專(zhuān)利名稱(chēng)：一種杠柳次苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種杠柳次苷的制備方法，還涉及一種包含杠柳次苷的提取物及其組合物。
背景技術(shù)：
中藥香加皮(Cortex Periplocae)又名北五加皮，是蘿蘑科植物杠柳(Periploca sepium Punge)的干燥根皮，因其含有強(qiáng)心苷成分，近年來(lái)常用于治療急、慢性充血性心力衰竭。目前對(duì)于香加皮強(qiáng)心苷類(lèi)的研究，由于杠柳毒苷(Periplocin，C36H56O13)在香加皮藥材中含量較高，制備單體化合物相對(duì)容易，故關(guān)注杠柳毒苷較多，而對(duì)杠柳次苷關(guān)注較少。杠柳毒苷結(jié)構(gòu)為杠柳苷元-(D-加拿大麻糖)-(D-葡萄糖)。杠柳次苷 (periplocymarin, C30H46O8)結(jié)構(gòu)為杠柳苷元-(D-加拿大麻糖)，是由杠柳毒苷脫去一分子葡萄糖而生成的次生甲型強(qiáng)心苷。通常甲型強(qiáng)心苷及其苷元的活性/毒性存在如下規(guī)律 苷元<單糖苷>二糖苷>三糖苷[肖崇厚.中藥化學(xué).上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.1997 341]。杠柳次苷為單糖苷，其活性/毒性之所以大于杠柳苷元，是由于其對(duì)心肌細(xì)胞膜上類(lèi)脂質(zhì)的親和力大于苷元；而杠柳毒苷(二糖苷)的活性/毒性之所以小于杠柳次苷，是由于隨著這些分子中糖基數(shù)目的增加，水溶性增大，親脂性降低，與心肌細(xì)胞膜上類(lèi)脂質(zhì)的親和力減弱，強(qiáng)心作用減小。文獻(xiàn)報(bào)道[李章文.杠柳皮(北五加皮)的強(qiáng)心作用.中華醫(yī)學(xué)雜志.1956，7 651]杠柳次苷具有比杠柳毒苷強(qiáng)心作用更快、持續(xù)時(shí)間更短、蓄積作用更小等特點(diǎn)。另外，研究發(fā)現(xiàn)杠柳毒苷與大鼠、人體的腸菌溫孵，會(huì)迅速代謝生成杠柳次苷 [任曉亮，謝躍生，潘桂湘，等.香加皮強(qiáng)心成分杠柳毒苷腸菌代謝研究.天津中醫(yī)藥，2007， 24(6) 515.]；大鼠口服杠柳毒苷，糞便中也主要以杠柳次苷的形式排泄[王強(qiáng)，任曉亮，王焱，等.杠柳毒苷在大鼠體內(nèi)排泄的初步研究.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27(1) :29]。因此，杠柳次苷也應(yīng)是香加皮起強(qiáng)心作用的主要成分之一。對(duì)杠柳次苷進(jìn)行制備，有利于明確中藥香加皮強(qiáng)心物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，以及利于該中藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。默克索引(14版，第1239頁(yè))提到過(guò)杠柳次苷的酶解制備方法用70%乙醇提取希臘杠柳，然后用源自Strophanthus courmonti Saclcux, Apocynaceae種子的毒毛旋花子雙糖酶(enzyme strophanthobiase)處理，然而其中并未提及杠柳毒苷酶解的具體工藝以及工藝效果例如杠柳次苷的收率、純度等。因此提供一種穩(wěn)定、可靠、低毒、和/或可用于工業(yè)化生產(chǎn)的制備杠柳次苷的方法，獲得高純度的杠柳次苷，以供新藥研發(fā)或科學(xué)研究，仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員急于解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有制備杠柳次苷技術(shù)中存在的不足，提供一種穩(wěn)定、可靠、 低毒、和/或可用于工業(yè)化生產(chǎn)的、制備高純度杠柳次苷的方法。本發(fā)明令人意外地發(fā)現(xiàn)， 通過(guò)將含有杠柳毒苷的底物用蝸牛酶進(jìn)行酶解，接著進(jìn)行柱層析和重結(jié)晶，可以以高的純度和/或產(chǎn)率獲得杠柳次苷。本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)而得以完成。發(fā)明概述為此，本發(fā)明第一方面提供了一種制備杠柳次苷的方法，其包括以下步驟(1)使含有杠柳毒苷的底物與蝸牛酶混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解粗提物；(2)使所述酶解粗提物進(jìn)行色譜層析，得到精制提取物；(3)使所述精制提取物從甲醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到杠柳次苷。本發(fā)明第二方面提供了一種包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)包含 80%以上(或者優(yōu)選85%以上，優(yōu)選90%以上)的杠柳次苷。本發(fā)明第三方面提供了一種組合物，包含杠柳次苷或者本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)所述的提取物，并且其中基本上不合杠柳毒苷。發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面提供了一種制備杠柳次苷的方法，其包括以下步驟(1)使含有杠柳毒苷的底物與蝸牛酶混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解粗提物；(2)使所述酶解粗提物進(jìn)行色譜層析，得到精制提取物；(3)使所述精制提取物從甲醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到杠柳次苷。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述底物可以是杠柳毒苷單體、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮藥材、或其組合。