專利名稱：一株小球藻及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一株小球藻及其應(yīng)用，具體涉及該小球藻在生物能源和污水凈化應(yīng) 用領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
能源危機與水資源危機是當(dāng)前國際上面臨的兩大危機。據(jù)有關(guān)報道，全球礦物化 石能源儲量石油1500億噸，可使用年限為41年；煤炭5500億噸，可使用年限為200年； 天然氣1100億噸，可使用年限為60年。社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展和人口的不斷增加，有限的淡 水資源已受到嚴重污染和破壞，全球正面臨著水資源緊缺的嚴峻危機。因此，開發(fā)新型可再 生的生物能源(生物柴油)和污水生物深度處理新技術(shù)是應(yīng)對日益嚴重的能源危機和水資 源危機的有力措施，也是人類可持續(xù)發(fā)展的必由之路。利用微藻制備生物柴油已成為當(dāng)前國內(nèi)外的研究熱點，尤其利用污水培養(yǎng)微藻， 在凈化污水的同時制備生物柴油是該研究領(lǐng)域的前沿課題。微藻具有生長快、收獲期短、富 含油脂、光合利用效率高等特點(每年固定的(X)2大約占全球凈光合產(chǎn)量的40% )，是目前 可替代化石能源的主要原材料。微藻生長過程中會吸收利用大量氮磷元素，因此可利用污 水處理廠的后處理單元培養(yǎng)微藻進行脫氮除磷深度凈化污水。目前，國內(nèi)開展關(guān)于污水培養(yǎng)微藻制備生物柴油的相關(guān)技術(shù)研究報道較少，能否 獲得適宜污水培養(yǎng)并富含油脂較高，易于轉(zhuǎn)化制備生物柴油的微藻藻株是關(guān)鍵。從已有的 報道來看，所利用的藻株普遍存在培養(yǎng)條件要求高、生物產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量低、生物柴油轉(zhuǎn)化 不穩(wěn)定等問題難以實現(xiàn)應(yīng)用。因此，篩選優(yōu)良的藻種對于解決上述問題具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株小球藻及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的小球藻(Chlorella sp.)，命名為H，分離自北京清河的水樣，已 于2010年11月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，菌種保藏號為CGMCC No. 4305。小球藻H 在4°C -37°C (優(yōu)選10°C -35°C，最優(yōu)選)的培養(yǎng)溫度及pH6_9 (優(yōu)選pH7)的范圍下均 能生長。小球藻(Chlorellasp. ) YL-2CGMCC No. 4305 簡稱小球藻 YL-2。本發(fā)明還保護一種用于培養(yǎng)小球藻(Chlorella sp. HL-2的種子培養(yǎng)基，是 將如下溶質(zhì)用水定容至1升得到的1ml A5+Co溶液、2g淀粉、1.5g蛋白胨、1.5g NaN03> 0. (MgK2HPO4 · 3Η20、0· 075gMgS04 · 7Η20、0· 036gCaCl2 · 2Η20、0· 006g 檸檬酸、0· 006g 檸檬酸 鐵胺、0. OOlg Na2 · EDTA和0. 02g Na2CO3 ；所述A5+Co溶液是將如下溶質(zhì)用水定容至1升得 到的2. 86g/L H3BO3U. 81g/L MnCl 2 · H20,0. 222g/L ZnSO4 · 7Η20、0· 079g/LCuS04 · 5H20、 0. 390g/L Na2MoO4 · 2H20、0. 049g/L Co(NO3)2 · 6H20。本發(fā)明還保護一種制備小球藻(Chlorella sp.)YL-2種子液的方法，是在所述種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCC No. 4305，得到種子液。培養(yǎng)小球藻(Chlorella sp. ) YL-2CGMCC No. 4305的溫度條件具體可為 4°C-37°C，優(yōu)選 10°C-35°C，最優(yōu)選^°C。培養(yǎng)小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCC No. 4305 的PH條件具體可為PH4-9，優(yōu)選pH6-9，最優(yōu)選pH7。小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCC No. 4305可用于污水處理。