專利名稱：一種快速鑒別和檢測肝片吸蟲和大片吸蟲的lamp檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用LAMP方法快速區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲的鑒別技術(shù)。
背景技術(shù)：
片形吸蟲病是牛、羊最主要的寄生蟲病之一。它是由寄生于黃牛、水牛、山 羊、綿羊等各種反芻動(dòng)物肝臟膽管中的肝片形吸蟲和大片形吸蟲所引起的，豬、馬屬動(dòng) 物及野生動(dòng)物也可寄生，并且可寄生于人。該病能引起急性或慢性的肝炎和膽管炎，并 繼發(fā)全身性的中毒和營養(yǎng)障礙，常引起犢牛和綿羊的大批死亡。本病呈地方性流行，多 發(fā)生在低洼、潮濕的放牧地區(qū)。肝片吸蟲和大片吸蟲形態(tài)極其相似。長期以來，兩者的分類鑒定主要依據(jù)成 蟲的形態(tài)、生活史、流行病學(xué)等特征來進(jìn)行，但由于片形吸蟲種類個(gè)體差異較大，同一 蟲種又因宿主的種類、宿主的反應(yīng)的不同而有一定差異，導(dǎo)致蟲體的形態(tài)不很規(guī)則，用 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法有時(shí)就有局限性，對于這兩種吸蟲的尾蚴和蟲卵的鑒定就更加困 難。近年來，一些學(xué)者分析了片形吸蟲染色體的核型和同工酶的多態(tài)性，但染色體核型 的研究結(jié)果存在一些矛盾，有人認(rèn)為肝片吸蟲染色體組成為3n=30，大片吸蟲染色體組成 2n=20,但也有相反的結(jié)果。分子遺傳學(xué)分析為片形吸蟲分類的研究提供了新的途徑。黃維義等應(yīng)用 PCR-RFLP對來自廣西、四川、黑龍江、法國等地的片形吸蟲進(jìn)行分析，用限制性內(nèi)切 酶Hsp92 II、Rca I酶切核糖體DNA第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-2)的完整的PCR產(chǎn)物，結(jié) 果顯示，兩種酶的酶切帶型在種內(nèi)無差異，但在種間卻均有一定的差異。胥全彬等應(yīng)用 RAPD技術(shù)鑒別南京市的片形吸蟲非典型形態(tài)蟲體，鑒定為形態(tài)不典型的大片吸蟲。但 以上技術(shù)操作起來需要PCR儀等比較昂貴的儀器，所以在大批量樣本檢測和蟲卵及尾蚴 樣本分型時(shí)比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplification , LAMP)是 Notomi 等在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì) 4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(5對DNA polymerase)在等溫條件(65 °C左 右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，不需要模板的熱變性、長時(shí)間溫度循環(huán)、 繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。但是，由于現(xiàn)有的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對操作環(huán)境要求很高，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)也較 高，尤其是其中使用的SYBR green I染料較貴，現(xiàn)有片形吸蟲的蟲種鑒定通常是通 過獲取成蟲樣本觀察其形態(tài)來確定，目前還未見環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification , LAMP)應(yīng)用于片形吸蟲蟲種的鑒定，也未見環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)應(yīng)用于片形吸蟲病的快速檢測和防控檢測的技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是填補(bǔ)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于片形吸蟲病的快速檢測和防控 檢測的技術(shù)空白，提供一種快速區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法，突破現(xiàn)有 技術(shù)在片行吸蟲研究方面存在的技術(shù)限制。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供實(shí)現(xiàn)上述檢測方法的LAMP試劑盒。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
