專利名稱：一種杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻基因工程，具體是一種杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，通 過(guò)構(gòu)建杜氏鹽藻(以下簡(jiǎn)稱鹽藻)葉綠體轉(zhuǎn)化載體，并且轉(zhuǎn)化鹽藻，再經(jīng)同質(zhì)化篩選，最終實(shí) 現(xiàn)鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
以細(xì)胞核為外源基因受體的傳統(tǒng)植物基因工程雖己發(fā)展趨于成熟并得到廣泛應(yīng) 用，但隨著研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到對(duì)細(xì)胞核基因組的遺傳轉(zhuǎn)化存在一系列難以 解決的問(wèn)題例如由于細(xì)胞核基因組大，背景復(fù)雜，外源基因的整合位點(diǎn)和整合的拷貝數(shù)難 以人為控制，造成外源基因表達(dá)效率低，容易出現(xiàn)基因沉默等；同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因時(shí)操作步 驟過(guò)于復(fù)雜，所表達(dá)的原核基因必須經(jīng)過(guò)修飾改造，環(huán)境安全難以保證。葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的出現(xiàn)為克服這些困難提供了一個(gè)新途徑。與核基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相 比，葉綠化轉(zhuǎn)化系統(tǒng)有以下特點(diǎn)①基因組小，遺傳背景清晰。目前已有幾十種植物和藻類 的葉綠體基因組全序列被測(cè)定，這就為外源基因通過(guò)同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基 因組奠定了基礎(chǔ)。定點(diǎn)整合有利于人為控制外源基因的插入位點(diǎn)，可以將目的基因定位在 適于表達(dá)的位點(diǎn)，能較好地解決“順式失活”、“位置效應(yīng)”等引起的基因沉默問(wèn)題，而且簡(jiǎn) 化了外源基因轉(zhuǎn)化后的篩選工作。例如萊茵衣藻的核基因組為1051Λ，至少有17個(gè)連鎖群， 上萬(wàn)個(gè)基因，這些基因的結(jié)構(gòu)、功能與序列還不清楚；而葉綠體基因組僅為2031Λ，除rrn基 因和trn基因外編碼大約100個(gè)基因，全序列已測(cè)定，基因的背景資料非常清楚，葉綠體轉(zhuǎn) 化載體插入的靶序列非常明確，不會(huì)影響其它基因的功能。②外源基因超量表達(dá)。由于葉 綠體中DNA分子有多個(gè)拷貝，同時(shí)葉綠體在細(xì)胞中處于相對(duì)隔絕狀態(tài)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的積累 有較強(qiáng)的承受能力，目的基因產(chǎn)物的積累不會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生過(guò)大影響，因而為外 源基因在葉綠體中的大量表達(dá)提供了保障。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以使目 的基因超量表達(dá)，蛋白產(chǎn)量比核基因表達(dá)高出20倍以上，甚至高達(dá)100-300倍。③基因表 達(dá)的原核方式。由于葉綠體基因組基因的排列方式、調(diào)控方式、G C堿基對(duì)含量及翻譯所偏 愛(ài)的密碼子與原核生物類似。因此，對(duì)來(lái)自原核生物的有重要價(jià)值的外源基因，無(wú)需改造 和修飾就可以在葉綠體內(nèi)高效表達(dá)，這是核基因轉(zhuǎn)化無(wú)法做到的。④利于同時(shí)進(jìn)行多基因 轉(zhuǎn)化。在葉綠體基因組中，許多功能相近的基因聚合在一起，共用同一個(gè)啟動(dòng)子，組成多 順?lè)醋樱@種結(jié)構(gòu)為在同一啟動(dòng)子的調(diào)控之下同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因提供了可行性。許多 產(chǎn)品和重要性狀往往是多基因共同作用的產(chǎn)物，僅轉(zhuǎn)入單個(gè)基因難以取得理想效果。核轉(zhuǎn) 化系統(tǒng)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因操作復(fù)雜，工作量大，而且易出現(xiàn)基因沉默。在葉綠體中表達(dá)多個(gè) 外源基因時(shí)可采取“多順?lè)醋印痹吮磉_(dá)形式，通過(guò)一次轉(zhuǎn)化就可將多個(gè)基因引入受體植 物，并由共同的啟動(dòng)子控制，既方便操作又可避免由于存在多個(gè)相同啟動(dòng)子所帶來(lái)的“共 沉默”。⑤母性遺傳，環(huán)境安全性高。由于葉綠體基因組小，與核基因組相比非編碼區(qū)很少，外源片段的隨機(jī)插入往往 導(dǎo)致自身基因的失活，轉(zhuǎn)化采用同源重組定點(diǎn)整合的形式，需一定長(zhǎng)度的同源片段，通過(guò)交換定點(diǎn)整合入葉綠體基因組。因?yàn)橥庠椿虻牟迦胛稽c(diǎn)可控，較少發(fā)生基因失活、基因沉默 等現(xiàn)象，但因插入位點(diǎn)僅局限于特定的同源區(qū)域，使葉綠體基因組轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核基 因組，因此同源片段的選擇至關(guān)重要，是構(gòu)建葉綠體轉(zhuǎn)化載體及成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵 因素。一般來(lái)說(shuō)需要①適當(dāng)?shù)耐雌伍L(zhǎng)度。片段過(guò)短同源重組發(fā)生率低，但片段過(guò)長(zhǎng) 操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)入難度大。