專利名稱：一種適用于轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因牛的快速簡(jiǎn)便檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因牛 的轉(zhuǎn)基因成分的快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物的安全評(píng)價(jià)是轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品市場(chǎng)化和商品化的前提，在安全評(píng) 價(jià)中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)是一項(xiàng)重要內(nèi)容，建立轉(zhuǎn)基因生物快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法為安 全評(píng)價(jià)和管理奠定基礎(chǔ)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的李寧教授已經(jīng)成功培育出了一批轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因奶牛， 數(shù)量達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。這標(biāo)志著我國(guó)轉(zhuǎn)基因奶牛新品種培育和動(dòng)物生物反應(yīng)器技術(shù)達(dá)到 了國(guó)際先進(jìn)水平，鑒于轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因奶牛生產(chǎn)技術(shù)的成熟以及其產(chǎn)品市場(chǎng)化的趨 勢(shì)，建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)人α-乳清蛋白的方法，有很重要的必要性和緊迫性。目前對(duì)于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)可從外源基因的核酸和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平進(jìn)行，核酸水 平的檢測(cè)應(yīng)用更為廣泛。核酸水平的檢測(cè)，主要針對(duì)轉(zhuǎn)入的外源基因的核苷酸序列并根據(jù) 外源基因與內(nèi)源基因的同源性設(shè)計(jì)檢測(cè)方法，主要采用的方法是PCR擴(kuò)增，即依據(jù)轉(zhuǎn)入外 源基因的啟動(dòng)子、目的基因、終止子及表達(dá)(重組)載體信息，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，依據(jù)產(chǎn)物的有無(wú)或多少判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品?？梢愿鶕?jù)檢測(cè)目的不同，將檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的PCR技術(shù)分為兩類定性PCR和定量PCR。定性PCR主要是在PCR擴(kuò) 增之后，通過(guò)電泳初步鑒定結(jié)果為陽(yáng)性或者陰性，PCR反應(yīng)具有高靈敏度、高特異性、高效性 的特點(diǎn)，是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品初篩階段的主要檢測(cè)方法。定性PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上根據(jù)研究需 要還發(fā)展了多重PCR、巢式PCR、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR和電化學(xué)發(fā)光PCR等。定量PCR可以對(duì) 檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)量和拷貝數(shù)進(jìn)行量化檢測(cè)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測(cè)中 根據(jù)不同需要和檢測(cè)目的來(lái)選擇進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。在進(jìn)行外源基因核酸水平檢測(cè)中通常需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)兩個(gè)環(huán)節(jié)，必 須擁有PCR儀和電泳儀等設(shè)備，要求在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種適用于轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白基因 牛的快速簡(jiǎn)便檢測(cè)方法，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法原理建立外源基因的快速檢測(cè)方法，能準(zhǔn) 確快速檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因牛中人α-乳清蛋白基因。本發(fā)明不需要特殊設(shè)備，為基層檢測(cè)人員 提供一種快速簡(jiǎn)便的方法，本發(fā)明的方法同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)和管理提 供借鑒。