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述底物(按杠柳毒苷計(jì)) 與蝸牛酶的重量比為(1 10) 1，優(yōu)選為O 10) 1，優(yōu)選為(5 10) 1。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解反應(yīng)是在pH 3 7 的緩沖液中進(jìn)行的，優(yōu)選的PH為4 6。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液包括但不限于乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖溶液、及其組合。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解反應(yīng)是在20°C 55°C下進(jìn)行的，優(yōu)選的酶解反應(yīng)溫度是30°C 40°C。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解反應(yīng)是在pH 3 7 的緩沖液中、在20°C 55°C下溫孵4h 4 來(lái)進(jìn)行的，優(yōu)選的酶解反應(yīng)時(shí)間為IOh 40h， 更優(yōu)選15h 30h。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解反應(yīng)是通過(guò)加入酶解終止劑來(lái)終止的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解終止劑選自甲醇、乙醇、含有甲醇和 /或乙醇的丙酮、或其組合。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解反應(yīng)在被終止之后，還任選包括用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯或三氯甲烷。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解反應(yīng)在被終止之后，還包括用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，然后將有機(jī)層濃縮和/或干燥的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯或三氯甲烷。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述色譜層析是選自以下的色譜層析方法硅膠柱層析法、大孔樹(shù)脂柱層析法、反相C18柱色譜分離法、高速逆流色譜法、及其組合。
在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述色譜層析是使用硅膠柱層析法，并且采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑作為洗脫液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫液是乙酸乙酯石油醚為(0.5 幻1 (ν/ν)的等度或梯度洗脫液。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述色譜層析是使用大孔樹(shù)脂柱層析法，并且用85 98%乙醇作為洗脫液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大孔樹(shù)脂柱層析法是先用水和20 40%乙醇預(yù)洗除雜，然后用85 98%乙醇洗脫，優(yōu)選用90 98%乙醇洗脫，更優(yōu)選用約95 %乙醇洗脫。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述色譜層析是使用反相 C18柱色譜分離法，并且用(5O 7O) (50 3O)的甲醇水或者用(25 5O) (75 50)的乙腈水作為流動(dòng)相。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述色譜層析是使用高速逆流色譜法，并且酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4 3 2 5 4 3震蕩溶解進(jìn)樣，在溫度30 40°C下進(jìn)行高速逆流色譜。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述步驟(3)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟O)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入適量水而進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中， 其中所述步驟(3)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟O)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入適量水使達(dá)到約50%甲醇的溶劑體系而進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述步驟(3)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟O)的精制提取物溶解于甲醇中，加入適量水，靜置，析出白色針狀結(jié)晶， 以50%甲醇洗滌結(jié)晶，減壓干燥而進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明第一方面所述方法，其包括以下步驟(1)酶解將含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶(1 1 10 Iw/ w)混合，加入pH 3 7的緩沖液，22°C 下溫孵，4h 48h后加入試劑終止酶促反應(yīng)， 用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層濃縮干燥，得酶解粗提物；(2)柱層析將酶解粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，以薄層色譜法監(jiān)測(cè)流份，合并含有杠柳次苷的流份，濃縮干燥，得精制提取物；(3)重結(jié)晶將精制提取物，用甲醇溶解后加入適量水，靜置，析出白色針狀結(jié)晶， 以50%甲醇洗滌結(jié)晶，減壓干燥，得杠柳次苷。