羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，由無(wú)菌去離子水、熒光定量PCR檢測(cè)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品組成，熒光定量PCR檢測(cè)試劑由SYBRGreenReal-timePCRMasterMix、ddH2O、檢測(cè)用引物組成。本發(fā)明試劑盒檢測(cè)耗時(shí)短，可運(yùn)用于快速診斷，提高工作效率，能夠運(yùn)用于大規(guī)模檢測(cè)。熒光定量PCR檢測(cè)方法重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰，比普通PCR更加靈敏便捷，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確率，并且無(wú)需電泳，節(jié)省時(shí)間，可在檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，可以快速檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)感染。
【背景技術(shù)】
[0002]肝片吸蟲(chóng)病是由肝片吸蟲(chóng)(Fasc1la hepatica)寄生于動(dòng)物肝臟膽管中的一種人畜共患蠕蟲(chóng)病。此病呈世界性分布，常呈地方性流行，是我國(guó)分布最廣泛，危害最嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病之一。肝片吸蟲(chóng)病可以引起人和動(dòng)物的急性或慢性肝炎和膽管炎，并伴發(fā)全身性中毒現(xiàn)象，后期，終因惡病質(zhì)而死亡。患畜食欲不振，營(yíng)養(yǎng)不良，漸進(jìn)性消瘦，生產(chǎn)力下降，病肝成為廢棄物，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。人感染后食欲下降、嘔吐、腹瀉、消瘦、無(wú)力、氣喘、貧血，有時(shí)顫抖、出汗等?；疾?dòng)物是主要傳染源，羊是最重要的終末宿主，也是主要傳染源。調(diào)查顯示，云南部分地區(qū)山羊、黃牛、水牛的感染率分別為25%、100%和80%，川西北牦牛和藏羊的感染率分別為23%和11%，四川綿陽(yáng)市奶牛的感染率為17.8%，湖南牛肉感染率為 2.35%。
[0003]目前通用的檢測(cè)方法是糞便反復(fù)水洗沉淀法或尼龍篩兜集卵法后于顯微鏡下觀察，該方法簡(jiǎn)便易行，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感性較低，容易誤判，ELISA方法容易造成假陽(yáng)性和假陰性，而IHA法則操作繁瑣，而且需要相應(yīng)的設(shè)備與試劑，也不利于基層地區(qū)推廣應(yīng)用。因此，急需研究一種結(jié)果可信、簡(jiǎn)便快捷的診斷方法。熒光定量PCR檢測(cè)方法反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng) 、結(jié)果清晰，比普通PCR更加靈敏便捷，并且無(wú)需電泳，節(jié)省時(shí)間。應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)能夠達(dá)到高通量、高效率的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，試劑盒由無(wú)菌去離子水、熒光定量PCR檢測(cè)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品。
其中，熒光定量PCR檢測(cè)試劑由SYBRGreen Real-time PCR Master Mix、ddH20、檢測(cè)用引物組成。
[0005]其中檢測(cè)用引物為檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)的上游引物和下游引物共2條:
羊肝片吸蟲(chóng)上游引物(SEQ ID No:1):5’ -CAAAGTGACAGTGACGGAAC-3’，
羊肝片吸蟲(chóng)下游引物(SEQ ID No:2):5’ - CGTGGTTTAATAATCGGG-3’ ；
標(biāo)準(zhǔn)品為具有羊肝片吸蟲(chóng)hepatica)的重組質(zhì)粒,其核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示。
[0006]對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照為有羊肝片吸蟲(chóng)DNA片段的DNA樣品，陰性對(duì)照為無(wú)羊肝片吸蟲(chóng)DNA的DNA樣品。
[0007]本試劑與試劑盒保存于-20 V，盡量減少反復(fù)凍融。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的試劑盒在檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)這種食源性寄生蟲(chóng)中的應(yīng)用。[0009]本發(fā)明試劑盒使用方法:
每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品依次用無(wú)菌去離子水稀釋為12.6ng/μ 1,1.26 ng/μ 1,1.26Χ10-1 ng/μ 1、1.26X 10_2ng/μ 1、1.26Χ10_3 ng/μ 1、1.26Χ 10_4 ng/μ I。
[0010]1.熒光定量PCR檢測(cè)試劑的制備:總體積為24 μ I。SYBR Green Real-time PCRMaster Mix在冰上融化，在無(wú)菌操作臺(tái)中依次加入SYBR Green Real-time PCR Master Mix12.5 μ UddH2O 10.5 μ 1、上下引物各0.5 μ 1，充分混勻，避光保存于-20°C，操作中避免直射光照射。