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下(1)引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)人α-乳清蛋白的基因序列(Gene Bank accession NC_000012)設(shè)計(jì)特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP :5’ -TTGAACCGAGGAGGCGGAGGCCAGACTGGAGTGCAATGG-3，(序列表 SEQ ID NO:1)；BIP :5’ -GTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTTAGCCAGGCATGGTGGT-3，(序列表 SEQ ID NO: 2)；F3 5' -GGTGGAGTTTCGCTCTTGTT-3，(序列表 SEQ ID NO 3)；B3 :5，-ACATGGTGAAACCCTGTCTC-3，(序列表 SEQ ID NO 4)。(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)以FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物對(duì)人α-乳清蛋白DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。反 應(yīng)體系為1Μ甜菜堿，400μΜ dNTPs,2. 5μ 1 IOXBst Buffer,Mg2+2mM,8U Bst DNA聚合酶， 1 μ 1模板，外引物F3和Β3各0. 2 μ Μ，內(nèi)引物FIP和BIP各1. 6 μ Μ，補(bǔ)ddH20至25 μ 1，將上 述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ IEP管中，95°C 5min，立即冰浴l-2min，加入8U Bst DNA聚合酶，于60°C下反應(yīng)60min，然后置于80°C下5min終止反應(yīng)；(3)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物分析1)瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μ 1上樣緩沖液(40%甘油，0. 2% 溴酚藍(lán)，59.8% 0. 25MTris-Hcl)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，得到凝膠成像， 觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則判定為含有人α-乳清蛋白基因(即含有轉(zhuǎn)基 因成分)，若沒(méi)有階梯型條帶則判定為不含人α-乳清蛋白基因。2)熒光染料染色將STOR Green I熒光染料稀釋100倍(體積)后作為工作液， 取5μ 1的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加0. 5 μ ISTOR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察 結(jié)果。若加入STOR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定為含有人α -乳清蛋 白基因，若加入STOR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕色則判定為不含人α-乳清蛋白基 因。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異引物成功建立了對(duì)人α-乳清蛋白快速、靈敏、特異而 又簡(jiǎn)單實(shí)用的檢測(cè)方法。與其它傳統(tǒng)PCR方法相比該發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明經(jīng)濟(jì)實(shí)用反應(yīng)是在恒溫的條件下進(jìn)行，所以不需要昂貴的PCR儀，只需 要一臺(tái)可以提供恒溫的設(shè)備，例如水浴鍋即可。2.本發(fā)明的靈敏度高采用本方法可以檢測(cè)下限至10個(gè)拷貝的人α-乳清蛋白 目的基因，比普通的PCR的靈敏度高100倍。3.本發(fā)明的特異性強(qiáng)本發(fā)明采用4條引物，可識(shí)別6個(gè)特異性區(qū)域，增加了與目 的基因結(jié)合的特異性。4.本發(fā)明的檢出率高對(duì)14頭轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行檢測(cè)，均檢測(cè)出 轉(zhuǎn)基因成分，檢出率為100%。5.本發(fā)明檢測(cè)簡(jiǎn)單直接肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)STOR Green I染色后的顏色變化 來(lái)定性判斷靶序列擴(kuò)增與否。


序列表SEQ ID NO 1_4是本發(fā)明設(shè)計(jì)的擴(kuò)增人α _乳清蛋白基因特異片段的引物 序列。序列表SEQ ID NO :5是本發(fā)明擴(kuò)增的人α _乳清蛋白基因的特異片段。片段全長(zhǎng) 為 184bp。
序列表SEQ ID NO 6是報(bào)道的人α -乳清蛋白基因序列。序列全長(zhǎng)為236;3bp。圖1 是本發(fā)明擴(kuò)增的人α -乳清蛋白基因的特異片段(該序列與SEQ ID NO 5 的序列是同一條序列)，片段全長(zhǎng)為184bp，序列下劃線部分為引物所處位置，序列中方框 所示位置為限制性內(nèi)切酶AIuI所識(shí)別的酶切位點(diǎn)。圖2 :PCR擴(kuò)增人α -乳清蛋白基因電泳圖，圖中:M :DL2000DNA marker ； 1-5 模板 為人基因組DNA ；6 模板為?；蚪MDNA。圖3 =LAMP擴(kuò)增人α -乳清蛋白基因電泳圖，圖中M :DL2000DNA marker ； 1-5 模 板為總DNA ；6 模板為?；蚪MDNA。圖4 =LAMP擴(kuò)增人α -乳清蛋白基因可視化結(jié)果，圖中1_5 模板為人總DNA ；6 模 板為?