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述含杠柳毒苷的底物可以是杠柳毒苷單體或香加皮提取物或香加皮藥材。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶的混合比例優(yōu)選為5 1 10 lw/w。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述緩沖液PH優(yōu)選為 4 6。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述溫孵溫度優(yōu)選為 30°C 40"C。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述溫孵時(shí)間優(yōu)選為 15h 30h。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述終止酶反應(yīng)的試劑為含醇水溶性有機(jī)溶劑(例如甲醇或乙醇或含有甲醇/乙醇的丙酮)。
根據(jù)本發(fā)明第一方面所述方法，其總體收率可達(dá)80%以上，優(yōu)選85%以上，優(yōu)選 90%以上。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟C3)所得產(chǎn)物中含有80% (w/w)以上(或者優(yōu)選85%以上，優(yōu)選90%以上)的杠柳次苷。在本發(fā)明第一方面所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟C3)所得產(chǎn)物中基本上不含杠柳毒苷。本發(fā)明第二方面提供了一種包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)包含 80%以上(或者優(yōu)選85%以上，優(yōu)選90%以上)的杠柳次苷。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中基本上不含杠柳毒苷。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取物是通過(guò)包括以下步驟的制備方法得到的(i)使含有杠柳毒苷的底物與蝸牛酶混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解粗提物；(ii)使所述酶解粗提物進(jìn)行色譜層析，得到精制提取物；(iii)使所述精制提取物從甲醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到包含杠柳次苷的提取物。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述底物可以是杠柳毒苷單體、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮藥材、或其組合。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶的重量比為(1 10) 1，優(yōu)選為O 10) 1，優(yōu)選為(5 10) 1。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述酶解反應(yīng)是在pH 3 7的緩沖液中進(jìn)行的，優(yōu)選的pH為4 6。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述酶解反應(yīng)是在20°C 55°C下進(jìn)行的，優(yōu)選的酶解反應(yīng)溫度是30V 40°C。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述酶解反應(yīng)是在pH 3 7的緩沖液中、在20°C 55°C下溫孵4h 4 來(lái)進(jìn)行的，優(yōu)選的酶解反應(yīng)時(shí)間為IOh 40h，更優(yōu)選15h 30h。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述酶解反應(yīng)是通過(guò)加入酶解終止劑來(lái)終止的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述酶解終止劑選自甲醇、乙醇、含有甲醇和/或乙醇的丙酮、或其組合。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述酶解反應(yīng)在被終止之后，還任選包括用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯或三氯甲烷。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述酶解反應(yīng)在被終止之后，還包括用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，然后將有機(jī)層濃縮和/或干燥的步驟。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯或三氯甲烷。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述色譜層析是選自以下的色譜層析方法硅膠柱層析法、大孔樹(shù)脂柱層析法、反相C18柱色譜分離法、高速逆流色譜法、及其組合。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述色譜層析是使用硅膠柱層析法，并且采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑作為洗脫液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫液是乙酸乙酯石油醚為(0.5 幻1 (ν/ν)的等度或梯度洗脫液。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述色譜層析是使用大孔樹(shù)脂柱層析法，并且用85 98%乙醇作為洗脫液。