所述污水處理具 體可為污水除氮和/或污水除磷。小球藻(Chlorella sp. )YL-2CGMCC No. 4305可用于制備生物柴油(脂肪酸甲 酯)。本發(fā)明還保護一種制備生物柴油的方法，是以小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCCNO. 4305中提取的油脂作為原料，制備生物柴油。小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCCNO. 4305在進行所述提取前，可先在污水中進行培養(yǎng)。具體可將所述種子液接種 入所述污水中進行培養(yǎng)。小球藻YL-2在污水中生長良好，同時可以高效去除污水中的氮磷。小球藻YL-2 自身富含油脂高，可以用于制備生物柴油。綜上所述，小球藻YL-2在利用污水培養(yǎng)與生物 柴油轉(zhuǎn)化體系中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為基于18S rDNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2為小球藻H在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長情況。圖3為添加各種碳源對小球藻H生長的影響。圖4為添加各種氮源對小球藻H生長的影響。圖5為各種pH條件對小球藻H生長的影響。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。 實施例1、小球藻H的分離鑒定一、樣品采集2010年7月從北京清河采集含有綠藻的水樣。二、小球藻H的分離和篩選分離步驟將采集的水樣轉(zhuǎn)接于經(jīng)高壓滅菌(121°C，高壓蒸汽滅菌20分鐘)的生 活污水(取自某城市生活污水處理廠)，置于光照培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)。進行三輪富集培養(yǎng)之 后，適當(dāng)稀釋藻液與污水瓊脂半固體培養(yǎng)基混勻后光照培養(yǎng)，挑單藻落于小試管中擴大培養(yǎng)。篩選步驟首先將純藻株接種于48孔酶標(biāo)板(每孔含有無菌污水0. 25mL)，放置 光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，以540nm檢測生長情況，挑選生長較快的藻株，并測定其在污水培 養(yǎng)條件下油脂含量。
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在污水中液體培養(yǎng)的參數(shù) 士 1 °C ； 1000 12001UX光照強度；光暗比 14h IOh;每天定時振蕩O次)，避免細胞沉淀；培養(yǎng)7天。得到一株在污水中生長較快、富含油脂的純藻株，命名為1-2。三、小球藻1-2的鑒定1、小球藻H的形態(tài)鑒定細胞形態(tài)呈圓形或橢球形，細胞直徑3-6 μ m,單獨存在，細胞中間有一個明顯的載 色體，淡綠色。2、小球藻1-2的分子鑒定收集指數(shù)生長期的細胞，用植物基因組DNA提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù) 有限公司)提取基因組DNA，以其為模板擴增18S rDNA基因片段。PCR擴增體系為25 μ L，其 中含有 12.5yL PCR 2Xmix(TianGen)、正反向引物(ΙΟμπιοΙ/L)各 1 μ L、模板 DNA 1 μ L、 雙蒸滅菌水9. 5 μ L0 PCR擴增程序為95°C預(yù)變性3min ；94°C變性lmin，55°C復(fù)性Imin, 72°C延伸1.5min，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0用于擴增18S rDNA的引物為通用引物，序列如下正向引物(18SF)5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3‘；反向引物(I8SR)5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3‘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒回收，交由上海生工 生物技術(shù)有限公司測序。PCR擴增產(chǎn)物為18s rDNA部分序列，共1742bp，測序結(jié)果如序列 表的序列1所示。測序結(jié)果經(jīng)NCBI 網(wǎng)站 BLAST 比對分析，YL-2 與 Chlorella vulgaris (FM205855) 的Query coverage值達到100%，Max ident為99. 9%。用MEGA 4. 