；蚪MDNA ；7 水。 圖5 =LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切驗(yàn)證電泳圖，圖中M :DL2000DNA marker ； 1 =LAMP擴(kuò)增產(chǎn) 物；2 酶切后的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。圖6 :PCR擴(kuò)增人α -乳清蛋白基因電泳圖，圖中:M :DL2000DNA marker ；1 模板為 人基因組DNA。圖7 =LAMP擴(kuò)增人α -乳清蛋白檢出限試驗(yàn)，圖中M :DL2000DNA marker ； 1-7 pMD18T-hLA質(zhì)?？截悢?shù)依次IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10、5拷貝；8 牛的基因組DNA0圖8 :LAMP擴(kuò)增人α -乳清蛋白檢出限試驗(yàn)可視化結(jié)果，圖中1-7 :PMD18T_hLA質(zhì) ?？截悢?shù)依次IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10,5拷貝；8 牛的基因組DNA0圖9 =PCR擴(kuò)增人α -乳清蛋白檢出限試驗(yàn)，圖中M :DL2000DNA marker ； 1-7 pMD18T-hLA質(zhì)?？截悢?shù)依次106，105，104，103，102，10、5拷貝；8 牛的基因組DNA。圖10 :LAMP檢測(cè)轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因牛，圖中M :DL2000DNA marker ； 1-14 轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白基因的轉(zhuǎn)基因牛；15 陽(yáng)性對(duì)照，pMD18T-hLA質(zhì)粒；16 陰性對(duì)照，
?；蚪MDNA。圖11 :PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因牛，圖中M :DL2000DNA marker ；1-14 轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因的轉(zhuǎn)基因牛；15 陽(yáng)性對(duì)照，pMD18T-hLA質(zhì)粒；16 陰性對(duì)照，牛基因 細(xì) DNA。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 對(duì)人α -乳清蛋白基因目的片段進(jìn)行擴(kuò)增UDNA的提取與純化按照常規(guī)方法采集人血樣和牛血樣，采用報(bào)道的酚-氯仿抽 提法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[Μ].科學(xué)出版社.北京2005版方 法)分別抽提人和?；蚪MDNA，得到人或牛的基因組DNA。2.常規(guī)PCR擴(kuò)增用常規(guī)的PCR擴(kuò)增方法(薩姆布魯克，黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].科學(xué)出 版社.北京2005)以兩條外引物即編號(hào)為F3(序列表SEQ ID NO :3)、B3 (序列表SEQ ID NO 4)的引物擴(kuò)增人基因組DNA中α-乳清蛋白基因目的片段(其核苷酸序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO 5或圖1所示，序列全長(zhǎng)為184bp)。同時(shí)以?；蚪MDNA作為陰性對(duì)照。1)反應(yīng)體系上游引物 F3 0. 2μΜ，下游引物 B3 0. 2 μ Μ，1 μ 1 PCR buffer, 1. 5mM Mgcl2, 75 μ M dNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因組DNA 1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ L。
2)反應(yīng)程序:95°C，5min ；34 個(gè)循環(huán):95°C lmin, 59V lmin, 72V 20s ；72°C，5min。3)結(jié)果判定取2·5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入Ιμ 上樣緩沖液(配方40% (ν/ν)甘 油，60% (ν/ν) 0. 25MTris-Hcl, 0. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，然后在2%的瓊脂糖凝膠中電泳 30min后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)成像，可見(jiàn)長(zhǎng)度為184bp的擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖2所示。3、LAMP 擴(kuò)增以引物FIP (序列表SEQ ID NO 1)、引物BIP (序列表SEQ ID NO 2)的核苷酸序 列為內(nèi)引物，以引物F3(序列表SEQ ID NO 3)；、引物B3 (序列表SEQ ID NO 4)所示的引 物為外引物對(duì)人基因組DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)以?；蚪MDNA作為陰性對(duì)照。1)反應(yīng)體系試劑組成如下IM 甜菜堿，400 μ M dNTPs，2. 5μ 1 IOXBst Buffer, Mg2+2mM, 8U Bst DNA聚合酶，1 μ 1模板，加外引物F3、B3各0. 2 μ M，內(nèi)引物FIP、BIP各 1.6 μ Μ,補(bǔ)雙蒸水至總體積25 μ 1。