實(shí)驗(yàn)證明，兩端同源臂長(zhǎng)度均在1 1Λ-2 1Λ左右較好；②選擇正確 的插入位點(diǎn)，使外源基因的插入不損傷葉綠體功能或者不影響宿主正常生存；由于葉綠體 在進(jìn)化過(guò)程中有大規(guī)模的遺傳信息轉(zhuǎn)移或者流失，保留下的幾乎全部是與葉綠體的蛋白合 成、DNA復(fù)制和光合作用密切相關(guān)的重要基因，其破壞將導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此隨機(jī)插入對(duì) 于葉綠體系統(tǒng)是致死性的，合適的插入位點(diǎn)的選擇是葉綠體轉(zhuǎn)化的第一關(guān)鍵點(diǎn)，這也是制 約許多植物葉綠體轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建的一大瓶頸。至今為止，高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化成功的物種有煙草、擬南芥、水稻、馬鈴薯等，高 等植物葉綠體轉(zhuǎn)化中亟待解決的技術(shù)難點(diǎn)在于葉綠體轉(zhuǎn)化后的同質(zhì)化問(wèn)題。在高等植物 的葉肉細(xì)胞中含有多個(gè)葉綠體，每個(gè)葉綠體中又含有多個(gè)基因組拷貝。以顯花植物為例， 其每個(gè)葉肉細(xì)胞中約有100個(gè)葉綠體，每個(gè)葉綠體中又含有100多個(gè)質(zhì)體基因組拷貝。如 何使外源基因完全整合到葉綠體每個(gè)DNA拷貝中是目前限制葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)推廣應(yīng)用的 難題之一。與此相對(duì)比，低等單細(xì)胞綠藻的葉綠體轉(zhuǎn)化后的同質(zhì)化則相對(duì)簡(jiǎn)便，這與其只具 有單一巨大杯狀葉綠體有關(guān)，葉綠體占整個(gè)細(xì)胞的50%左右，包圍著細(xì)胞核，而且緊貼細(xì)胞 膜，便于遺傳操作。特別是近年來(lái)已有多種單細(xì)胞綠藻如衣藻、小球藻、腎藻、鹽藻等的葉綠 體全基因組得到了測(cè)序，使得合適的同源片段和插入位點(diǎn)的選擇成為可能，為單細(xì)胞綠藻 的葉綠體轉(zhuǎn)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。鹽藻屬綠藻門團(tuán)藻目，是一種原生質(zhì)裸露的耐鹽單細(xì)胞藻，長(zhǎng)約6-15 μ m,呈橢圓 形或梨形，無(wú)細(xì)胞壁只有細(xì)胞膜，且有雙鞭毛，能在水中游動(dòng)；有一個(gè)大型杯狀葉綠體約占 細(xì)胞體積的48%左右。該藻的突出優(yōu)點(diǎn)在于培養(yǎng)條件極其簡(jiǎn)單，光合自養(yǎng)，抗逆性極佳，可 在0. 05M-5M的鹽水中生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)繁殖鹽度為10 15%。這是許多其它生物易難以生存 的環(huán)境，故其大規(guī)模培養(yǎng)不需昂貴的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置，可以直接采用開(kāi)放式培養(yǎng)，因 此大大降低生產(chǎn)成本；而且鹽藻本身無(wú)毒，富含多種天然維生素，食用價(jià)值高，WHO已批準(zhǔn) 其為天然胡蘿卜素來(lái)源的食物添加劑。因此，如果用鹽藻生產(chǎn)口服型疫苗或其他口服型藥 物，甚至無(wú)須純化即可直接服用，也可大大降低生產(chǎn)成本，是一種理想的新型生物反應(yīng)器。合適的插入位點(diǎn)和同源序列的選擇是構(gòu)建葉綠體轉(zhuǎn)化載體的關(guān)鍵。外源基因的插 入可能會(huì)導(dǎo)致插入?yún)^(qū)域原有基因的失活，進(jìn)而影響宿主生存。在以作物改良為目的的葉綠 體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又 不致于破壞插入位點(diǎn)原有基因的功能。為滿足這一要求，高等植物的葉綠體轉(zhuǎn)化工作都選 用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcL/aacD，16strnV/rpsl2rps7，psbA/trnK， rpS7/ndhB等。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了 原有基因的功能不受影響。這種方法要求對(duì)于葉綠體基因組中兩個(gè)相鄰的轉(zhuǎn)錄單位的序列 和結(jié)構(gòu)有明確的研究結(jié)果才能選用。另一個(gè)實(shí)現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要因素是葉綠體基因組的同質(zhì)化程度。同質(zhì)化過(guò)程是 使所有葉綠體基因組都帶有目的DNA片段的過(guò)程。葉綠體基因組通常以高拷貝數(shù)存在，同 時(shí)轉(zhuǎn)化所有的基因組幾乎是不可能的，極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)化的與未轉(zhuǎn)化的葉綠體組成的異質(zhì)體，無(wú)法保證獲得的性狀穩(wěn)定遺傳下去。因此葉綠體轉(zhuǎn)化所面臨的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題就是去除未轉(zhuǎn) 化的基因組和未轉(zhuǎn)化的葉綠體。這個(gè)問(wèn)題的解決是通過(guò)向葉綠體表達(dá)載體中加入宿主敏感 的篩選標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化后在適度的選擇壓力下多次篩選，淘汰掉未轉(zhuǎn)化的葉綠體，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn) 化葉綠體基因組的同質(zhì)化。同質(zhì)化過(guò)程是轉(zhuǎn)化子抗性逐步提高的過(guò)程，選擇壓力過(guò)小，不能 去除未轉(zhuǎn)化的葉綠體基因組；選擇壓力過(guò)大，則可能因?yàn)樗拗鞯难杆偎劳龆y以完成轉(zhuǎn)化 后葉綠體基因組同質(zhì)化過(guò)程。在實(shí)際工作中用到的篩選標(biāo)記基因主要有突變型16SrRNA基 因、nptll基因、aadA基因和熒光標(biāo)記基因等。表達(dá)元件的選擇也是構(gòu)建適宜的轉(zhuǎn)化載體和表達(dá)外源蛋白的重要影響因素。