0軟件進行多序列同 源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1，分枝上的數(shù)值為自舉1000次的結(jié)果)。藻YL-2與 Chlorella vulgaris很好地聚在一個分支?；谛螒B(tài)鑒定和分子鑒定的結(jié)果，將H鑒定為小球藻(Chlorella sp.)。將小 球藻(Chlorella sp. HL-2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 號為 No. 4305。實施例2、小球藻H種子培養(yǎng)基的確定一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇利用污水大規(guī)模培養(yǎng)微藻需要一定量的優(yōu)良種子，因此考察培養(yǎng)小球藻通常采用 的培養(yǎng)基(BG11培養(yǎng)基、SE培養(yǎng)基、水生6號培養(yǎng)基及f/2培養(yǎng)基)對藻株1-2生長的影 響。1、培養(yǎng)基的制備(I)BGll 培養(yǎng)基制備BGl 1 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)。BGll 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)由 NaNO3> K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaCl2 · 2Η20、檸檬酸 (citricacid)、檸檬酸鐵胺(Ferric ammonium citrate)、Na2 · EDTA, Na2C03、A5+Co 溶液和 蒸餾水組成；每升培養(yǎng)基中，含有Iml A5+Co溶液、1. 5g NaNO3>0. 04g K2HPO4 · 3Η20、0· 075g MgSO4 · 7Η20、0· 036g CaCl2 · 2Η20、0· 006g 檸檬酸、0. 006g 檸檬酸鐵胺、0. OOlgNa2 · EDTA 和 0. 02g 琴03。
A5+Co溶液由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其濃度為2. 86g/L Η3Β03、1. 81g/L MnCl2 ·Η20、0· 222g/L ZnSO4 · 7Η20、0· 079g/L CuSO4 · 5Η20、0· 390g/L Na2MoO4 · 2Η20,0. 049g/ LCo (NO3) 2 · 6Η20。(2) SE 培養(yǎng)基制備SE 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)。SE 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)由 NaN03、K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaCl2 · 2H20、KH2PO4, NaCl, FeCl3 · 6H20、 ^-EDTA、土壤提取液、A5溶液和蒸餾水組成；每升SE培養(yǎng)基中，含有 Iml Fe-EDTA、40ml 土壤提取液、Iml A5 溶液、0. 25g NaN03、0. 075g K2HPO4 · 3H20、0. 075g MgSO4 · 7Η20、0· 025g CaCl2 · 2Η20、0· 175g ΚΗ2Ρ04、0· 025g NaCl、0· 005gFeCl3 · 6H20。土壤提取液的制備方法取0. 5kg未施過肥的花園土，置于三角瓶(或燒杯)中， 加入IOOOml蒸餾水，用透氣塞封瓶口，在水浴中沸水加熱2小時，冷卻數(shù)小時，在無菌條件 下過濾，取上清液加入滅菌蒸餾水至總體積IOOOml ；4°C保存?zhèn)溆?。A5溶液由溶質(zhì)和水組成；溶質(zhì)及其濃度為H3B032. 86g/L，MnCl2 · 4H20 1. 81g/L， ZnSO4 · 7H20 0. 22g/L, CuSO4 · 5H20 0. 009g/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 004g/L。Fe-EDTA 的制備方法將 Ig Na2 · EDTA 溶于 50ml 蒸餾水；將 8Img FeCl3 · 6H20 溶 于50ml 0. IM的HCl水溶液；將以上兩個溶液混合。(3)水生6號培養(yǎng)基制備水生6號培養(yǎng)基(pH7. 0)。SE 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)由 NH2C0NH2、MgSO4 · 7H20、NaHCO3> KCl, FeSO4, CaCl2、土壤提 取液和蒸餾水組成；每升培養(yǎng)基中，含有0.5ml 土壤提取液、0. 