2)反應(yīng)程序?qū)⑸鲜龇磻?yīng)體系中除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ 1 EP管中， 于95°C反應(yīng)5min，立即冰浴Ι-anin，再加入8U Bst DNA聚合酶，于60°C下反應(yīng)60min，然后 置80°C下5min終止反應(yīng)。3)結(jié)果分析與判定①瓊脂糖凝膠電泳取2. 5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入Ιμ 上樣緩沖液(配方40% (ν/ ν)甘油，60% (V/V)0. 25MTris-Hcl,0. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電 泳30min，在凝膠系統(tǒng)下成像，觀察是否有階梯型條帶出現(xiàn)，若有階梯型條帶則判定為含有 人α-乳清蛋白基因，若沒(méi)有階梯型條帶則判定不含人α-乳清蛋白基因。②熒光染料染色Green I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ 1的環(huán) 介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加0.5 μ ISTOR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若加 入STOR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定含有人α _乳清蛋白基因，若加入 SYBR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕色則判定為不含人α-乳清蛋白基因。③結(jié)果判定在上述分析方法①中，在凝膠成相系統(tǒng)的紫外燈下，模板為人基因組 DNA,即含有人的α -乳清蛋白基因時(shí)，可以觀察到階梯型條帶，而模板為牛基因組DNA時(shí)， 即不含人的α-乳清蛋白基因，則觀察不到階梯型條帶，其結(jié)果如圖3所示。在上述分析方 法②中，當(dāng)模板為人的基因組DNA，即含有人的α -乳清蛋白基因時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色， 當(dāng)模板為?；蚪MDNA時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕色，其結(jié)果如圖4所示。4) LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢驗(yàn)對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳檢測(cè)不是呈現(xiàn)一條帶，而是呈現(xiàn)出由多條帶組成的階梯型條 帶，這是因?yàn)檫@種方法在擴(kuò)增過(guò)程中形成以目的片段，連接在一起的長(zhǎng)短不一的開(kāi)環(huán)產(chǎn)物 所造成。本發(fā)明中α-乳清蛋白基因目的片段(其核苷酸序列見(jiàn)序列表SEQ ID Ν0:5或圖 1所示)大小為184bp，在113bp處存在限制性內(nèi)切酶AluI所識(shí)別的酶切位點(diǎn)，因此可使用 AluI對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，驗(yàn)證LAMP擴(kuò)增得到的階梯型條帶是否由α -乳清蛋白基 因目的片段所組成，若階梯型條帶能被AluI識(shí)別而酶切，則酶切后電泳檢測(cè)階梯型條帶不 存在，則判定為階梯型條帶是由α-乳清蛋白基因目的片段所組成的，亦即LAMP擴(kuò)增所得 到的產(chǎn)物是α-乳清蛋白基因目的片段。①酶切反應(yīng)體系取3 μ ILAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，加入0. 8 μ 1限制性內(nèi)切酶AluI (購(gòu)自Fermentas 公司)禾口 1 μ lbuffer，雙蒸水補(bǔ)至 10 μ 1。②反應(yīng)程序于37°C恒溫培養(yǎng)箱中酶切6小時(shí)。③結(jié)果判定取2. 5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μ 1上樣緩沖液(配方:40% (ν/ν)甘油， 60% (v/v)0. 25MTris-Hcl,0. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min， 在凝膠系統(tǒng)下成像，觀察到酶切以后的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物不再有階梯型條帶，結(jié)果如圖5所示。 結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中LAMP擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物是α -乳清蛋白基因目的片段。實(shí)施例2 人α -乳清蛋白LAMP檢測(cè)方法檢出限的試驗(yàn)用含人α -乳清蛋白基因的質(zhì)粒pMD18T-hLA作模板，驗(yàn)證檢測(cè)人α -乳清蛋白 LAMP方法的檢出限，并與PCR方法的檢出限作對(duì)比。具體步驟如下1、質(zhì)粒 pMD18T_hLA 的構(gòu)建1)人α-乳清蛋白基因目的片段PCR產(chǎn)物的回收純化用PCR方法以兩條外引物即引物F3(序列表SEQ ID NO :3)、引物B3 (序列表SEQ ID NO :4)擴(kuò)增人基因組DNA中α -乳清蛋白基因目的片段(其核苷酸序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO :5或圖8所示，序列全長(zhǎng)為184bp)。反應(yīng)體系上游引物F30. 2μΜ，下游引物B30. 2μΜ， 1 μ 1 PCR buffer, 1. 5mM Mgcl2, 75 μ M dNTPs，0. 