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述大孔樹(shù)脂柱層析法是先用水和20 40%乙醇預(yù)洗除雜，然后用85 98%乙醇洗脫， 優(yōu)選用90 98%乙醇洗脫，更優(yōu)選用約95%乙醇洗脫。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述色譜層析是使用反相C18柱色譜分離法，并且用(50 70) (50 30)的甲醇水或者用 (25 50) (75 50)的乙腈水作為流動(dòng)相。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述色譜層析是使用高速逆流色譜法，并且酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4 3 2 5 4 3 震蕩溶解進(jìn)樣，在溫度30 40°C下進(jìn)行高速逆流色譜。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述制備方法中，所述步驟(iii)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟(ii)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入適量水而進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述步驟(iii)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟(ii)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入適量水使達(dá)到約50%甲醇的溶劑體系而進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述步驟(iii)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟(ii)的精制提取物溶解于甲醇中，加入適量水，靜置，析出白色針狀結(jié)晶，以50 %甲醇洗滌結(jié)晶，減壓干燥而進(jìn)行的。在本發(fā)明第二方面所述提取物的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述提取物是通過(guò)包括以下步驟的制備方法得到的(i)酶解將含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶(1 1 10 Iw/ w)混合，加入pH 3 7的緩沖液，22°C 下溫孵，4h 48h后加入試劑終止酶促反應(yīng)， 用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層濃縮干燥，得酶解粗提物；(ii)柱層析將酶解粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，以薄層色譜法監(jiān)測(cè)流份，合并含有杠柳次苷的流份，濃縮干燥，得精制提取物；(iii)重結(jié)晶將精制提取物，用甲醇溶解后加入適量水，靜置，析出白色針狀結(jié)晶，以50%甲醇洗滌結(jié)晶，減壓干燥，得杠柳次苷。本發(fā)明第三方面提供了一種組合物，包含杠柳次苷或者本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)所述的提取物，并且其中基本上不含杠柳毒苷。根據(jù)本發(fā)明第三方面的組合物，其中還包含生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明第一方面的各個(gè)實(shí)施方案可以與該方面的一個(gè)或多個(gè)其它實(shí)施方案進(jìn)行任意組合，只要這種組合不會(huì)出現(xiàn)矛盾。當(dāng)然在相互之間組合時(shí)，必要的話可對(duì)相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。對(duì)于本發(fā)明的其它方面的各個(gè)實(shí)施方案亦可以類(lèi)似地進(jìn)行任意組合。下面對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對(duì)這些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)作更詳盡的說(shuō)明和解釋?zhuān)峒暗男g(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“底物”是指可用蝸牛酶進(jìn)行酶解的并且含有杠柳毒苷的任何物質(zhì)，包括，但不限于，杠柳毒苷單體、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮藥材、或其組合。如本發(fā)明第二方面所述的，短語(yǔ)“包含杠柳次苷的提取物”，由于其中杠柳次苷的含量非常高，因此其亦可稱(chēng)為“杠柳次苷”或者“杠柳次苷單體”。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，杠柳次苷在香加皮藥材中含量甚微，如果從藥材中直接分離純化杠柳次苷，難度較大；相對(duì)而言，藥材中杠柳毒苷含量較大，以杠柳毒苷為原料，令其糖苷鍵斷裂后，分離、純化制得杠柳次苷，不失為一種有效的方法。原生苷類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化成次生苷或苷元有以下三種方法化學(xué)降解法、物理降解法和酶解法?；瘜W(xué)降解法包括酸水解、堿水解、氧化降解。物理降解法包括紫外線降解、超聲波降解、熱降解等。本發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)室摸索，發(fā)現(xiàn)杠柳次苷的制備采用酶解法效果較好。默克索引中雖然提到杠柳毒苷酶解制備杠柳次苷，但沒(méi)有提供杠柳毒苷酶解的具體工藝參數(shù)以及其方法所產(chǎn)生的效果。因此本發(fā)明人對(duì)酶解的工藝進(jìn)行了詳盡的考察，包括酶種的選擇、酶解溫度、緩沖鹽的PH、酶解時(shí)間與酶和底物的比例關(guān)系、酶解終止劑的選擇、杠柳次苷的硅膠柱層析洗脫劑、重結(jié)晶所用溶劑等。