專(zhuān)利名稱(chēng)：黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，屬于植物生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃瓜細(xì)菌性角斑病(Pseudomopnas syringae pv. lachrymans)是一種重要的細(xì)菌 性病害。致病菌為丁香假單孢桿菌黃瓜致病變種，屬薄壁菌門(mén)假單孢菌屬。發(fā)病初始產(chǎn)生 水漬狀小斑點(diǎn)，擴(kuò)大后受葉脈限制，病斑呈多角形，淡黃色至褐色，邊緣有黃色暈環(huán)，發(fā)病嚴(yán) 重時(shí)，病斑布滿葉片，使葉片干枯卷曲脫落。該病在保護(hù)地及露地生產(chǎn)中均有發(fā)生，且以露 地危害最重，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來(lái)隨著黃瓜種植面積的不斷擴(kuò)大，此病已成為黃瓜生產(chǎn)中 亟待解決的問(wèn)題。關(guān)于黃瓜細(xì)菌性角斑病生物防治主要集中在選用優(yōu)良抗病品種、種子消 毒、培育無(wú)病苗、加強(qiáng)栽培管理、生態(tài)防治和化學(xué)藥劑防治等幾個(gè)方面。目前對(duì)于黃瓜與細(xì) 菌性角斑病相互作用的分子機(jī)理仍不清楚，許多關(guān)于病原菌基因和黃瓜抗病基因的結(jié)構(gòu)和 功能作用方式仍不清晰，因此尋找與黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)于 加快黃瓜育種進(jìn)程具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述存在的問(wèn)題提供一種黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子 標(biāo)記鑒定方法，能夠更好地利用上述黃瓜抗病基因分子標(biāo)記，并將黃瓜抗細(xì)菌性角斑病分 子標(biāo)記應(yīng)用于黃瓜育種的輔助選擇。上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，該方法包括如下步驟以細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或者對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7.5%的變性聚 丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的抗細(xì)菌性角斑病的黃瓜東農(nóng)803帶 型一致，則該細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系為抗細(xì)菌性角斑病品種或品系，所 述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lmin，72°C延伸lOmin，最后4°C保存，所述的CSWCT24A為引物 1 5，-AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3，，引物 2 5，-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3，。所述的黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，所述PCR擴(kuò)增中，每 20μ 1 的 PCR 反應(yīng)體系如下10 X buffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1，lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 :10. 7μ 1。黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法在輔助選擇抗病黃瓜材料中的應(yīng)用。
有益效果1.本發(fā)明直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè) 到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題，因此，本發(fā)明能夠克服黃瓜細(xì)菌性角斑病 抗性鑒定易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，在苗期就能夠通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)黃瓜品種和品系的細(xì)菌性角 斑病抗性進(jìn)行鑒定和篩選，淘汰感病植株，減少人力和物力的浪費(fèi)，提高育種效率。同時(shí)， DNA分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)單，成本低廉，用時(shí)短，在一天內(nèi)即可完成全部的檢測(cè)過(guò)程。通過(guò)高 效率的分子標(biāo)記檢測(cè)，還能夠減少農(nóng)民的農(nóng)藥用量，降低生產(chǎn)成本，提高其經(jīng)濟(jì)收入，也可 以有效減輕農(nóng)藥對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染和危害。2.所需樣本數(shù)量少，操作比較簡(jiǎn)便，效率高，成本低廉。3.本發(fā)明易于掌握，不受環(huán)境條件影響，重復(fù)性高。


圖1黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因分子標(biāo)記的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果(東農(nóng)804)，圖中 M :DL2000DNA Marker ；1，抗病對(duì)照東農(nóng) 803 ；2-3，東農(nóng) 804 單株。圖2黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因分子標(biāo)記的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果(東農(nóng)80 ，圖中 M :DL2000 DNA Marker ；1，抗病對(duì)照東農(nóng)803 ；2 8 東農(nóng)805單株。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試 驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。所有引物合成均由生工生物 工程(上海)有限公司完成。以下實(shí)施例中所有用到的黃瓜材料均為公知的。實(shí)施例1 黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，該方法包括如下步驟以細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或者對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7.5%的變性聚 丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的抗細(xì)菌性角斑病的黃瓜東農(nóng)803帶 型一致，則該細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系為抗細(xì)菌性角斑病品種或品系，所 述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火Imin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lmin，72°C延伸lOmin，最后4°C保存，所述的CSWCT24A為 引物 1 5，-AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3，，引物 2 5，-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3，。實(shí)施例2 所述的黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，所述PCR擴(kuò)增中，每 20μ 1 的 PCR 反應(yīng)體系如下10 X buffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1，lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 :10. 7μ 1。實(shí)施例3 黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法在輔助選擇抗病黃瓜材料中的應(yīng)用。
以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組培育出的黃瓜雜交新品種東農(nóng)804和東農(nóng) 805為材料；提取其單個(gè)植株DNA為模板，以本發(fā)明提供的1個(gè)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病特異分 子標(biāo)記CSWCT24A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，東農(nóng)804和東農(nóng)805單株的PCR擴(kuò)增帶型 與抗病對(duì)照東農(nóng)803擴(kuò)增帶型完全一致，且PCR檢測(cè)結(jié)果與田間細(xì)菌性角斑病抗性鑒定的 吻合率為100%，證明了 CSWCT24A是一個(gè)實(shí)用的黃瓜細(xì)菌性角斑病抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記。
權(quán)利要求
1.一種黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征是該方法包括如下步 驟以細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或者對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7. 5%的變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的抗細(xì)菌性角斑病的黃瓜東農(nóng)803帶型 一致，則該細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系為抗細(xì)菌性角斑病品種或品系，所述 PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火Imin, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lmin，72°C延伸lOmin，最后4°C保存，所述的CSWCT24A為引物 1 :5’ -AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3，，引物 2 :5，-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征 是所述PCR擴(kuò)增中，每20 μ 1的PCR反應(yīng)體系如下=IOXbuffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1， lOpmol/μ 1 的 Primer 1 :0. 8 μ 1，IOpmol/μ 1 的 Primer 2 0. 8μ l,25mM MgCl2 :2. 5 μ 1， 5U/ μ 1 的 TaqDNA 聚合酶0. 2 μ 1，60ng/ μ 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 10. 7 μ 1。
3.—種上述黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法在輔助選擇抗病黃瓜材料 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因的分子標(biāo)記鑒定方法。本發(fā)明的方法包括以細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或者對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行7.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的抗細(xì)菌性角斑病的黃瓜東農(nóng)803帶型一致，則該細(xì)菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系為抗細(xì)菌性角斑病品種或品系，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸1min，72℃延伸10min，最后4℃保存。本發(fā)明用于鑒定黃瓜抗細(xì)菌性角斑病基因。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102102128SQ201010575818
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者周秀艷, 武濤, 王麗莉, 秦智偉, 辛明 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)