133g/L NH2CONH2^O. Ig/ LMgSO4 · 7Η20、0· lg/L NaHCO3>0. 033g/L KC1、0. 2g/L FeS04、0. 03g/L CaCl20土壤提取液的制備方法同步驟2。(4) f/2 培養(yǎng)基制備f/2 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)。f/2 培養(yǎng)基(ρΗ7· 0)由 NaHCO3、NaCl、KH2PO4, KNO3> NH2CONH2, MgSO4 · 7H20、f/2 微 量元素溶液、f/2維生素溶液和蒸餾水組成；每升培養(yǎng)基中，含有Iml f/2微量元素溶液、 Iml f/2 維生素溶液、12g NaHCO3Ug NaCl、0.02g KH2PO4、0. Ig ΚΝ03、0· 03gNH2C0NH2、0. 02g MgSO4 · 7H20。 f/2 微量元素溶液的制備方法:將 ZnSO4 · 4H20 0. 023g、MnCl2 · 4H20 0. 078g、 CuSO4 · 5H20 0. 010g、FeC6H5O7 · 5H20 0. 0039g、Na2MoO4 · 2H20 0. 0073g、CoCl2 · 6H200. 012g、 Na2 · EDTA 0. 00435g溶于去離子水，并用去離子水定容至1000ml。f/2維生素溶液的制備方法將維生素B120. 0005g，維生素BIO. Ig溶于去離子水， 并用去離子水定容至1000ml。2、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇將小球藻H分別接種至BGll培養(yǎng)基、SE培養(yǎng)基、水生6號培養(yǎng)基或f/2培養(yǎng) 基(將OD54tlnm值為0. 5的小球藻H以20%的體積比接種于各個培養(yǎng)基中，小球藻H 在培養(yǎng)基中的OD54tlnm值均為0. 15左右)，培養(yǎng)8天。檢測各個培養(yǎng)液的OD54tlnm值，結(jié)果見圖2。小球藻H在四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長 差異較大，采用BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)時生長最快，培養(yǎng)8天時得到了較大的生物量(OD54tlnm達1. 13)，而在f/2培養(yǎng)基中生長最差。因此，BGll培養(yǎng)基是較為適宜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。二、小球藻H種子培養(yǎng)基的確定為使小球藻1-2更快更好的生長，在BGll培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進行氮源、碳源的優(yōu)化。在BGll培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加不同碳源，各個碳源在培養(yǎng)基中的濃度均為2g。將小球 藻1-2分別接種至各培養(yǎng)基(將OD54tlnm值為0.5的小球藻1-2以20%的體積比接種于各 個培養(yǎng)基中，小球藻H在培養(yǎng)基中的OD54tlnm值均為0. 15左右)，培養(yǎng)8天。檢測各 個培養(yǎng)液的OD54tlnm值，結(jié)果見圖3。在BGll培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加不同氮源，各個氮源在培養(yǎng)基中的濃度均為1. 5g。將小 球藻1-2分別接種至各培養(yǎng)基(將OD54tlnm值為0.5的小球藻1-2以20%的體積比接種于 各個培養(yǎng)基中，小球藻H在培養(yǎng)基中的OD54tlnm值均為0. 15左右)，培養(yǎng)8天。檢測 各個培養(yǎng)液的OD54tlnm值，結(jié)果見圖4。將BGll培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為不同的起始pH，將小球藻YL-2分別接種至各培養(yǎng)基(將 OD540nm值為0. 5的小球藻H以20 %的體積比接種于各個培養(yǎng)基中，小球藻H在培養(yǎng)基 中的OD54tlnm值均為0. 15左右)，培養(yǎng)8天。檢測各個培養(yǎng)液的OD54tlnm值，結(jié)果見圖5。