5UDNA 聚合酶，人基因組 DNA lyL，用雙蒸 水補(bǔ)齊至 10 μ L。反應(yīng)程序95°C，5min ；；34 個(gè)循環(huán)95°C lmin,59°C lmin,72°C 20s ；72°C, 5min。取50 μ L PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳30min，凝膠成相系統(tǒng)上成像。結(jié)果可 以看到184bp大小的片段，結(jié)果如圖6所示(其核苷酸序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO :5或圖1 所示)。將擴(kuò)增的目的基因從瓊脂糖凝膠上切下，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自北京原 平皓生物技術(shù)有限公司)回收DNA。2)目的片段PCR產(chǎn)物與pMDIS-T載體連接將回收產(chǎn)物與pMD18_T載體(購(gòu)自武 漢大風(fēng)生物科技有限公司)連接，連接體系為0. 5μ L PMD-18T載體，3. 5yL solttion I， 3μ L回收產(chǎn)物，將上述試劑混勻后4°C連接過(guò)夜。3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、pMD18T_hLA質(zhì)粒的鑒定及提取取5yL連接產(chǎn)物加入 100 μ L大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42 °C循環(huán)水中熱擊90s，快速冰浴 l-2min使細(xì)胞冷卻，加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基，37 °C搖床上培育45min，在4000rpm離 心5min，棄去500 μ L上清液，將余下液體吹打均勻，吸取100 μ L涂布于含氨芐青霉素 (100yg/ml)的LB瓊脂平皿上，37°C培養(yǎng)12h。用經(jīng)高壓滅菌(121°C，高壓蒸汽滅菌30min) 的IOyL移液器頭挑取菌落置于SOOyL氨芐青霉素(100yg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 搖床震蕩培養(yǎng)4h，然后通過(guò)菌液PCR挑選陽(yáng)性菌液，然后送上海生工生物工程技術(shù)有限公 司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)確認(rèn)以后，用質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司，按照試劑盒的 說(shuō)明書(shū)介紹的方法操作)提取質(zhì)粒pMD18T-hLA。4)計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)，其公式為(6. 23 X IO23拷貝/mol) X (濃度g/ml) + [堿基數(shù)X (660道爾頓/堿基)]=拷 貝數(shù)/ml經(jīng)計(jì)算質(zhì)粒pMD18T_hLA拷貝數(shù)為5. OX IO13拷貝數(shù)/ml質(zhì)粒用雙蒸水將質(zhì)粒pMD18T-hLA進(jìn)行倍比稀釋，使其終濃度為25X 107拷貝/μ 1，25X 106 拷貝 / μ 1，25X 105 拷貝 / μ 1，25X 104 拷貝 / μ 1，25X 103 拷貝 / μ 1，25X 102 拷貝 /μ 1,25x1ο1 拷貝 / μ 1。2、LAMP方法檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)利用本實(shí)施例中所計(jì)算出的已知含有人α-乳清蛋白基因檢測(cè)目的片段(184bp) 拷貝數(shù)的質(zhì)粒pMD18T-hLA為模板，采用LAMP方法和PCR方法進(jìn)行檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)。1)LAMP方法擴(kuò)增不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pMD18T_hLA以引物F1P(序列表SEQ ID NO 1)、引物BlP(序列表SEQ ID NO 2)為內(nèi)引物，以 引物F3(序列表SEQ ID NO :3)、B3序列表SEQ ID NO 4)為外引物對(duì)本實(shí)施例中步驟1得 到的質(zhì)粒pMD18T-hLA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為IO6個(gè)，IO5個(gè)，IO4個(gè)， IO3 個(gè)，IO2 個(gè)，10，5 個(gè)。①反應(yīng)體系試劑如下IM甜菜堿，400 μ M dNTPs,2. 5μ 1 IOXBst Buffer, Mg2+2mM, 8U Bst DNA聚合酶，1 μ 1模板，加外引物F3、B3各0. 2 μ M，內(nèi)引物FIP、BIP各 1.6 μ Μ,補(bǔ)雙蒸水至總體積25 μ 1。②反應(yīng)程序?qū)⑸鲜龇磻?yīng)體系除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ 1 EP管中， 95°C反應(yīng)5min，立即冰浴Ι-anin，再加入8U Bst DNA聚合酶，于60°C下反應(yīng)60min，然后置 80°C下5min終止反應(yīng)。2)PCR方法擴(kuò)增不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pMD18T_hLA同時(shí)以兩條外引物F3(序列表SEQ ID NO :3)、B3 (序列表SEQ ID NO 4)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使體系中含質(zhì)?？