為 了使外源基因整合進(jìn)葉綠體基因組后能夠高效表達(dá)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體時(shí)，一般選用葉綠體來(lái) 源的啟動(dòng)子和終止子。例如，在已有的報(bào)道中，常用的啟動(dòng)子是葉綠體的16srRNA基因啟 動(dòng)子ftrn，以及光系統(tǒng)II作用中心蛋白基因的啟動(dòng)子PpsbA等；常用的終止子包括葉綠體 rbcL、ρsbA基因的終止子！"rbcL、TpsbA和葉綠體rpsl6基因的終止子iTrpsie等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)，而專門提供的一種杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載 體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的是以光非依賴性的原葉綠素酸酯還 原酶chlN、chlB或者ChlL基因?yàn)橥雌?，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT基因和除草劑草丁膦 抗性基因bar為篩選標(biāo)記，并以atpA啟動(dòng)子和rbcL終止子為表達(dá)元件構(gòu)建雙交換雙篩選 標(biāo)記的杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體。通過(guò)基因槍法或者電激法轉(zhuǎn)化鹽藻，再經(jīng)過(guò)兩步法篩選 實(shí)現(xiàn)同質(zhì)化，達(dá)到外源基因在鹽藻葉綠體基因組的定點(diǎn)整合，獲得穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的葉 綠體轉(zhuǎn)化鹽藻藻株。具體包括以下步驟 1)、鹽藻培養(yǎng)。2)、光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶基因同源片段的克隆。3)、構(gòu)建雙交換雙標(biāo)記杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體。該載體主要特征是含有光非依 賴性的原葉綠素酸酯還原酶基因?yàn)橥雌危钥剐曰駽AT和bar為篩選標(biāo)記，并以atpA 啟動(dòng)子和rbcL終止子為表達(dá)元件。4)、通過(guò)電激法或基因槍法將該葉綠體轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入鹽藻。5)、轉(zhuǎn)化藻株的篩選培養(yǎng)。同質(zhì)化前主要用氯霉素進(jìn)行篩選，同質(zhì)化后，用草丁膦 輔助篩選，有利于在較短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。外源基因的插入可能會(huì)導(dǎo)致插入?yún)^(qū)域原有基因的失活，進(jìn)而影響藻體生存。在植 物和藻類中，葉綠素的合成有光依賴性和光非依賴性兩條途徑。在光照條件下，葉綠素的合 成主要通過(guò)光依賴性的原葉綠素酸酯還原酶系統(tǒng)(LPOR)催化完成，該途徑高度保守，存在 于所有植物和藻類中，是葉綠素合成的主要途徑；而除被子植物以外的其他植物和各種藻 類，則在光依賴性的原葉綠素酸酯還原酶系統(tǒng)(LPOR)以外，還存在著光非依賴性的原葉綠 素酸酯還原酶系統(tǒng)(DPOR)，可以在黑暗條件下催化葉綠素合成，該酶由chlN、chlL和chlB 基因編碼，三者任一的破壞都可阻斷葉綠素在黑暗條件下的合成，但是仍可通過(guò)光依賴性 的原葉綠素酸酯還原酶系統(tǒng)(LPOR)進(jìn)行葉綠素合成，不影響正常生存。
在本發(fā)明中，選擇杜氏鹽藻光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶基因及其側(cè)翼序列 為同源序列，其長(zhǎng)度為2-41Λ。適宜的選擇標(biāo)記和選擇壓力是順利完成葉綠體基因組同質(zhì)化，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、提 高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明選擇氯霉素抗性cat基因和草丁膦(PPT)抗性bar基因共 同作為篩選標(biāo)記基因，CAT基因?yàn)橹饕Y選標(biāo)記基因，而bar基因是輔助篩選標(biāo)記基因。其 中氯霉素較溫和，篩選周期較長(zhǎng)，而PPT致死性強(qiáng)，可縮短篩選時(shí)間。因此同質(zhì)化前主要用 氯霉素進(jìn)行篩選，同質(zhì)化發(fā)生后，用PPT輔助篩選，最終確定穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。本發(fā)明選擇來(lái)源于鹽藻近緣微藻一萊茵衣藻葉綠體的atpA啟動(dòng)子和rbcL終止子 為表達(dá)元件，萊茵衣藻是研究光合作用的模式生物，生長(zhǎng)速率快，atpA和rbcL基因是光合 作用的關(guān)鍵基因，也是萊茵衣藻中轉(zhuǎn)錄最強(qiáng)的基因，可有效實(shí)現(xiàn)外源蛋白在葉綠體中的高 效表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是選取DPOR的編碼基因chlN、chlL和chlB基因作為同源片 段，DPOR參與黑暗條件下葉綠素的合成，破壞后不影響鹽藻正常生存，鹽藻仍可通過(guò)LPOR 合成葉綠素，但在暗光培養(yǎng)呈黃綠色，可作為轉(zhuǎn)化子的輔助篩選標(biāo)記。本發(fā)明選擇氯霉素抗性CAT基因和草丁膦抗性bar基因共同作為篩選標(biāo)記基因， 既便于葉綠體基因組的同質(zhì)化，也有利于在較短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。


圖1.雙交換雙篩選標(biāo)記杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載pchlN-CAT-BAR圖譜
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體內(nèi)容
