專利名稱：一種超分子自組裝生物芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，尤其涉及一種超分子自組裝生物芯片，所述生物芯片通過與表面等離子共振傳感器結(jié)合可進行生化檢測。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)是近年來生命科學(xué)與微電子學(xué)相互交叉滲透發(fā)展起來的一門新技術(shù)。隨著人類基因組計劃(HGP)研究的不斷突破，這門技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因診斷、功能基因研究、基因組文庫圖型分析、疾病診斷、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、免疫檢測、新藥的研究與開發(fā)、 法醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。生物芯片技術(shù)主要通過表面化學(xué)修飾，進而建立各種陣列化的基因或蛋白質(zhì)芯片，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸及其它生物組分的準確、快速、大信息量檢測，具有高度平行性、多樣性、微型化和自動化的特點。它有諸多其它檢測方法難以比擬的優(yōu)越性，但因問世與使用時間較短，目前仍有一定的局限性，表現(xiàn)在空間結(jié)構(gòu)較為單一，絕大部分為二維表面，固定基因或蛋白數(shù)量有限；非特異性吸附明顯，大大降低了檢測的準確性； 一個芯片上多種探針的最適條件頗不一致，增大了芯片的制作難度及測定誤差等等。表面等離子共振生物傳感器是近年迅速發(fā)展起來的高靈敏度的光學(xué)傳感器，因其能實時監(jiān)測生物分子的相互作用，且具有免標記、高靈敏度、快捷簡便，重復(fù)性高等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥物篩選、臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，并顯示出廣闊的應(yīng)用前景。表面等離子共振生物傳感器檢測的基本原理是一束入射光照射到金屬表面因波矢相匹配產(chǎn)生等離子共振，導(dǎo)致反射光強度的衰減，反射光強度衰減程度與入射角和金屬表面生物物質(zhì)分子性質(zhì)及數(shù)量相關(guān)，通過檢測反射光的變化來研究生物分子的相互作用。 1960年，研究人員首次提出了表面等離子體激元現(xiàn)象，由瑞典LinkGping理工學(xué)院應(yīng)用物理實驗室Liedberg等人于1983年將其應(yīng)用于IgG蛋白質(zhì)與其抗原相互作用的測定中，開始了其在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。1990年，瑞典的Wmrmacia公司推出第一代商業(yè)化SPR儀器， 且至今一直占據(jù)該類儀器世界市場最大份額。表面等離子共振生物傳感器包括光機電和芯片兩大核心部件，其中耗材性芯片最為關(guān)鍵。目前最常用的芯片主要有二維直鏈硫醇自組裝單分子層和Biacore研發(fā)的三維羧化的葡聚糖表面，二維表面多為末端帶巰基和功能基團，如-C00H、-NH2等的烷烴或PEG。此類表面結(jié)構(gòu)簡單，尤其是PEG結(jié)構(gòu)表面阻抗蛋白非特異性吸附的性能較好，但是蛋白固定量少，檢測靈敏度低，應(yīng)用范圍有限。Wiarmacia公司開發(fā)的三維羧化的葡聚糖表面目前應(yīng)用最多，其制備方法在文獻JtefanL0fAS*and Bo Johnsson ；Journal of the chemical Society, ChemicalCommunications，1990，116· 1 1526-1528中有詳細報道，此芯片是在金表面通過末端為羥基的硫醇形成自組裝單層膜，然后修飾上一層羧基化的葡聚糖，從而增加其比表面積，用于固定更多的信號分子，提高檢測靈敏度。但是該方法中使用的葡聚糖為交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)單一，對生物信號分子的固定形式影響很大，功能基團的密度和種類受到很大的限制，衍生難度大；對防止蛋白質(zhì)非特異性吸附的性能也不佳；而且制作步驟繁多，制作中使用了毒性較大的環(huán)氧氯丙烷，芯片的可控性、重復(fù)性、安全性都受到了限制，成本昂貴，致使實驗成本過高，很多單位的Biacore 儀器處于閑置狀態(tài)。