[0011]2.熒光定量PCR反應(yīng)管的制備:總體積為25 μ I。熒光定量PCR檢測(cè)試劑于冰上融化。在無(wú)菌操作臺(tái)中依次取熒光定量PCR檢測(cè)試劑24 μ 1，加入樣本DNA (待檢測(cè)樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品)I μ I于PCR反應(yīng)管中充分混合，每個(gè)樣本均進(jìn)行三次重復(fù)。操作中避免直射光照射。
[0012]2.擴(kuò)增檢測(cè):把熒光定量PCR反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀上，設(shè)置反應(yīng)條件為:holding stage:95 °C Imin ；Cycling stage:95°C 1sec, 57°C 15sec, 72°C 35sec,共 40 個(gè)循環(huán)；Melt curve stage:95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
[0013]3.檢測(cè)結(jié)果判定:當(dāng)樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)則判為陽(yáng)性，當(dāng)樣本未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)則判為陰性。
[0014]本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)技術(shù)能夠非常快速的檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)的感染，特異性和靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他檢測(cè)技術(shù)，并且檢測(cè)耗時(shí)短，可運(yùn)用于快速診斷，提高了工作效率，能夠運(yùn)用于大規(guī)模檢測(cè)。熒光定量PCR檢測(cè)方法重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰，比普通PCR更加靈敏便捷，并且無(wú)需電泳，節(jié)省時(shí)間。應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)能夠達(dá)到高通量、高效率的目的。本方法是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的一種敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，大大提高了檢測(cè)準(zhǔn)確率，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。
[0016]圖2是羊肝片吸蟲(chóng)陽(yáng)性樣本的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。
[0017]圖3是應(yīng)用本試劑盒對(duì)采集的部分標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果a。
[0018]圖4是應(yīng)用本試劑盒對(duì)采集的部分標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果b。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0020]實(shí)施例一
本發(fā)明提供一種羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由無(wú)菌去離子水、熒光定量PCR檢測(cè)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品組成。
其中，熒光定量PCR檢測(cè)試劑含有SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ddH20、檢測(cè)用引物。
[0021]其中檢測(cè)用引物為檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)的上游引物和下游引物共2條(表1):
【權(quán)利要求】
1.一種羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，試劑盒由無(wú)菌去離子水、熒光定量PCR檢測(cè)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品組成，其中熒光定量PCR檢測(cè)試劑由SYBR GreenReal-time PCR Master Mix、ddH20、檢測(cè)用引物組成,所述檢測(cè)用引物分別為: 羊肝片吸蟲(chóng)上游引物:5’ -CAAAGTGACAGTGACGGAAC-3’， 羊肝片吸蟲(chóng)下游引物:5’-CGTGGTTTAATAATCGGG-3’ ； 標(biāo)準(zhǔn)品為羊肝片吸蟲(chóng)hepatica)的重組質(zhì)粒,其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照為有羊肝片吸蟲(chóng)DNA片段的DNA樣品，陰性對(duì)照為無(wú)羊肝片吸蟲(chóng)DNA的DNA樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羊肝片吸蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，試劑盒保存于-20 °C，盡量減少反復(fù)凍融。
3.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的試劑盒在檢測(cè)羊肝片吸蟲(chóng)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104032015SQ201410267699
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】杜愛(ài)芳, 李閔薇, 陳海衛(wèi), 郭筱璐 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)