提供一種快速區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法，包括以下步驟 (1)肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲、尾蚴或蟲卵DNA的提??； 成蟲樣本取自?；蜓颍晃豺蕵颖救∽宰祵?shí)螺；蟲卵樣本取自羊或牛的糞便； (2)采用特異性檢測引物應(yīng)用恒溫加熱器技術(shù)(LAMP)進(jìn)行擴(kuò)增； (3)將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察。本發(fā)明步驟(3)也可以將產(chǎn)物經(jīng)SYBR green I顯色液顯色后，在凝膠成像系 統(tǒng)下觀察。步驟(1)所述DNA的提取蟲體材料置于1.5mL的離心管中，用雙蒸水反 復(fù)吹打沖洗3次，移去離心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)釋放基因組DNA， 56°C過夜消化15 18h ；消化好的蟲體懸液按Promega試劑盒Wizard SV Genomic DNA purification system使用說明提取蟲體DNA，直接使用或于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ豺蔇NA的提取方法為將宿主螺用滅菌雙蒸水反復(fù)洗5次，用兩個(gè)載玻片將其 壓碎，去掉外面的螺殼，螺肉內(nèi)尾蚴的提取方法參照蟲體的提取方法。蟲卵DNA的提取方法參照Miiller (2007)提純蟲卵的方法并加以改良，取0.1 克陽性糞便于1.5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0.1M的氫氧化鉀的 溶液Iml室溫下作用10 min，其間不斷搖勻。然后IOOOOrpm離心2min，去上清，重復(fù)前 面的步驟清洗兩次。離心去上清后加入1.2 ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，HOOOrpm離 心5min。此時(shí)蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中。分別吸取200μ1上清到另一 個(gè)1.5ml Eppendorf管中，加入1.2 ml雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，保留ΙΟΟμΙ 左右液體，用移液器吹打使沉淀與液體混勻。然后把各管的液體都移到同一管中，離心 管內(nèi)加滿雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，再加入1.2 ml雙蒸水，如此重復(fù)3 5 次。最后離心去上清，保留30μ1液體。在顯微鏡下操作，用移液器從純化的蟲卵中分別吸取1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)蟲卵到含 有30μ1的1.5ml Eppendorf管中，做好標(biāo)記，以檢測蟲卵特異PCR檢測方法的敏感性。加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩Imin后瞬時(shí)離心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm離心lmin，取3μ1上清PCR擴(kuò)增。步驟(2)所述特異性檢測引物分別如SEQIDNO 1 SEQIDNO 12所示，
或如表1所示 表1步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增按照擴(kuò)增樣品數(shù)η (η=樣品數(shù)+2)取LAMP反應(yīng)液、 酶混合于一離心管中，混勻，分裝；將陽、陰性對照液分別加入一個(gè)分裝管中，取各 樣品的DNA加入對應(yīng)反應(yīng)管中；各反應(yīng)管標(biāo)記后離心混勻，置于恒溫加熱器上反應(yīng)； 步驟(2)所述fe/酶按每個(gè)PCR反應(yīng)含1.25U加入。步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增條件為肝片吸蟲LAMP檢測為61°C，大片吸蟲 LAMP檢測為62°C，各反應(yīng)45分鐘。步驟(3)所述LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物觀察取擴(kuò)增后的產(chǎn)物加樣于2.0%瓊脂糖凝膠 上，電泳后置于紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照分析；
LAMP顯色反應(yīng)將上述LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物各加入1 μ L SYBR green I在室溫放置5
min,進(jìn)行顯色。顯色反應(yīng)觀察肉眼觀察陽性反應(yīng)呈綠色，陰性不變色；在紫外燈下，陽性反 應(yīng)發(fā)出熒光，陰性反應(yīng)無熒光。本發(fā)明同時(shí)提供一種實(shí)現(xiàn)上述方法的LAMP試劑盒，包括以下組分
(1)DNA 裂解液Nuclei lysis solution、EDTA、蛋白酶 K 和 RNase A solution 的混
合溶液；
(2)LAMP 反應(yīng)液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、betaine、引物 FIP、BIP> F3、 B3、環(huán)引物L(fēng)oop F、LoopB和MgSO4的混合溶液；
(3 ) SYBR green I顯色液1 10倍稀釋液；
(4)肝片吸蟲DNA陽性對照和大片吸蟲DNA陽性對照。在上述試劑盒中，還可以添加β訪大片段聚合酶。在上述試劑盒中，各物質(zhì)的優(yōu)選量為
(1)DNA 裂解液，27.5mL:為 100 個(gè)反應(yīng)的 200 μ L Nuclei lysis solution、50 μ L pH 8.0 的 0.5M 的 EDTA、20 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)禾口 5 μ L RNase A solution (4mg/mL) 的混合溶液；