但是這一技術(shù)具有巨大理論價值和實用性能，其發(fā)展前景十分廣闊，所以急迫需要開發(fā)新型三維結(jié)構(gòu)芯片表面，用以克服目前芯片存在的問題，構(gòu)建更多結(jié)構(gòu)新穎的生物芯片，以滿足各種目的生化檢測的需要。超分子組裝從1987年LEHHN提出超分子的概念而獲諾貝爾獎以來獲得了長足的發(fā)展。作為用于將修飾生物芯片表面的功能分子固定到金屬表面的各種單分子自組裝技術(shù)于20世紀80年代報道出來，因為其能和基底牢固結(jié)合，組裝分子可控且取向有序排列，外表面性質(zhì)及厚度均可控，得到了廣泛的應(yīng)用。1990年日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)α-環(huán)糊精可包合于 PEG長鏈上而形成(準)聚輪烷“分子項鏈”，此后對于環(huán)糊精與各種長鏈的包合有很多研究，包括β-環(huán)糊精與聚丙二醇的包合，Y-環(huán)糊精與PEG的包合、各種嵌段、支化和超支化形式的PEG或PPG與環(huán)糊精的包合及聚酯、聚醚、聚硅氧烷等與環(huán)糊精的包合等，并研究了這些包合產(chǎn)物在藥物釋放、酶模型等方面中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明選擇單分子自組裝技術(shù)修飾芯片基材表面，并結(jié)合功能化的環(huán)糊精包合鏈狀分子來構(gòu)建新型三維結(jié)構(gòu)的芯片，以獲得性能更優(yōu)越、功能更強大的生物芯片，來為基因診斷、功能基因研究、基因組文庫圖型分析、疾病診斷、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、免疫檢測、新藥研究與開發(fā)提供強有力的工具。本發(fā)明的一個目的是提供一種基于分子自組裝的生物芯片，所述生物芯片基于超分子自組裝三維結(jié)構(gòu)，可高效應(yīng)用于生物分子尤其是蛋白質(zhì)的檢測。本發(fā)明的另一個目的是提供所述生物芯片的制備方法。本發(fā)明的又一個目的是提供所述生物芯片的應(yīng)用。用于實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種超分子自組裝生物芯片，其中所述生物芯片包括基底 (1)，固定于基底表面的第一鏈狀分子C3)，以及固定于基底表面且其在基底上的固定位置與第一鏈狀分子在基底上的固定位置相間隔的第二鏈狀分子，其中第一鏈狀分子的相對遠離基底的一端部分被環(huán)糊精( 包合，所述環(huán)糊精包含能夠直接或間接結(jié)合蛋白質(zhì)分子的功能基團，并且第二鏈狀分子的長度不長于第一鏈狀分子的長度。其中，在上述生物芯片中，所述第一鏈狀分子與第二鏈狀分子的摩爾比例為 1 0 1 10000，優(yōu)選為大于1 0且小于等于1 10000，進一步優(yōu)選為50 1 1 50。優(yōu)選地，所述基底的材料選自金屬，例如金、銀、鉬、銅、鋁和鉻；金屬氧化物，例如 Al2O3^TiO2和SnO2 ；以及Si、玻璃、石英和高分子聚合物中的一種或多種；優(yōu)選為金、銀、Si、 玻璃或石英。所述環(huán)糊精可以選自α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和Y-環(huán)糊精中的一種或多種， 且所述環(huán)糊精包含的功能基團可為一種或多種能與蛋白分子發(fā)生鍵合作用的基團，優(yōu)選自-C00H、-NH2, -SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、 N-羥基琥珀酰亞胺和-CHO的取代功能基團；優(yōu)選地，所述取代功能基團在環(huán)糊精上的取代度為1 12，例如1 5。