實(shí)施例一、杜氏鹽藻葉綠體光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶基因的克隆和載體構(gòu) 建，此處以chlN基因?yàn)槔琧hlL和chlB基因同源片段的克隆和載體構(gòu)建與其類似。1、杜氏鹽藻的培養(yǎng)
培養(yǎng)基配方如下:NaCl 58. 5 g/L, MgCl2 · 6H20 15g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 2 g/L, CaCl2 0. 151g/L, KNO3 0.5 g/L, NaHCO3 0.043 g/L, KH2PO4 0. 035 g/L，鐵鹽溶液 10 mL/L，微量元素溶液10 ml/L。鐵鹽溶液配方=Na2EDTA· 2H20 209 mg/L, FeCl3 · H2O 244 mg/L。微量元素溶液配 方=H3BO3 61 mg/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 38 mg/L, CuSO4 · 5H20 6 mg/L, CoCl2 · H2O 5. 1 mg/ L, ZnCl2 4. 1 mg/L, MnCl2 · H2O 4. lmg/L，用 HCl 調(diào) pH 值到 7. 5,0. 11 MPa 滅菌 20 min。以10%的濃度接種藻液，培養(yǎng)溫度25 士 2°C，光照強(qiáng)度3000 lux，光照周期為12 h光照/12 h暗培養(yǎng)。
2、杜氏鹽藻葉綠體DNA的提取
取10 ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的杜氏鹽藻培養(yǎng)液，5000 g 4°C離心5 min，鹽藻細(xì)胞沉淀 M 350 μ 1 NET (0.1 mol/L NaC 1,50 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris ·Η(Π，pH8. 0)懸浮后， 加入25μ1蛋白酶K (10 mg/ml),25y 1 20% SDS，混勻，55°C水浴2 h后，置于冰上冷卻， 加入200μ 1.5 mol/L乙酸鉀，冰上靜置30 min。12000 g 4°C離心5 min，上清液加入等體
6積的酚/氯仿/異戊醇(25: : 1)，抽提兩次，再用等體積的氯仿抽提一次。水相加入2倍 體積的無(wú)水乙醇，混勻后置于_70°C，15 min。12000 g 4°C離心10 min，沉淀用70%乙醇洗 滌去鹽，真空干燥后溶于30 μ 1雙蒸水中。
3、PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻葉綠體chlN基因5'序列及3'序列
根據(jù)GenBank登錄的杜氏鹽藻葉綠體基因組全序列(GenBank登錄號(hào)NC_005353)，合 成如下引物
ChlN5-l 5' -ACAGGAATTCCCCCTTTGGTTTCCCTCA-3'； ChlN5-2 5' -AAGAGAGCTCCTGACCACTATACGGAGC-3'； ChlN3-l 5' -AAGAGCATGCTAACGGTCTTGATTATGC-3'； ChlN3-2 5' -ATGAAAGCTTCCACTGAGGAGGTTCTTT-3'
以上述杜氏鹽藻葉綠體基因組DNA為模板，分別以ChlN5-l和ChlN5-2為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增杜氏鹽藻葉綠體chlN基因5'序列；以ChlN3-l和ChlN3-2為引物，PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻 葉綠體chlN基因3'序列。PCR反應(yīng)條件為94°C 30 s，55°C 50 s，72°C 120 s，25個(gè)循環(huán)；將產(chǎn)物克隆到 PMD18-T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序。ChlN 基因 5'序列 CCCCTTTGGTTTCCCTCACGCGATGGACAAAGTCCTAGCCCTTAGGGGTCCGCTAAATTTTATAATTTTTTT
TTTTTTAATTTTTTTTCGGCGGGTCCGTTTTCTTTGAGAAAACGGCCCGCCCGCCCGTGAGGGAAACGTCTCAAAAA AAAATTTCCGAACCCGTGAGGGAAACAACAAAATTGCCCTCATGGGCAACAAAGTTGCCCATGAGGGCAATTAAGTT GTTTTGTCGGCTAAATTGGATTCAAATAAATAAAAAAATCTTTTGTTTGTATATTTGATACAAACAAAAAAAAATTA ATAACATTTTAAACAAAAATATATATACTATTTATGCTAATTACATGAAAAAAAAAAAAATTCGTATTTATTGTATA ATCTAAAATTAAATAAATATAAATTTTTTATTAATTTTTTTATAAGAAATTTCTAAAATTTTATTTAGTTTTCAAAT ATTGAAATAAAATTTGTGTTTGTCCATGTGCACTAAACAATATAAGATATATAAATTTTTTATAAAAAAAAAAACTT TATAACTCAAAAAAAAAACCAAACATTGTAAATTACAACTTTCTCTAAATTTTATGTCAATTCATAAACAGGATAAA AGGATAAAGCAAAAAGCAAAAGCCTACTTAAATAAAAAATAAAATTAGACTTTATTAATAAAAAGGAAAATCAAAAA AGAATGACTAAAAACTGTAACTAAAAGTTTAATTCTTTTTTGAATGAAATTGGAGAAAAATTTTAAAAGAATCGTTT TCAATAATATTTCTCCAAAAACGCTGATTTGCTTTAGGTACTCTATATAATATAATAGATTTAAAAATCACTAATTA CAAAAGTAATATATTAATTATGAGAAAGTATTTTTTTCTCAGTTTAAATATAATTAATTTTTCTTATATTTTATATG GTAATACCATAATAATTTTCTTATAACTTATTATGGTATTACCATATAAAAATATAAAAAGTTATTCACTATGCCAA AGAAGATTGTTTAAAATTGATTTAACTTAAAAATTTTATAAATCTTTATTTCTTTATATATAATTAATAAATTTAAT