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)室篩選了包括蝸牛酶以及R. P(I)，R.C⑵，R. S(3)，F(xiàn). 800 (4)， Dx (5)，P. xxL (6)，P. χ (7)，P5. 8 (8).，P5 (9)，PL150 (10)，UXL (11)，UL (12)，188 (13)，S02 (14) 在內(nèi)的共15種酶和植物乳桿菌(1. 555) 1種菌，對(duì)杠柳毒苷C-3位葡萄糖基的水解能力進(jìn)行考察，本發(fā)明人獲得的結(jié)果表明，蝸牛酶效率高、成本低，因此本發(fā)明選取蝸牛酶。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在酶解反應(yīng)中，溫度不僅影響反應(yīng)速度，而且影響酶的活性。當(dāng)溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)使酶活性降低，從而降低反應(yīng)速度。因此，酶反應(yīng)存在一個(gè)最適溫度。另外，大部分酶的活性受環(huán)境PH的影響pH的改變可以破壞酶空間構(gòu)象，引起酶活性的喪失； 還會(huì)影響酶活性中心催化基團(tuán)的解離，使底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的過(guò)程受影響；同時(shí)PH的改變還影響酶活性中心結(jié)合基團(tuán)和底物的解離狀態(tài)，使底物不能與其結(jié)合，或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。因此確定將含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶(1 1 10 lw/w)混合，加入pH 3 7的緩沖液，在22°C 下溫孵。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一定濃度的底物與酶結(jié)合需要一定的時(shí)間，時(shí)間過(guò)短酶與底物不能充分結(jié)合，達(dá)不到最佳酶解效果；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)酶與底物早已結(jié)合充分，再延長(zhǎng)時(shí)間可能因酶解產(chǎn)物在溶液中不穩(wěn)定而造成含量的降低。因此確定溫孵4h 4 后加入試劑終止酶促反應(yīng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，酶解反應(yīng)需適宜的終止劑。參照文獻(xiàn)[J Sunff J, Sha ZF, GaoH. Determination of arctiin and arctigeninin Fructus Arctii byreverse-phase HPLC. Acta Phannaceutica Sinica，1992，27 (7) :549.]方法，考察了在酶解后的水液中加二氯甲烷或氯仿提取杠柳次苷，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，酶的存在易產(chǎn)生嚴(yán)重乳化，難以分層。因此，本發(fā)明人先用甲醇沉淀蝸牛酶終止反應(yīng)，并且溶出杠柳次苷，避免在下一步萃取中出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。本發(fā)明人通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)確定，適宜酶解終止劑是含醇水溶性有機(jī)溶劑(甲醇或乙醇，或用含有甲醇或乙醇的丙酮)，這樣不僅避免了使用毒性較大的溶劑二氯甲烷或氯仿，而且還適合直接用高效液相色譜法進(jìn)行含量和酶解得率的測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明，杠柳毒苷酶解得到的酶解粗提物可用硅膠柱層析得到精制提取物。 將酶解粗提物上樣后，用體積比為0.5 1 5 1的乙酸乙酯-石油醚為洗脫劑，收集合并經(jīng)TLC檢測(cè)呈較深紫紅色斑點(diǎn)的流份(展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-水65 35 10，顯色劑3， 5-二硝基苯甲酸試液)，回收溶劑，減壓真空干燥，得精制提取物。此精制提取物也可用類(lèi)似的方法得到例如大孔樹(shù)脂柱層析、反相C18色譜分離、高速逆流色譜分離中的一種或幾種方法的組合。采用大孔樹(shù)脂吸附分離時(shí)，酶解粗提物經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，用水和20 40% 乙醇預(yù)洗除雜，95%乙醇洗脫，收集95%洗脫部位，收集合并含有強(qiáng)心苷的部位。采用反相 C18色譜分離時(shí)，以體積比為(50 70) (50 30)的甲醇水，或Q5 50) (75 50)的乙腈水為流動(dòng)相，同步采用紫外檢測(cè)器于217 220nm監(jiān)視流出曲線以指導(dǎo)產(chǎn)品收集。采用高速逆流色譜分離時(shí)，酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4 3 2 5 4 3震蕩溶解進(jìn)樣，于溫度30 40°C進(jìn)行高速逆流色譜，流出物經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站記錄，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分。以上收集部位經(jīng)濃縮干燥后得到精制提取物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于杠柳次苷重結(jié)晶的溶劑，比較了乙酸乙酯和甲醇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)杠柳次苷粗提物在乙酸乙酯溶液中加熱不穩(wěn)定，大部分會(huì)轉(zhuǎn)化成杠柳苷元；在50%甲醇中則會(huì)析出白色晶體，這就避免了重結(jié)晶過(guò)程中加熱處理造成成分的變化和損失。經(jīng)3次50% 甲醇結(jié)晶和重結(jié)晶操作后，杠柳次苷純度可達(dá)94%以上。本發(fā)明確定了使用蝸牛酶從杠柳毒苷制備杠柳次苷的方法。與酸水解等化學(xué)方法相比，酶催化水解產(chǎn)物單純，條件溫和，經(jīng)硅膠柱層析純化，3次重結(jié)晶，可得純度達(dá)90%以上的杠柳次苷。采用本發(fā)明所制備的杠柳次苷經(jīng)UV、IR^13C-NMR, H-NMR、MS分析確認(rèn)為杠柳次苷，經(jīng)TLC、HPLC (PDA檢測(cè)器)監(jiān)測(cè)本品純度達(dá)90%以上。