(2)LAMP 反應(yīng)液，2.5mL:為終濃度 200μΜ 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP, 終濃度 0.2mM 的引物 FIP、BIP> F3、B3, 0.8 μ M 環(huán)引物 Loop F、LoopB, 10 μ M 的 betaine, IOmM的MgSO4的混合溶液；(3 ) SYBR green I顯色液1 10倍稀釋液；
(4)肝片吸蟲和大片吸蟲DNA陽性對照ΙΟΟμ 和其他吸蟲DNA陽性對照ΙΟΟμ ；
(5)S^1DNA 聚合酶，8U/VL，25μ 。本發(fā)明試劑盒LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化過程為
本申請人通過對來自于全球不同流行區(qū)(中國、尼日爾、法國、美國和西班牙) 的肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲分離株、尾蚴、蟲卵進(jìn)行快速檢測，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)(LAMP)技術(shù)擴(kuò)增了核糖體基因間隔區(qū)(the ribosomalintergenic spacer (IGS))，發(fā) 現(xiàn)了該段基因(已上傳至NCBI :肝片吸蟲的序列號為GU903890，大片吸蟲的序列號為 GU903891) DNA裂解液能特異的區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲。本申請人根據(jù)肝片吸蟲和 大片吸蟲IGS基因的特性并結(jié)合LAMP技術(shù)的檢測特點(diǎn)，設(shè)計(jì)本發(fā)明方法快速區(qū)分肝片 吸蟲和大片吸蟲。根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，對MgS04、Betaine> Bst DNA PoLymerase> dNTP、
引物濃度等分別進(jìn)行了優(yōu)化，包括根據(jù)引物Tm值，將溫度按59 °C、60 °C、61 °C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C依次遞增，從多次試驗(yàn)和創(chuàng)造性地分析總結(jié)中確定最佳退火溫 度；反應(yīng)時(shí)間按30min、45min、60 min、90 min、120min優(yōu)化，從多次試驗(yàn)和創(chuàng)造性地 分析總結(jié)中確定最佳反應(yīng)時(shí)間。最后確定優(yōu)選的技術(shù)方案是，肝片吸蟲LAMP反應(yīng)最佳 反應(yīng)溫度為61°C ；大片吸蟲LAMP反應(yīng)最佳反應(yīng)溫度為62°C ；添加環(huán)引物后反應(yīng)最快可 在45min內(nèi)完成。本發(fā)明的有益效果是
(1)本發(fā)明通過對來自于不同流行區(qū)的肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲分離株、尾蚴、 蟲卵進(jìn)行LAMP反應(yīng)，成功實(shí)現(xiàn)應(yīng)用LAMP技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)區(qū)分鑒別肝片吸蟲和大片吸 蟲，設(shè)計(jì)一種快速鑒定肝片吸蟲和大片吸蟲的檢測方法；
(2)本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種快速鑒別肝片吸蟲和大片吸 蟲的LAMP檢測試劑盒，試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定 客觀，不僅可用于肝片吸蟲和大片吸蟲的區(qū)分，還可用于人和動(dòng)物片形吸蟲病的診斷與 流行病學(xué)調(diào)查，為片形吸蟲病診斷和防治技術(shù)等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。


圖1為肝片吸蟲的LAMP特異性電泳圖譜； 圖2為大片吸蟲的LAMP特異性電泳圖譜； 圖3為肝片吸蟲的LAMP特異性顯色圖譜； 圖4為大片吸蟲的LAMP特異性顯色圖譜； 圖5為肝片吸蟲的LAMP敏感性顯色圖譜； 圖6為大片吸蟲的LAMP敏感性顯色圖譜； 圖7為肝片吸蟲樣本LAMP檢測的顯色圖譜； 圖8為大片吸蟲樣本LAMP檢測的顯色圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從 商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1試劑盒的組成
試劑盒內(nèi)含DNA裂解液，其中含Nuclei lysis solution、EDTA、蛋白酶K (20mg/ mL)禾Π RNaseAsolution 的混合溶液(4mg/mL) ； LAMP 反應(yīng)液 100 個(gè)反應(yīng)(25yL/個(gè) 反應(yīng))為終濃度200μΜ的dATP、dTTP、dGTP、dCTP,終濃度0.2mM的引物FIP、 BIP> F3、B3, 0.8 μ M 環(huán)引物 Loop F、LoopB, IOyMWbetaine (甜菜堿)，IOmM 的MgSO4的混合溶液；1:10倍SYBR green I顯色液；25眛BstOKiA聚合酶(8U/VL)； 肝片吸蟲DNA陽性對照和大片吸蟲DNA陽性對照。實(shí)施例2試劑盒LAMP試驗(yàn)
