后進行勻漿，得到粒度為50~150目的漿液；
[0052]3)將所述漿液在6°C條件下置于恒溫搖床中處理IOh ；[0053]4)向所述均勻漿液中加入質量濃度為0.2%的氫氧化鈉充分攪拌，然后利用碟式離心機進行離心分離，收集上清液；
[0054]5)將所述上清液濃縮用0.0001 μ m的透析膜循環(huán)過濾，濃縮為原體積的1/15，得到蛋白濃縮液；
[0055]6)向所述蛋白濃縮液中加入質量濃度為95%的乙醇直至其中乙醇質量濃度為75%時停止添加，靜置2h,在6000/min條件下離心20min,收集沉淀；
[0056]7)向所述沉淀中加入pH=8.0、濃度為25mmol/L的Tris-Gly緩沖液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0057]8)將步驟7)得到的溶液用截留分子量為1.4萬的超濾膜過濾并收集濾過液；然后將所述濾過液用截留分子量為6000的中性超濾膜過濾并收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0058]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制成膠囊或片劑:
[0059]將上述泛素及類泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機內調節(jié)適宜溫度噴制成細粉，將粉進行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
[0060]實施例4
[0061]以全蝎為原料提取泛素及類泛素，包括如下步驟:
[0062]I)將全蝎用水清洗，不僅除去其軀體表面的污物，也去除消化道內的污物，得到原料；
[0063]2)將所述原料絞碎后進行濕磨，濕磨過程中加入質量為所述原料5倍的濃度為25mmol/L、pH=8.0的Tris-Gly緩沖液；濕磨后進行勻漿，得到粒度為50~150目的漿液；
[0064]3)將所述漿液在6°C條件下攪拌lh，得到均勻漿液；
[0065]4)向所述均勻漿液中加入質量濃度為0.2%的碳酸氫鈉充分攪拌，然后利用碟式離心機進行離心分離，收集上清液；
[0066]5)將所述上清液濃縮用0.0001 μ m的透析膜循環(huán)過濾，濃縮為原體積的1/20，得到蛋白濃縮液；
[0067]6)向所述蛋白濃縮液中加入質量濃度為95%的乙醇直至其中乙醇質量濃度為75%時停止添加，靜置2h,在12000/min條件下離心IOmin,收集沉淀；
[0068]7)向所述沉淀中加入pH=8.0、濃度為25mmol/L的Tris-Gly緩沖液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液；
[0069]8)將步驟7)得到的溶液用截留分子量為1.4萬的超濾膜過濾并收集濾過液；然后將所述濾過液用截留分子量為6000的中性超濾膜過濾并收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0070]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制成膠囊或片劑:
[0071]將上述泛素及類泛素，加入其重量8~10%的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機內調節(jié)適宜溫度噴制成細粉，將粉進行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
[0072]性能測試:
[0073](I)泛素及類泛素蛋白對小鼠脾淋巴細胞增殖能力試驗
[0074]取實例中1、2提取的泛素及類泛素，選取小白鼠進行試驗。
[0075]試驗方法:將小鼠處死，無菌取脾臟，用鑷子輕輕將脾磨碎，用Hank’s液洗滌兩次，在lOOOr/min條件下離心IOmin收集細胞，用含血清的RPM1-1640培養(yǎng)液制成單個細胞懸液。調整細胞濃度為4X106個/mL。將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，150 μ L/孔，白對照加入不含血清的RPM1-1640培養(yǎng)液50 μ L，其他各組加入用不含血清的RPM1-1640培養(yǎng)液配置成的蛋白質溶液50 μ L，每個樣品做三個平行，置于37°C、含有5%C02的CO2孵箱中培養(yǎng)72h。
[0076]培養(yǎng)結束前4h，加入XTT-PMS30 μ L/孔，培養(yǎng)結束后，在酶標儀上測450nm波長條件下各孔的光吸收值，以此值表示細胞增殖程度。
[0077]實驗結果:下表為不同蛋白質對小鼠脾淋巴細胞增殖的直接影響?？梢?~5組空白對照組相比有顯著差異，實例中獲取的蛋白質均能促進脾淋巴細胞的增殖，實例中獲得泛素及類泛素蛋白與普通蛋白相比更加能促進脾淋巴細胞的增殖。與空白對照相比具有顯著差異(P < 0.05)
[0078]
【權利要求】
1.一種從動物提取泛素及類泛素的方法，其特征在于包含如下步驟: 1)將節(jié)肢動物、環(huán)節(jié)動物、刺胞動物、可食用魚類或家禽的組織、皮、肉及家畜的組織、皮、肉用水或質量濃度低于0.3%的有機酸鈉鹽水溶液清洗干凈，得到原料； 2)將所述原料絞碎后進行濕磨，濕磨過程中加入質量為所述原料5~7倍的濃度為25mmol/L、pH=7.6~8.0的Tris-Gly緩沖液；濕磨后進行勻漿，得到粒度為50~150目的漿液； 3)將所述漿液在4~10°C條件下置于恒溫搖床中處理5~10h，或者在4~10°C條件下攪拌I~2h，得到均勻漿液； 4)向所述均勻漿液中加入質量濃度為0.2~1.0%的碳酸氫鈉或者0.1~0.5%的氫氧化鈉，充分攪拌，然后離心分離收集上清液； 5)將所述上清液濃縮至原體積的1/10~1/25，得到蛋白濃縮液； 6)向所述蛋白濃縮液中加入質量濃度為95%的乙醇直至其中乙醇質量濃度為75%時停止添加，靜置后離心并收集沉淀； 7)向所述沉淀中加入pH=7.6~8.0、濃度為25mmol/L的Tris-Gly緩沖液至沉淀溶解，除去不溶物，收集溶液； 8)將步驟7)得到的溶液用截留分子量為14000的超濾膜過濾并收集濾過液；然后將所述濾過液用截留分子量為6000的超濾膜過濾并收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述有機酸鈉鹽為十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酸鈉、甲酸鈉或硬脂酸鈉。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟5)中濃縮上清液的方法是利用孔徑為0.0001~0.001 μ m的透析膜循環(huán)過濾。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述節(jié)肢動物為蜂、蟻、蛾、家蟬、蟋蟀、蟈蟈、蜈蚣、全蝎或蝗蟲；所述環(huán)節(jié)動物為蚯蚓或水蛭；所述刺胞動物為海蜇；所述家畜為豬、?；蜓颍凰黾仪轂殡u或鴨。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于:所述蜂為胡蜂、黃蜂或蜜蜂；所述蟻為白蟻或螞蟻；所述蛾為天蛾、夜蛾或螟蛾。
【文檔編號】C07K1/30GK103788173SQ201410071665
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權日:2014年2月28日
【發(fā)明者】趙金梁, 趙發(fā) 申請人:天津替代醫(yī)學科技有限公司