在上述生物芯片，所述第一鏈狀分子可為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物、聚酯、聚醚、聚硅氧烷及鏈狀脂肪烴中的一種或多種，優(yōu)選為聚乙二醇、聚丙二醇以及聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物的一種或多種；所述第二鏈狀分子選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物、聚酯、聚醚、聚硅氧烷以及鏈狀脂肪烴中的一種或多種，優(yōu)選為聚乙二醇、聚丙二醇以及聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物的一種或多種；優(yōu)選地，在第一鏈狀分子相對遠離基底的一端具有能夠直接或間接結(jié)合蛋白質(zhì)分子的功能基團，所述功能基團選自-C00H、-NH2, -SH、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、-CHO, NTA-螯合基團、-OH、CH3和-OCH3中的一種或多種。在上述生物芯片，所述第一和第二鏈狀分子通過一種或多種選自單巰基、雙巰基、 羧基、氨基和氨基硅烷固定基團固定于基底。優(yōu)選地，所述第一鏈狀分子的分子量為400 50000 ；所述第二鏈狀分子的分子量為 50 10000。另一方面，本發(fā)明提供上述生物芯片的制備方法，該制備方法包括以下步驟將第一鏈狀分子和預(yù)先封端或長度短至無法被環(huán)糊精包合的第二鏈狀分子混合均勻后固定于基底，并以環(huán)糊精包合第一鏈狀分子。其中，對第二鏈狀分子封端的方法很多，只要采用能與其末端反應(yīng)且分子體積能足夠大以阻止環(huán)糊精包合的分子都可以，如參考文獻The molecular necklacea rotaxanecontaining many threaded α -cyclodextrins. Akira Harada, Jun Li&MikiharuKamachi. nature,1992 等。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟1)選擇基底，進行相應(yīng)的表面處理使其適合制備超分子自組裝的生物芯片；2)選擇一端含固定基團的適合的第一鏈狀分子和第二鏈狀分子，并配制兩種鏈狀分子的混合溶液，其中，所述第二鏈狀分子的長度短至無法被環(huán)糊精包合或者混合前預(yù)先在另一端進行封端；3)室溫下配制含功能基團的一定濃度的環(huán)糊精溶液，過濾，去掉溶液中的雜質(zhì)； 其中所述環(huán)糊精溶液優(yōu)選為飽和濃度的環(huán)糊精水溶液；4)使步驟幻中的鏈狀分子固定于基底，形成包含兩種鏈狀分子組成的自組裝分子層；之后，將修飾后的基底與步驟幻中的環(huán)糊精溶液反應(yīng)，使環(huán)糊精與第一鏈狀分子形成包合產(chǎn)物；5)用水清洗未固定到表面的鏈狀分子及未包合的環(huán)糊精，干燥獲得的生物芯片并保存?zhèn)溆?；進一步優(yōu)選地，步驟幻中的第一鏈狀分子的另一端經(jīng)修飾含功能基團。優(yōu)選地，步驟2、中第二鏈狀分子封端時采用的封端劑為Z型酪氨酸(Z-Tyr)和/ 或2. 4-二硝基氟苯。優(yōu)選地，所述方法中的步驟4)按以下操作進行首先，將帶有一定形狀的凹槽里注滿特定比例的步驟2、中鏈狀分子的混合液，然后將基底倒置壓在此槽上，使溶液與基底表面充分接觸，或?qū)⒒捉萑胩囟ū壤牟襟E 2)中鏈狀分子的混合液里，或用芯片打印機在基底上打印指定數(shù)目的特定比例的步驟2) 中鏈狀分子的混合液點，然后清洗，使其在指定區(qū)域形成一層均勻致密的鏈狀結(jié)構(gòu)的自組裝分子層；此操作在一定溫度下，優(yōu)選0 10°C進行，并孵育1小時以上，進一步優(yōu)選4°C孵育1 12小時；之后，將帶有一定形狀的凹槽里注滿步驟幻中的環(huán)糊精水溶液，然后將上述基底倒置壓在此槽上，使溶液與基底指定表面充分接觸，或?qū)⑸鲜龌捉萑肱渲坪玫牟襟E3) 中的環(huán)糊精溶液中，或?qū)⒉襟E幻中的環(huán)糊精溶液滴加在打印好的上述基底表面，使溶液完全覆蓋打印的點，使環(huán)糊精與第一鏈狀分子形成包合產(chǎn)物；優(yōu)選地，此操作在一定溫度下， 優(yōu)選0 10°C進行，并孵育1小時以上，進一步優(yōu)選4°C孵育4 48小時。本發(fā)明還提供上述生物芯片的另一種制備方法，該制備方法包括以下步驟將第一鏈狀分子與環(huán)糊精包合后與第二鏈狀分子混合均勻，然后將混合物固定于基底。