用經(jīng)過DNA有效性驗(yàn)證(采用引物JB3和JB4.5對樣本的coxl部分序列進(jìn)行擴(kuò) 增，詳細(xì)步驟參照董世娟等文章《我國片形吸蟲(Fasciola)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞 基基因(coxl)部分序列的多態(tài)性》)的肝片吸蟲和大片吸蟲分離對照樣品DNA各IyL 為模板，按照試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)空白對照和試劑盒陰、陽性對 照。鑒定的操作步驟如下
(1)肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲、尾蚴或蟲卵DNA的提取；(成蟲樣本來自于中 國、美國、西班牙、尼日爾、法國的?；蜓?；尾蚴樣本來自于中國廣西的椎實(shí)螺；蟲卵 樣本來自于中國廣西感染水牛的糞便。)
所述DNA的提取蟲體材料置于1.5mL的離心管中，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次， 移去離心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)釋放基因組DNA，56°C過夜消化15 18h ；消化好的蟲體懸液按 Promega 試劑盒 Wizard SV Genomic DNA purification system 使 用說明提取蟲體DNA，直接使用或于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。尾蚴DNA的提取方法為將宿主螺用滅菌雙蒸水反復(fù)洗5次，用兩個(gè)載玻片將其 壓碎，去掉外面的螺殼，螺肉內(nèi)尾蚴的提取方法參照蟲體的提取方法。蟲卵DNA的提取方法參照Miiller (2007)提純蟲卵的方法并加以改良，取0.1 克陽性糞便于1.5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0.1M的氫氧化鉀的 溶液Iml室溫下作用10 min，其間不斷搖勻。然后IOOOOrpm離心2min，去上清，重復(fù)前 面的步驟清洗兩次。離心去上清后加入1.2 ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，HOOOrpm離 心5min。此時(shí)蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中。分別吸取200μ1上清到另一 個(gè)1.5ml Eppendorf管中，加入1.2 ml雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，保留ΙΟΟμΙ 左右液體，用移液器吹打使沉淀與液體混勻。然后把各管的液體都移到同一管中，離心 管內(nèi)加滿雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，再加入1.2 ml雙蒸水，如此重復(fù)3 5 次。最后離心去上清，保留30μ1液體。在顯微鏡下操作，用移液器從純化的蟲卵中分別吸取1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)蟲卵到含 有30μ1的1.5ml Eppendorf管中，做好標(biāo)記，以檢測蟲卵特異PCR檢測方法的敏感性。加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩Imin后瞬時(shí)離心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm離心lmin，取3μ1上清進(jìn)行下述PCR擴(kuò)增；
(2)采用特異性檢測引物應(yīng)用恒溫加熱器技術(shù)(LAMP)進(jìn)行擴(kuò)增；所述特異性檢測引物如下表1所示 表1
按照擴(kuò)增樣品數(shù)η (η=樣品數(shù)+2)取LAMP反應(yīng)液、5對酶混合于一離心管中，混 勻，分裝；將陽、陰性對照液分別加入一個(gè)分裝管中，取各樣品的DNA加入對應(yīng)反應(yīng)管 中；各反應(yīng)管標(biāo)記后離心混勻，置于恒溫加熱器上反應(yīng)；
步驟(2)所述fe/酶按每個(gè)PCR反應(yīng)含1.25U加入。
表2 LAMP擴(kuò)增體系
LAMP擴(kuò)增條件為肝片吸蟲LAMP檢測為61°C，大片吸蟲LAMP檢測為62°C， 各反應(yīng)45min。(3) PCR產(chǎn)物在2.0%TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結(jié)果，凝 膠成像系統(tǒng)攝像；顯色反應(yīng)也置于凝膠系統(tǒng)成像。試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒能夠從全部肝片吸蟲和大片吸蟲DNA中將兩者準(zhǔn) 確區(qū)分，見附圖1 附圖4所示，附圖1中，附圖1為肝片吸蟲的電泳圖譜，可見只有肝 片吸蟲DNA可擴(kuò)增出特異條帶；附圖2為大片吸蟲的電泳圖譜，可見只有大片吸蟲DNA 可擴(kuò)增出特異條帶；附圖3為肝片吸蟲的顯色圖譜，只有肝片吸蟲DNA擴(kuò)增后可呈現(xiàn)顯 色；附圖4為大片吸蟲的顯色圖譜，只有大片吸蟲DNA擴(kuò)增后可呈現(xiàn)顯色。M,DL2000 marker; 1 6分別為肝片吸蟲成蟲(FhCMl)，大片吸蟲成蟲(FgCMl)，中華分支睪吸蟲，麝貓后睪吸蟲，土耳其斯坦東畢吸蟲和日本血吸蟲，空白對照。實(shí)施例3試劑盒的LAMP敏感性試驗(yàn)