截悢?shù)依次為106個(gè)，IO5個(gè)，IO4個(gè)，IO3個(gè)，IO2個(gè)，10，5個(gè).①反應(yīng)體系上游引物F30. 2μΜ，下游引物 B30. 2μΜ，1μ 1 PCR buffer, 1. 5mM Mgcl2，75 μ M dNTPs，0. 5UDNA聚合酶，人基因組DNA 1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ L。②反應(yīng)程序:95°C,5min；34 個(gè)循環(huán)95°C lmin，59°C lmin，72°C 20s ；72°C，5min。2)結(jié)果分析經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到結(jié)果當(dāng)pMD18T-hLA質(zhì)粒為10個(gè)拷貝時(shí)，LAMP方法能 擴(kuò)增出階梯型條帶，而當(dāng)pMD18T-hLA質(zhì)粒為5個(gè)拷貝時(shí)，LAMP方法未能擴(kuò)增出階梯型條帶， 因此判定LAMP對(duì)pMD18T-hLA質(zhì)粒的擴(kuò)增下限為10個(gè)拷貝，結(jié)果如圖7所示。LAMP擴(kuò)增產(chǎn) 物中，取5μ 1加入0. 5μ ISTOR Green I工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果，結(jié)果質(zhì)?？截?數(shù)依次為IO6個(gè)，IO5個(gè)，IO4個(gè)，IO3個(gè)，IO2個(gè)，10個(gè)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，而質(zhì)?？截悢?shù) 為5時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物則為棕黃色。結(jié)果如圖8所示。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到結(jié)果當(dāng)pMD18T-hLA質(zhì)粒為IO3個(gè)拷貝時(shí)，PCR方法能 擴(kuò)增出特異性條帶，當(dāng)pMD18T-hLA質(zhì)粒為IO2個(gè)拷貝時(shí)，PCR方法未能擴(kuò)增出特異性條帶， 因此判定PCR方法對(duì)pMD18T-hLA質(zhì)粒的擴(kuò)增下限為IO3個(gè)拷貝，結(jié)果如圖9所示。因此，本實(shí)施例中，LAMP方法靈敏度高，采用本方法可以檢測(cè)下限至10個(gè)拷貝的 人α -乳清蛋白目的基因，比普通的PCR的靈敏度高100倍。實(shí)施例3 對(duì)轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行LAMP檢測(cè)對(duì)14頭轉(zhuǎn)人α -乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行LAMP檢測(cè)，同時(shí)用PCR的方法作為對(duì) 照。試驗(yàn)中所用轉(zhuǎn)基因牛的基因組DNA以及人的基因組DNA樣品，均稀釋到20ng/y 1。1) LAMP 擴(kuò)增過(guò)程以 FIP (序列表 SEQ ID NO 1)、BIP (序列表 SEQ ID NO 2)為內(nèi) 引物，F(xiàn)3(序列表SEQID NO :3)、B3(序列表SEQ ID NO 4)為外引物對(duì)人α-乳清蛋白DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)體系為IM 甜菜堿，400 μ M dNTPs,2. 5μ 1 IOXBst Buffer, Mg2+2mM, 8U Bst NDA聚合酶大片段，1 μ 1模板，外引物各0. 2 μ Μ，內(nèi)引物各1. 6 μ Μ，補(bǔ)ddH20至25 μ 1， 將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ 1 EP管中，950C反應(yīng)5min，立即冰浴l-2min，加 入8U Bst NDA聚合酶大片段，60°C反應(yīng)60min，80°C反應(yīng)5min后終止反應(yīng)；2)PCR擴(kuò)增過(guò)程用兩條外引物F3、B3擴(kuò)增人α-乳清蛋白基因組DNA中目的片段 (184bp)，反應(yīng)體系為上游引物 F3 0. 2μΜ，下游引物 B3 0. 2 μ Μ，1 μ 1 PCR buffer, 1. 5mM Mgcl2,75yM dNTPs,0. 5U DNA聚合酶，人基因組DNA 1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ L。將 上述試劑混勻后置于PCR儀中，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95°C，5min ；；34個(gè)循環(huán)95°C lmin,59°C lmin,72°C 20s ；72°C,5min03)結(jié)果分析①瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μ 1上樣緩沖液(40% (ν/ν)甘油， 60% (v/v)0. 25MTris-Hcl,0. 2% (w/v)溴酚藍(lán))，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min， 得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則含有人α-乳清蛋白基因，若沒(méi) 有階梯型條帶則不含人α-乳清蛋白基因。②熒光染料染色將STOR Green I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ 1的 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，再加0.5 μ ISTOR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。若 加入STOR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)辄S綠色，則判定為含有人α _乳清蛋白基因，若 加入STOR Green I工作液后，擴(kuò)增產(chǎn)物為棕色則判定為不含人α-乳清蛋白基因。③結(jié)果判定本實(shí)施例的LAMP檢測(cè)方法以及作為對(duì)照的PCR方法均檢測(cè)出了陽(yáng)性 轉(zhuǎn)基因牛的α-乳清蛋白基因成分，結(jié)果分別如圖10、圖11所示。