TATATATAACAAATAACGAAAAAATAAAATTTATTGAAATTAAACTAAAACAAATTATTTATTTTTTGTTGATTTTC TAACCTTATTATTTTCTATTGATTCTAATATTAATGATATTTTTAACCTATGTTGAATAACAATTCTTAAAATAAAA AATTATAATAATAAAAATAATCTCTCGTCGCCGCGCTATTAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAATTAAAA AAAAAAAAATAATTAAAAAAAATAATAATTAAAAAAAATAATAATTAAAAAAATAATAATTAAAAAAAAAATAATTA TTGTATAATTATTTAATAATTTGTGGTTCTATTGAAAAACAGAATCCTCTCAAACGAGGCGGGAGTCGTTTTTAAGT TATTATGACTATAAAAAAATTTCTTATTTTGAAAATTAACTTTGTTAATTTTCTAAGCGGAAAAGAAATTTTTGATT TTTTTACTATTGTCCGCTCCCCTCACGGGCGGGGTCGGTATTTTTCTTATAACCGTTGCGCGAAAAATCCGGCAGTT AAATTAAAACTGTTTGGTTTTCACCGTTTTATATATTTTAAACGCATATCACAAGAGAAAATCTTTCTAAGGTCTGTTTATACAATTTTATTTTATACACTTAAAAATACGTGTTTACGTATTTTTGTTTTATTTTATGTTTAAAAATTGATTA TATTTCGCATTGTGCGGATTGTAATTTTAACTTTATGGTGAAAAACAAAAAAAGATTCCCTCTATTTCAAACTTTTA GAAATTCTTCGTCTATTCCGGCATCGAAAAACTCTGTATTAGAAACAGCTAATCAAAGTATTTCAGTTGAGTCATCA AATGAAACATCTACAGCTGCTCCGTATAGTGGTCAG
ChlN基因3'序列
TAACGGTCTTGATTATGCTTTCACACAAGGTGAAGATACTGTTTTAGCTGCAATGGCACAAAAATGTCCAGC CCGTGAGGGCCGCTTAAAAAATATAAATTTACCTATCGCCCGCTCGGCGATCCGAGCGGACGAGACTTTAAAGTCCG CTCGTACGTCAGTCGAAGATCAAGCGACTAAAACTGTAACATCAAATTCTTCAAATTCCATAAACGCGGACCCGCCT ATAAGTAATAAACAACTAAAAGAACTTGTTCTATTTGGATCATTACCAACTACAATTGCCAATCAATTACAATTAGA ATTAAAACGTCAGGGTATTAATGTATCTGGTTGGTTACCATCTGCACGTTATTCTGACTTACCAGCTTTAGGTGAAA ATGTTTATGTTTGCGGTATTAATCCTTTTTTAAGTCGTACAGCTACTTCTTTAATGCGTCGTCGTAAATGTAAATTA ATTTCTGCTCCTTTTCCTATTGGTCCTGATGGTACTCGCGCGTGGGTTGAAAAAATCTGTAATGTTTTTGGTATTGT TCCTACTGGGTTAGAAGAACGTGAAAAAACGATTTGGACTAATTTAACAGAATCAATTAATTTTATTAAAGGTAAAT CTGTTTTTTTCATGGGGGATAATCTTTTAGAGATTTCATTAGCACGTTTTTTAATCCGTTGTGGAATGGTTGTATAT GAAATTGGTATCCCGTATATGGATAAACGTTTTCAAGCTGGTGAATTGGCTCTACTAGAAAAAACATGTATTAAAAT GAAAGTACCTTTTCCACGTATTGTTGAAAAACCTGATAATTATTACCAAATCCAACGTATTAAAGAATTAAAACCAG ATTTAGTAATAACTGGAATGGCACATGCTAACCCATTAGAAGCACGTGGTATTACAACTAAGTGGAGTGTAGAGTTC ACGTTTGCCCAAATACATGGTTTTACTAACACTAAGGACCTTTTAGAATTAGTTTCTAGACCATTACGTCGTAACAA AAACTTAGAAAATCATGATTCTTTAAGCAAAACTTTCGCTCTTCAATAAAATAAAAAAAATTTATGTTGCATTCAAA GCTCCTTATGGGCTTGCCTAAAAGCAAAAAATAAAAGACTTTCTTTTGTTAAAATAGAAGTGAAAGCCATAACTATA ATTCTTTTATTTATGGAAAGTTATGGCTTTCGCTTCCTATTTTAACCTATTTTACCTATTTTATTATTTTTATTTTT TTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTTCGAATGTTCAAAAAAATAAATTGACTATATCTATTTAT AAAGATTTCTATCACTAATCACTATAATTAACTATCCTATCGTTTTTTTAAAGCTATTAAGCTTGTACTTCTAATAA CTATGTTTTTTGCTATCAACTTAATATGCAAAAAAAAAATTGAATTAAAGAATTTTAATTCATATATAAAATATATA AAATATATGAAATAAAATTGAATTTACGGGCTAGGCGTATACGCCGTTGCTTCAGGCGACGGATACGGATCTTGCGT ACCCGCCTAGAAAATCACAAAGTTGTTTTGTTCGCCTAAAGATGTTGAATTTTATTTTATAATTAGGTATGTAGAAA AAAAACTTATGAACAAAAACGTTATTAATTCTCTTTTTAATTATAAAAATTGTGTTTTATATATTTATATTTATATA AATATAAATATATATTTATAAAGTATAAATATAAGGAGAGATGGCTGAGTGGTCTAAAGCGGCTGATTGCTAATCCG TTGTACAATGTAAATTGTACCGAGGGTTCGAATCCCTCTCTCTCCGATAAAAAAGTGAAACAAAATAAATCTTTTTT ACGAAATCGAAAGTTTAGGGGCGGGAGCAAAATTTAACTTTATGTCGGAATTTTTGTACCAAAAATTCCTCAGGACA AATAAACCAGAGGTTTATTTGTCCGCCAATTTAAATTTTATTTCGTATGTATATGTACAAGCGTTCTTCAGCCCAAA GAACCTCCTCAGTGG