首先將肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲提取DNA后進(jìn)行稀釋，旋渦振蕩混勻，按Eppendorf Biophotometer核酸蛋白測定儀的操作規(guī)程，檢測其總DNA含量。按ICT1 10_6 ng/ μ 1 稀釋DNA，LAMP擴(kuò)增條件同實(shí)施例2，同時(shí)設(shè)空白對照(宿主DNA)。LAMP產(chǎn)物 經(jīng)1:10倍SYBRgreen I顯色液顯色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，以確定其敏感性。試驗(yàn)結(jié) 果表明該LAMP檢測方法敏感性高，最低能檢測到IO-5Iig DNA的肝片吸蟲和大片吸蟲， 見附圖5 附圖6所示，附圖5為肝片吸蟲檢測顯色圖譜，附圖6為大片吸蟲檢測顯色圖 譜。管1 6模板DNA的稀釋濃度依次為ICT1 10_6 ng/ μ 1，管7為陰性對照。實(shí)施例4試劑盒的保存期試驗(yàn)
將在4°C和-20°C保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月的試劑盒對已知樣品進(jìn)行檢 測，擴(kuò)增條件同前述。結(jié)果表明試劑盒可在4°C CS訪酶除外，須-20°C保存)和-20°C 保存長期保存，在試驗(yàn)周期的9個(gè)月內(nèi)，在合適保存條件下陽性樣品均能擴(kuò)增出目的亮 帶和熒光顯色，而陰性對照無目的亮帶和熒光顯色出現(xiàn)。實(shí)施例5試劑盒在不同流行地區(qū)肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲分離株、尾蚴、蟲卵 樣品診斷中的應(yīng)用
1. DNA樣品
肝片吸蟲和大片吸蟲的成蟲分離株、尾蚴、蟲卵樣品來自中國、美國、西班牙、尼 日爾、法國共28個(gè)樣品，70%酒精保存?zhèn)溆谩?. DNA 的提取
蟲體材料置于1.5mL的離心管中，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次，移去離心管中的水， 加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)釋放基因組DNA，56°C過夜消化16h;消化好的蟲體懸液按 Promega 試劑盒 Wizard SV Genomic DNApurification system 使用說明提取蟲體 DNA，直 接使用或于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ豺蔇NA的提取方法為將宿主螺用滅菌雙蒸水反復(fù)洗5次，用兩個(gè)載玻片將其 壓碎，去掉外面的螺殼，螺肉內(nèi)尾蚴的提取方法參照蟲體的提取方法。蟲卵DNA的提取方法參照Miiller (2007)提純蟲卵的方法并加以改良，取0.1 克陽性糞便于1.5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0.1M的氫氧化鉀的 溶液Iml室溫下作用lOmin，其間不斷搖勻。然后IOOOOrpm離心2min，去上清，重復(fù)前 面的步驟清洗兩次。離心去上清后加入1.2 ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，HOOOrpm離 心5min。此時(shí)蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中。分別吸取200μ1上清到另一 個(gè)1.5ml Eppendorf管中，加入1.2 ml雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，保留ΙΟΟμΙ 左右液體，用移液器吹打使沉淀與液體混勻。然后把各管的液體都移到同一管中，離心 管內(nèi)加滿雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，再加入1.2 ml雙蒸水，如此重復(fù)3 5 次。最后離心去上清，保留30μ1液體。在顯微鏡下操作，用移液器從純化的蟲卵中分別吸取1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)蟲卵到含 有30μ1的1.5ml Eppendorf管中，做好標(biāo)記，以檢測蟲卵特異PCR檢測方法的敏感性。加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩Imin后瞬時(shí)離心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm離心lmin，取3μ1上清PCR擴(kuò)增。
3. LAMP 擴(kuò)增
取經(jīng)過DNA有效性驗(yàn)證的肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲分離株、尾蚴、蟲卵樣品DNA 各IyL為模板以及陰性、陽性對照樣本各1 μ L，按照試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP反 應(yīng)，方法同實(shí)施例2。4.瓊脂糖電泳分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖7 附圖8所示，附圖7表示肝片吸蟲樣本LAMP檢測的顯色圖 譜，其中管1 6分別代表分離株FhCMl (尼日爾)，F(xiàn)hFG5 (法國)，F(xiàn)hAMl (美 國)，F(xiàn)hGSG17 (中國)，F(xiàn)hOS (西班牙)，F(xiàn)hHS (西班牙)，管7表示陰性對照。 