結(jié)果表明，最佳碳源為淀粉，最佳氮源為蛋白胨，最佳pH為7. 0 (pH6-9的范圍下均 能生長)。根據(jù)氮源、碳源的優(yōu)化結(jié)果，確定種子培養(yǎng)基的配方，制備種子培養(yǎng)基(pH7. 0)。種子培養(yǎng)基是將如下溶質(zhì)用水定容至1升得到的加入Iml A5+Co溶液、2g淀粉、 1.5g 蛋白胨、1.5g NaN03、0.04g K2HPO4 · 3H20、0. 075g MgSO4 · 7Η20、0· 036g CaCl2 · 2H20、 0. 006g 檸檬酸、0. 006g 檸檬酸鐵胺、0. OOlg Na2 · EDTA 和 0. 02g Na2CO30A5+Co溶液是將如下溶質(zhì)用水定容至1升得到的2. 86g/L Η3Β03、1. 81g/ LMnCl2 ·Η20、0· 222g/L ZnSO4 ·7Η20、0· 079g/L CuSO4 ·5Η20、0· 390g/L Na2MoO4 ·2Η20、0· 049g/ L Co (NO3) 2 · 6Η20。實施例3、小球藻H的生長情況原污水取自某城市生活污水處理廠，經(jīng)過沉淀，不滅菌，水質(zhì)條件見表1。表1原污水水質(zhì)情況
權(quán)利要求
1.小球藻(Chlorellasp.) YL-2，其保藏編號為 CGMCC No. 4305。
2.用于培養(yǎng)小球藻(Chlorellasp. 的種子培養(yǎng)基，是將如下溶質(zhì)用水定容至1 升得到的:1ml A5+Co 溶液、2g 淀粉、1. 5g 蛋白胨、1. 5g NaNO3> 0. 04g K2HPO4 · 3Η20、0· 075g MgSO4 · 7Η20、0· 036g CaCl2 · 2Η20、0· 006g 檸檬酸、0. 006g 檸檬酸鐵胺、0. OOlgNa2 · EDTA 和 0. 02g Na2CO3 ；所述A5+Co溶液是將如下溶質(zhì)用水定容至1升得到的2. 86g/L Η3Β03、1. 81g/ LMnCl2 ·Η20、0· 222g/L ZnSO4 ·7Η20、0· 079g/L CuSO4 ·5Η20、0· 390g/L Na2MoO4 ·2Η20、0· 049g/ L Co (NO3) 2 · 6Η20。
3.一種制備小球藻(Chlorella sp. HL_2種子液的方法，是在權(quán)利要求2所述種子培 養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCC No. 4305，得到種子液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)小球藻(Chlorellasp.) YL-2CGMCC No. 4305的溫度條件為4°C _37°C，優(yōu)選10°C _35°C，最優(yōu)選所述培養(yǎng)小球 藻(Chlorella sp) YL-2CGMCC No. 4305 的 pH 條件為 pH4_9，優(yōu)選 pH6_9，最優(yōu)選 pH7。
5.小球藻(Chlorellasp) YL-2CGMCC No. 4305在污水處理中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述污水處理為污水除氮和/或污水除磷。
7.小球藻(Chlorellasp)HCGMCC No. 4305在制備生物柴油中的應(yīng)用。
8.一種制備生物柴油的方法，是以小球藻(Chlorella sp.) YL-2CGMCC No. 4305中提取 的油脂作為原料，制備生物柴油。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于小球藻(Chlorellasp.) YL-2CGMCCNo. 4305 在進行所述提取前，先在污水中進行培養(yǎng)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)為將權(quán)利要求3或4所述種子液 接種入所述污水中進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株小球藻及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的小球藻為小球藻(Chlorellasp.)YL-2，其保藏編號為CGMCC No.4305。小球藻YL-2在污水中生長良好，同時可以高效去除污水中的氮磷。小球藻YL-2自身富含油脂高，可以用于制備生物柴油。綜上所述，小球藻YL-2在利用污水培養(yǎng)與生物柴油轉(zhuǎn)化體系中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P7/64GK102093955SQ20101057252
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者李信, 王海勝, 聶新峰, 閆艷春, 黃三福 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 福建漳州鼎能生物科技有限公司, 黃三福