4、中間載體pUC18-chlN的構(gòu)建
將上述已克隆并鑒定的杜氏鹽藻葉綠體chlN基因5'序列及3'序列，分別以 EcoR I/Sac I和Sph I/Hind III雙酶切，連接入質(zhì)粒pUC18的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成中間載體 pUC18-chlN。
實(shí)施例二、葉綠體啟動(dòng)子和終止子元件的克隆和載體構(gòu)建，此處以萊茵衣藻葉綠體 atpA啟動(dòng)子和rbcL終止子元件為例闡明具體步驟。
1、萊茵衣藻的培養(yǎng)
萊茵衣藻生長(zhǎng)在TAP( Tris-acetate-phosphate )液體培養(yǎng)基中，20_25°C，光照強(qiáng)度 為3000 Lux，光照周期為12 h光照/12 h暗培養(yǎng)。TAP液體培養(yǎng)基配方如下
1Tris堿2.42 g，Beijinercke緩沖液5 ml，磷酸鹽緩沖液5 ml，微量元素溶液1 ml，冰醋酸1 ml，調(diào)節(jié)pH值至6. 8-7. 3，加水至1000 ml. 0. 11 MPa滅菌20 min待用。Beijinercke 緩沖液配方
NH4Cl 10 g , MgSO4 · 7H20 4 g, CaCl2 · 2H20 2 g，加水至 1000 ml。磷酸鹽緩沖液配方
K2HPO4 · 3H20 373 g, KH2PO4 144 g，加水至 1000 ml。微量元素溶液配制方法
先分別將4. 4 g的一水硫酸鋅溶于20 ml水中，2. 28 g的硼酸溶于40 ml水中，1. 012 g的二水氯化錳溶于10 ml水中，0. 322 g的六水氯化鈷溶于10 ml水中，0. 314 g的五水硫 酸銅溶于10 ml水中，0.22 g的四水鉬酸銨溶于W ml水中，0.998 g的七水硫酸亞鐵溶于 10 ml水中(臨用前現(xiàn)配)，然后將這些溶液都加于燒杯中煮沸，再加入50 ml 20%的EDTA， 不斷攪拌至全部溶解后，冷卻至70°C，用20%熱的氫氧化鉀溶液調(diào)pH至6. 7，并加水定容為 200 ml，轉(zhuǎn)移溶液至三角燒瓶中，封口后室溫放置7-14天，每天搖動(dòng)一次，待溶液呈紫色并 有銹色沉淀后兩層濾紙過(guò)濾，收集清亮濾液，凍存待用。
2、萊茵衣藻葉綠體DNA的提取
取10 ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的萊茵衣藻培養(yǎng)液，5000 g 4°C離心5 min，細(xì)胞沉淀用 350 μ 1 NET (0· 1 mol/L NaC 1,50 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris · HCl, pH 8. 0)懸浮后， 加入25μ1蛋白酶K(10 mg/ml)、25 μ 1 20% SDS，混勻，55°C水浴2 h后，置于冰上冷卻， 加入200μ 1.5 mol/L乙酸鉀，冰上靜置30 min。12000 g 4°C離心5 min，上清液加入等體 積的酚/氯仿/異戊醇(25: : 1)，抽提兩次，再用等體積的氯仿抽提一次。水相加入2倍 體積的無(wú)水乙醇，混勻后置于_70°C，15 min。12000 g 4°C離心10 min，沉淀用70%乙醇洗 滌去鹽，真空干燥后溶于30 μ 1雙蒸水中。
3、PCR擴(kuò)增衣藻葉綠體atpA基因啟動(dòng)子及rbcL基因終止子
根據(jù)GenBank登錄的萊茵衣藻葉綠體基因組全序列(GenBank登錄號(hào)GQ250046)，合 成如下引物
PatpAl 5' -AGCCGGTACCGACTTTATTAGAGGCAGTGTT-3'； PatpA2 5' -GTGTCCCGGGCATTTTCACTTCTGGAGTGTAT-3'； TrbcLl 5' -CAGAGTCGACAAGCTTGTACTCAAGCTCGTAA-3‘； TrbcL2 5' -TCGACTGCAGGGATCGCACTCTACCGATTGAG-3‘
以上述萊茵衣藻葉綠體基因組DNA為模板，分別以I^atpAl和I^tpA2為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增衣藻葉綠體atpA基因啟動(dòng)子序列；以TrbcLl和TrbcL2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增衣藻葉綠 體rbcL基因終止子序列。PCR反應(yīng)條件為94°C 30 s，55°C 45 s，72°C 45 s，25個(gè)循環(huán)；將產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序。atpA啟動(dòng)子序列 GACTTTATTAGAGGCAGTGTTTATATACCTAAACGTCAAAAGTCATTTTTATAACTGGTCTCAAAATACCTA
TAAACCCATTGTTCTTCTCTTTTAGCTCTAAGAACAATCAATTTATAAATATATTTATTATTATGCTATAATATAAA TACTATATAAATACATTTACCTTTTTATAAATACATTTACCTTTTTTTTAATTTGCATGATTTTAATGCTTATGCTA TCTTTTTTATTTAGTCCATAAAACCTTTAAAGGACCTTTTCTTATGGGATATTTATATTTTCCTAACAAAGCAATCG GCGTCATAAACTTTAGTTGCTTACGACGCCTGTGGACGTCCCCCCCTTCCCCTTACGGGCAAGTAAACTTAGGGATT TTAATGCAATAAATAAATTTGTCCTCTTCGGGCAAATGAATTTTAGTATTTAAATATGACAAGGGTGAACCATTACT TTTGTTAACAAGTGATCTTACCACTCACTATTTTTGTTGAATTTTAAACTTATTTAAAATTCTCGAGAAAGATTTTA AAAATAAACTTTTTTAATCTTTTATTTATTTTTTCTTTTTTATGGCAATGCGTACTCCAGAAGAACTTAGTAATCTT ATTAAAGATTTAATTGAACAATACACTCCAGAAGTGAAAATG rbcL終止子序列