附圖8表示大片吸蟲樣本LAMP檢測的顯色圖譜，其中管1 9分別代表FgCAYl (尼日 爾)，F(xiàn)gGXB2 (中國)，F(xiàn)gGZB3 (中國)，F(xiàn)gGXBeggl (中國，蟲卵)，F(xiàn)gGXBegg2 (中國，蟲卵)，F(xiàn)gGXBegg3 (中國，蟲卵)，F(xiàn)gGXS-I (中國，尾蚴)，F(xiàn)gGXS-2 (中國，尾蚴)，管10表示陰性對照。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，所有經(jīng)形態(tài)學(xué)和特異PCR鑒定 過的肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲分離株、尾蚴、蟲卵都能準(zhǔn)確、快速被鑒定和區(qū)分，證明 了所建立的LAMP方法能有效區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲，還可用于片形吸蟲病的快速檢 測研究。
權(quán)利要求
1.一種快速區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲樣本、尾蚴或蟲卵DNA的提??；(2)采用特異性檢測引物應(yīng)用恒溫加熱器技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增；所述特異性檢測引物的序 列分別如SEQ IDNO 1 SEQ IDNO 12所示；(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察；或者將產(chǎn)物經(jīng)SYBR green I顯色液顯色后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速區(qū)分肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法，其特征在于 步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增條件為肝片吸蟲LAMP檢測溫度為61°C，大片吸蟲LAMP 檢測溫度為62°C，分別反應(yīng)45分鐘。
3.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法的LAMP試劑盒，其特征在于包括以下組分(1)DNA 裂解液Nuclei lysis solution、EDTA、蛋白酶 K 和 RNase A solution 的混 合溶液；(2)LAMP 反應(yīng)液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、betaine、引物 FIP、BIP> F3、 B3、環(huán)引物L(fēng)oop F、LoopB和MgSO4的混合溶液；(3 ) SYBR green I顯色液1 10倍稀釋液；(4)肝片吸蟲DNA陽性對照和大片吸蟲DNA陽性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LAMP試劑盒，其特征在于還含有大片段聚合酶組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的LAMP試劑盒，其特征在于包括以下組分(1)DNA 裂解液，27.5mL:為 100 個(gè)反應(yīng)的 200 μ L Nuclei lysis solution、50 μ L pH 8.0 的 0.5M 的 EDTA、20 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)禾口 5 μ L RNase A solution (4mg/mL) 的混合溶液；(2)LAMP 反應(yīng)液，2.5mL:為終濃度 200μΜ 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP, 終濃度 0.2mM 的引物 FIP、BIP> F3, B3, O.8 μ M 環(huán)引物 Loop F、LoopB, 10 μ M 的 betaine, IOmM的MgSO4的混合溶液；(3 ) SYBR green I顯色液1 10倍稀釋液；(4)肝片吸蟲和大片吸蟲DNA陽性對照ΙΟΟμ 和其他吸蟲DNA陽性對照ΙΟΟμ ；(5)S^1DNA 聚合酶，8U/VL，25μ 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒別和檢測肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法和試劑盒。本發(fā)明采用具有SEQIDNO1～SEQIDNO12所示序列的特異性引物分別對肝片吸蟲和大片吸蟲的待測模板DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或者SYBRgreenI顯色，并在紫外光下實(shí)現(xiàn)觀察和鑒別。本發(fā)明建立了用于肝片吸蟲和大片吸蟲鑒別的快速、特異、敏感的LAMP方法，可準(zhǔn)確地鑒定肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲、尾蚴、蟲卵。本發(fā)明的試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客觀，可用于肝片吸蟲和大片吸蟲的快速鑒別。
文檔編號C12Q1/68GK102021246SQ20101057023
公開日2011年4月20日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者宋慧群, 朱興全, 李娟 , 李海龍, 李淳, 林瑞慶, 艾琳, 袁子國, 陳木新 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)