圖1為本發(fā)明實(shí)施圖2為本發(fā)明實(shí)施圖3為本發(fā)明實(shí)施圖4為本發(fā)明實(shí)施圖5為本發(fā)明實(shí)施圖6為本發(fā)明實(shí)施圖7為本發(fā)明實(shí)施
1制備的杠柳次苷的UV圖譜。
1制備的杠柳次苷的頂圖譜。
1制備的杠柳次苷的13C-NMR圖譜。
1制備的杠柳次苷的一級(jí)MS圖譜。
1制備的杠柳次苷的二級(jí)MS圖譜。
1制備的杠柳次苷的TLC圖譜。
1制備的杠柳次苷的HPLC (PDA檢測(cè)器)圖譜。
具體實(shí)施例方式通過(guò)下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。實(shí)施例1
(1)酶解取香加皮提取物(含10%杠柳毒苷)6. 5g，底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶10 1 (w/w)混合，加入pH5. 5的醋酸鹽緩沖液25mL，38°C下溫孵，12h后加甲醇終止酶促反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取3次，每次90mL，合并乙酸乙酯層，濃縮干燥，得酶解粗提物2. 3g。(2)柱層析稱(chēng)酶解粗提物2. Ig,加無(wú)水乙醇溶解樣品，按粗提物硅膠1 2 (w/ w)的比例加硅膠拌樣，上硅膠柱，以乙酸乙酯-石油醚O 1)為洗脫劑，每20mL為一份，收集經(jīng)TLC檢測(cè)呈較深紫紅色斑點(diǎn)的流份(展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-水65 35 10，顯色劑 3,5- 二硝基苯甲酸試液)，合并30 80份，回收溶劑，減壓真空干燥，得精制提取物0. Sg。(3)重結(jié)晶取精制提取物0.8g，加甲醇使溶解，加水適量，于4°C靜置12h以上， 析出白色結(jié)晶，以50%甲醇洗滌結(jié)晶，減壓干燥，得白色結(jié)晶0.4g。三個(gè)步驟的總收率約 92. 3%。(4)結(jié)構(gòu)與純度檢測(cè)對(duì)步驟(3)所得白色結(jié)晶進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)A.紫外UV掃描在218nm處有最大吸收峰，具有Δα’0五元內(nèi)酯環(huán)的強(qiáng)心苷特征吸收。見(jiàn)圖1。B.紅外IR分析在3600 3200CHT1處有典型的羥基吸收峰，在1782，1741和1631 的吸收顯示為3-取代-八0，β-γ-內(nèi)酯的吸收峰。見(jiàn)圖2。C.核磁匪R 分析匪R δ H 0. 883H(s) ,0. 933H(s) ,3. 303H(s) ,4. 151H(m), 4. 902H(s)，5· 901H(s)，說(shuō)明母核為杠柳苷元。NMR δ H :4. 82dd，2. 20ddd，3. 61q，3. 2dd, 3. 44dq, 1. 22dd,NMR δ C :96. 79，34. 44，77. 72，72. 94，70. 12，17. 22，56. 73 說(shuō)明有加拿大麻
糖的存在。見(jiàn)圖3、表1。D.質(zhì)譜 MS 分析m/z :535. 3 [M+H]+，552. 4 [M+NHJ+，391. 2 [M-C6H8OJ+, 373. 3 [M-C6H8O4-H2O]+，355. 3 [M-C6H804-2H20]+，337. 3 [M-C6H804-3H20]+，推算該化合物的分子式為C3QH4608。見(jiàn)圖4和5。經(jīng)分析確認(rèn)為杠柳次苷。(5)對(duì)步驟(3)所得白色結(jié)晶進(jìn)行純度分析A. TLC 在高效硅膠板上點(diǎn)樣2 μ g 100 μ g，氯仿甲醇水=13 3 2下層展開(kāi)，用3，5-二硝基苯甲酸/5% NaOH醇液或10%硫酸乙醇顯色，只見(jiàn)單一紫紅色/黑色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖6。B. HPLC (PDA檢測(cè)器)用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行60min色譜及200nm 400nm光譜圖采集，除溶劑峰外僅見(jiàn)一單峰，用光譜進(jìn)行該峰峰純度檢查，提示為單一化合物。見(jiàn)圖 7。經(jīng)檢測(cè)制備的杠柳次苷純度為98%，并且未檢測(cè)到杠柳毒苷。表1所制備杠柳次苷的13C-NMR數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種制備杠柳次苷的方法，其包括以下步驟(1)使含有杠柳毒苷的底物與蝸牛酶混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解粗提物；(2)使所述酶解粗提物進(jìn)行色譜層析，得到精制提取物；(3)使所述精制提取物從甲醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到杠柳次苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于以下(a)至(h)中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)(a)所述底物可以是杠柳毒苷單體、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮藥材、或其組合；(b)所述底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶的重量比為(1 