AAGCTTGTACTCAAGCTCGTAACGAAGGTCGTGACCTTGCTCGTGAAGGTGGCGACGTAATTCGTTCAGCTT GTAAATGGTCTCCAGAACTTGCTGCTGCATGTGAAGTTTGGAAAGAAATTAAATTCGAATTTGATACTATTGACAAA CTTTAATTTTTATTTTTCATGATGTTTATGTGAATAGCATAAACATCGTTTTTATTTTTTATGGTGTTTAGGTTAAA TACCTAAACATCATTTTACATTTTTAAAATTAAGTTCTAAAGTTATCTTTTGTTTAAATTTGCCTGTGCTTTATAAA TTACGATGTGCCAGAAAAATAAAATCTTAGCTTTTTATTATAGAATTTATCTTTATGTATTATATTTTATAAGTAAT AAAAGAAATAGTAACATACTAAAGCGGATGTAACTCAATCGGTAGAGTGCGATCC 4、中間載體pUC18-atpA-rbcL的構(gòu)建
將上述已克隆并鑒定的衣藻葉綠體atpA基因啟動(dòng)子及rbcL基因終止子，分別 以Kpn I/Sma I和Ml I/Pst I雙酶切，連接入質(zhì)粒pUC18的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成中間載體 pUC18-atpA-rbcL。
實(shí)施例三、雙選擇標(biāo)記基因序列的克隆與載體構(gòu)建 1、氯霉素抗性選擇標(biāo)記基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因克隆 質(zhì)粒載體pCAT3-Control (Promega公司，GenBank登錄號(hào)U57025. 2)上克隆有氯霉素 抗性選擇標(biāo)記基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因，設(shè)計(jì)引物如下 CATl 5' -GAATCCCGGGATGGAGAAAAAAATCACTGGA-3'； CAT2 5' -ATAAGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTC-3‘
以質(zhì)粒載體pCAT3-Control為模板，PCR擴(kuò)增CAT序列；PCR反應(yīng)條件為94°C 30 s, 55°C 45 s，72°C 45 s，25個(gè)循環(huán)；將產(chǎn)物克隆到pMD18_T載體上，挑選酶切鑒定正確的克 隆進(jìn)行測(cè)序。
CAT基因序列
ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCA TTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAA AAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGG CAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACG TTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTT TCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACG CAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAAT GCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAA
2、除草劑草丁膦抗性選擇標(biāo)記基因bar序列的克隆
質(zhì)粒載體PCAMBIA3301克隆有除草劑草丁膦抗性選擇標(biāo)記bar基因，設(shè)計(jì)引物如下 barl 5' -TTACTCTAGAATGAGCCCAGAACGACGCC-3‘； bar2 5' -AGTTGTCGACTTAGATCTCGGTGACGGGC-3‘
以質(zhì)粒載體PCAMBIA3301為模板，PCR擴(kuò)增bar序列；PCR反應(yīng)條件為94°C 30 s,55°C 45 s，72°C 45 s，25個(gè)循環(huán)；將產(chǎn)物克隆到pMD18_T載體上，挑選酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序。
bar基因序列
ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGACATCCGCCGTGCCACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATC GTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACGGACGACCT CGTCCGTCTGCGGGAGCGCTATCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGACGGCGAGGTCGCCGGCATCGCCTACGCGGGCC CCTGGAAGGCACGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCGGACGGGA CTGGGCTCCACGCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGTCATCGG GCTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCATGCACGAGGCGCTCGGATATGCCCCCCGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCT TCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTG CCCGTCACCGAGATCTAA
3、雙選擇標(biāo)記中間載體pUC18-CAT-BAR的構(gòu)建
將上述已克隆并鑒定的CAT基因序列及bar基因序列，分別以Sma I/BamH I和 Xba I/ Sal I雙酶切后，連接入中間載體pUC18-atpA-rbcL的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)成中間載體 PUC18-CAT-BAR,使氯霉素抗性選擇標(biāo)記CAT基因和除草劑草丁膦抗性選擇標(biāo)記bar基因同 處于衣藻葉綠體atpA基因啟動(dòng)子及rbcL基因終止子之間，構(gòu)成完整的表達(dá)盒。