權(quán)利要求
1. 一種轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因牛的快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)方法，其步驟包括(1)引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)人α-乳清蛋白的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，所述引物的 DNA序列如下所示FIP :5’ -TTGAACCGAGGAGGCGGAGGCCAGACTGGAGTGCAATGG-3’ ；BIP :5’ -GTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTTAGCCAGGCATGGTGGT-3，；F3 :5， -GGTGGAGTTTCGCTCTTGTT-3，；Β3 :5’ -ACATGGTGAAACCCTGTCTC-3‘；(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)以FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物對(duì)人α _乳清蛋白基因進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，其反應(yīng)體 系為1Μ甜菜堿，400μΜ dNTPs,2. 5μ 1 IOXBst Buffer,Mg2+2mM,8U Bst NDA聚合酶，1 μ 1 模板，外引物F3和Β3各0. 2μΜ，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，補(bǔ)雙蒸水至25 μ 1，將上述除 酶以外的所有試劑混勻置于200 μ IEP管中，于95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)后立即冰浴l-2min，加 入8U Bst NDA聚合酶，于60°C反應(yīng)60min，80°C下反應(yīng)5min后終止反應(yīng)；(3)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物分析1)瓊脂糖凝膠電泳取2.5μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μ 1上樣緩沖液，該緩沖液包含濃度 40%甘油，0. 2%溴酚藍(lán)，59. 8% 0. 25Μ Tris-Hcl,混勻，再按重量/體積計(jì)加2%瓊脂糖凝 膠，于5V/cm下電泳30min，得到凝膠成成像，觀察是否有梯形條帶出現(xiàn)；2)將STORGreen I熒光染料稀釋100倍后作為工作液，取5 μ 1的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn) 物，再加0. 5 μ ISTORGreen I的工作液，在日光下用肉眼觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因牛的轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)方法。本發(fā)明與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)有關(guān)。步驟是(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)人α-乳清蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異引物，該引物的序列如SEQ ID NO1-4所示。(2)建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)方法，即以FIP、BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)3、B3為外引物對(duì)人α-乳清蛋白基因進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，得特異擴(kuò)增片段。(3)對(duì)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析采用瓊脂糖凝膠電泳和熒光染料染色對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)凝膠成像觀察是否出現(xiàn)梯形條帶，判定是否含有轉(zhuǎn)基因成分；或在日光下肉眼觀察將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。本發(fā)明簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)，且成本較低，適合基層應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102102127SQ20101057551
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者劉楚新, 劉榜, 翟珊莉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)