10) 1 ；(c)所述酶解反應(yīng)是在pH3 7的緩沖液中進(jìn)行的；(d)所述酶解反應(yīng)是在20°C 55°C下進(jìn)行的；(e)所述酶解反應(yīng)是在pH3 7的緩沖液中、在20°C 55°C下溫孵4h 4 來(lái)進(jìn)行的；(f)所述酶解反應(yīng)是通過(guò)加入酶解終止劑來(lái)終止的；(g)所述酶解反應(yīng)在被終止之后，還任選包括用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取的步驟；(h)所述酶解反應(yīng)在被終止之后，還包括用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，然后將有機(jī)層濃縮和/ 或干燥的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述色譜層析是選自以下的色譜層析方法硅膠柱層析法、大孔樹(shù)脂柱層析法、反相C18柱色譜分離法、高速逆流色譜法、及其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于以下(a)至(e)中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)(a)所述色譜層析是使用硅膠柱層析法，并且采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑作為洗脫液；(b)所述色譜層析是使用大孔樹(shù)脂柱層析法，并且用85 98%乙醇作為洗脫液；(c)所述色譜層析是使用反相C18柱色譜分離法，并且用(50 70) (50 30)的甲醇水或者用05 50) (75 50)的乙腈水作為流動(dòng)相；(d)所述色譜層析是使用高速逆流色譜法，并且酶解粗提物用氯仿-甲醇-水 4 3 2 5 4 3震蕩溶解進(jìn)樣，在溫度30 40°C下進(jìn)行高速逆流色譜；(e)所述步驟C3)的重結(jié)晶過(guò)程是使步驟( 的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入適量水而進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其包括以下步驟(1)酶解將含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷計(jì))與蝸牛酶(1 1 10 lw/w)混合，加入pH 3 7的緩沖液，22°C 下溫孵，4h 4 后加入試劑終止酶促反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層濃縮干燥，得酶解粗提物；(2)柱層析將酶解粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，以薄層色譜法監(jiān)測(cè)流份，合并含有杠柳次苷的流份，濃縮干燥，得精制提取物；(3)重結(jié)晶將精制提取物，用甲醇溶解后加入適量水，靜置，析出白色針狀結(jié)晶，以 50%甲醇洗滌結(jié)晶，減壓干燥，得杠柳次苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟C3)所得產(chǎn)物中含有80% (w/w)以上的杠柳次苷，和/或步驟C3)所得產(chǎn)物中基本上不含杠柳毒苷。
7.一種包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)包含80%以上(或者優(yōu)選85%以上，優(yōu)選90%以上)的杠柳次苷。
8 根據(jù)權(quán)利要求7的提取物，其中基本上不含杠柳毒苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的提取物，其是通過(guò)包括以下步驟的制備方法得到的 (i)使含有杠柳毒苷的底物與蝸牛酶混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解粗提物； ( )使所述酶解粗提物進(jìn)行色譜層析，得到精制提取物；(iii)使所述精制提取物從甲醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到包含杠柳次苷的提取物； 進(jìn)一步地，上述步驟(i)至(iii)各自獨(dú)立地具有說(shuō)明書(shū)第二方面任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案所述的特征。
10.一種組合物，其包含杠柳次苷或者權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的提取物，并且其中基本上不含杠柳毒苷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備杠柳次苷的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明第一方面涉及一種制備杠柳次苷的方法，其包括以下步驟(1)使含有杠柳毒苷的底物與蝸牛酶混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解粗提物；(2)使所述酶解粗提物進(jìn)行色譜層析，得到精制提取物；(3)使所述精制提取物從甲醇和水的混合物中重結(jié)晶，得到杠柳次苷。本發(fā)明還提供了一種包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)包含80％以上的杠柳次苷。本發(fā)明還提供了以及包含杠柳次苷的組合物。本發(fā)明制備的杠柳次苷純度高，制備方法低毒、簡(jiǎn)便、可靠、和/或適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/56GK102154417SQ201010583339
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者劉二偉, 劉虹, 潘桂湘, 王怡, 高秀梅 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)