實(shí)施例四、雙交換雙選擇型杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體pChlN-CAT-BAR的構(gòu)建 將上述構(gòu)建的中間載體pUC18-CAT-BAR，用Mc I/Sph I雙酶切，切下完整的 atpA-CAT-BAR-rbcL表達(dá)盒，插入到中間載體pUC18-chlN的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成載體 pChlN-CAT-BAR，可經(jīng)由chlN基因序列作為同源片段，介導(dǎo)發(fā)生載體序列與杜氏鹽藻葉綠 體基因組間的雙交換型重組，使atpA-CAT-BAR-rbcL表達(dá)盒穩(wěn)定整合到氏鹽藻葉綠體基因 組的chlN基因位點(diǎn)，在atpA啟動(dòng)子和rbcL終止子的調(diào)控下得到高效表達(dá)。
實(shí)施例五、將外源目的基因?qū)臌}藻 1、用電激法將外源目的基因?qū)臌}藻
取培養(yǎng)第5天的鹽藻培養(yǎng)液，1000 rpm離心15 min，棄上清，用含有0. 2 M甘露醇和0.2 M山梨醇液處理后加入電激緩沖液，調(diào)整鹽藻密度在IO8個(gè)/ml。繼之加入終濃度為IOyg/ ml的含外源基因的質(zhì)粒及25 μ g/ml的處精DNA，混勻后，置冰上5_10 min,吸取0. 5 ml置于轟擊小室中待用。電激儀(Backon 2000型)電激時(shí)電壓為9. 5KV，每次電激時(shí)間為0. 05 μ s，次數(shù)為21(1，循環(huán)次數(shù)100次，電激高度2 mm，每次電激間隔時(shí)間為62. 5 S。2、用基因槍法將外源目的基因?qū)臌}藻
取培養(yǎng)第5天的鹽藻培養(yǎng)液，1000 rpm離心15 min，棄上清，用鹽藻培養(yǎng)液將鹽藻密度 調(diào)整在IO8個(gè)/ml，再取0.5 ml鹽藻培養(yǎng)液鋪于含抗生素的固體培養(yǎng)基中央，直徑為3 cm 的圓形有效轟擊范圍內(nèi)，置超凈臺(tái)下吹干待用。在無(wú)菌條件下，用基因槍(Bio-Rad公司產(chǎn)的PDS-1000型)轟擊。具體步驟如下 取50μ1 (60 μ g/ml)金粉懸浮液加入6 μ g含有外源基因的質(zhì)粒以及50 μι 2. 5 M Cacl2*20 μ 1 0. 1 M亞精胺，振蕩3 min, 12000 rpm離心10 s，棄上清。用無(wú)水乙醇洗一 次，振蕩，12000 rpm離心，棄上清，共二次。最后將附有金粉的質(zhì)粒懸浮于60 μ 1無(wú)水乙醇 中。每次轟擊取6-8 μ 1，每皿轟擊3次，轟擊后將培養(yǎng)皿放入鹽藻適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
實(shí)施例六、轉(zhuǎn)化藻株的篩選和鑒定
基因槍轟擊后，用2 ml培養(yǎng)液洗脫瓊脂表面鹽藻，26°C 300 Lux弱光培養(yǎng)8 -12 h，其 后在3000 Lux下光照培養(yǎng)M h。繼之加氯霉素至100 mg/ L，過(guò)渡培養(yǎng)1 -2天后，用培養(yǎng) 液稀釋藻液至IX IO6個(gè)細(xì)胞/ ml，補(bǔ)加氯霉素至終濃度為200 mg/ L，光強(qiáng)4500 Lux進(jìn)行 篩選培養(yǎng)。15天后視情況再加入終濃度2 mg / L-3 mg / L草丁膦進(jìn)行氯霉素、草丁膦雙 蹄選。
權(quán)利要求
1.一種杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，其特征在于是以光非依賴性的原葉綠 素酸酯還原酶chlN、ChlB或者ChlL基因?yàn)橥雌危月让顾匾阴＾D(zhuǎn)移酶CAT基因和除 草劑草丁膦抗性基因bar為篩選標(biāo)記，并以atpA啟動(dòng)子和rbcL終止子為表達(dá)元件構(gòu)建雙 交換雙篩選標(biāo)記的杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，其特征在于杜氏鹽 藻自身chlN、chlB或者chlL基因及其側(cè)翼序列，其長(zhǎng)度為2-41Λ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，其特征在于CAT基因 為主要篩選標(biāo)記基因，而bar基因是輔助篩選標(biāo)記基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法，其特征在于atpA啟 動(dòng)子和rbcL終止子來(lái)源于萊因衣藻葉綠體。
全文摘要
一種杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建，具體是以光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶chlN、chlB或者chlL基因?yàn)橥雌?，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)和除草劑草丁膦(PPT)的抗性基因bar為篩選標(biāo)記，并以atpA啟動(dòng)子和rbcL終止子為表達(dá)元件，構(gòu)建雙交換雙篩選標(biāo)記杜氏鹽藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體。通過(guò)基因槍法或者電激法轉(zhuǎn)化杜氏鹽藻，再經(jīng)兩步法篩選實(shí)現(xiàn)同質(zhì)化，確保外源基因在杜氏鹽藻葉綠體基因組的定點(diǎn)整合，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)化杜氏鹽藻藻株。本發(fā)明選取chlN、chlB或者chlL基因作為同源片段，可作為轉(zhuǎn)化子的輔助篩選標(biāo)記；選擇氯霉素抗性CAT基因和草丁膦抗性bar基因共同作為篩選標(biāo)記基因，有利于在較短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。
文檔編號(hào)C12N15/65GK102121026SQ201010583119
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月11日
發(fā)明者侯桂琴, 曲東京, 李 杰, 潘衛(wèi)東, 薛樂(lè)勛, 賈巖龍 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)