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟1)選擇基底，采取本領(lǐng)域已知技術(shù)進行相應(yīng)的表面處理使其適合制備超分子自組裝的生物芯片；2)配制含功能基團的環(huán)糊精溶液(可由匈牙利的CYCLOLABCyclodextrinResear ch&Development Laboratory Ltd.提供或特制)，向該溶液中加入相應(yīng)要包合的一端含固定基團的第一鏈狀分子，產(chǎn)生包合產(chǎn)物，其中所述環(huán)糊精溶液優(yōu)選為飽和濃度的環(huán)糊精水溶液；此操作在一定溫度下，優(yōu)選室溫進行，并攪拌1小時以上，進一步優(yōu)選攪拌1 M小時，之后將包合產(chǎn)物提純干燥；或者，配制不含功能基團的一定濃度環(huán)糊精溶液，向該溶液中加入相應(yīng)要包合的一端含固定基團的第一鏈狀分子，產(chǎn)生包合產(chǎn)物，其中所述環(huán)糊精溶液優(yōu)選為飽和濃度的環(huán)糊精水溶液；此操作在一定溫度下，優(yōu)選室溫進行，并攪拌1小時以上，進一步優(yōu)選攪拌1 M小時，之后加入特定溶液將環(huán)糊精功能化使之含功能基團，并將包合產(chǎn)物提純干燥；優(yōu)選地，所述包合產(chǎn)物產(chǎn)生后，先加入相適應(yīng)的封端劑如ζ型酪氨酸(Z-Tyr) 和/或2，4_ 二硝基氟苯對第一鏈狀分子進行封端，再進行功能化使環(huán)糊精含功能基團，其中封端可參考參考文獻 1. The molecular necklace: a rotaxane containing many threaded α -cyclodextrins. Akira Harada, Jun Li&Mikiharu Kamachi. nature， 1992 ；2. Functional Cyclodextrin Polyrotaxanesfor Drug Delivery. Nobuhiko Yui, RyoKatoono，and Atsushi Yamashita. Adv Polym Sci,20088.。3)將環(huán)糊精和第一鏈狀分子的包合產(chǎn)物溶解，然后與第二鏈狀分子以一定比例混合，該第二鏈狀分子一端含固定基團；4)使步驟幻中的鏈狀分子混合物固定于基底，形成包含兩種鏈狀分子的自組裝分子層；5)用水清洗未固定到表面的鏈狀分子，干燥獲得的生物芯片并保存?zhèn)溆茫贿M一步優(yōu)選地，步驟幻中的第一鏈狀分子的另一端經(jīng)修飾含功能基團。優(yōu)選地，所述方法步驟4)按以下操作進行將帶有一定形狀凹槽里注滿步驟幻制備的混合液，然后將基底倒置壓在此槽上， 使溶液與基底處理過的表面充分接觸，或?qū)⒒捉萑胍欢坎襟E幻制備的混合液里，或用芯片打印機在基底上打印指定數(shù)目的步驟幻制備的混合液點使其在指定區(qū)域形成一層均勻致密的自組裝分子層；此操作在一定溫度下，優(yōu)選O 10°C進行，并孵育1小時以上， 進一步優(yōu)選4°C孵育1 12小時。
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再一方面、本發(fā)明提供上述生物芯片的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述生物芯片用于蛋白質(zhì)的檢測。以下是本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明采用環(huán)糊精與第一鏈狀分子包合而成的(準)聚輪烷及第二鏈狀分子的混合物修飾芯片表面，結(jié)合了傳統(tǒng)葡聚糖表面優(yōu)于二維表面能固定更多蛋白的特性，表面功能基團種類多樣，三維空間結(jié)構(gòu)疏密可控，且可引入聚乙二醇和聚丙二醇及其嵌段共聚物同時降低蛋白質(zhì)非特異性吸附，從而提高了檢測的靈敏度、檢測限和準確性，在此表面的基礎(chǔ)上還可構(gòu)建更復(fù)雜新穎的表面結(jié)構(gòu)，為不同目的的生化檢測提供更廣闊的選擇空間，體現(xiàn)了優(yōu)越的綜合性能，深度開發(fā)的潛力很大。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明提供了一種基于環(huán)糊精和第一鏈狀分子包合形成的(準)聚輪烷超分子自組裝層的生物芯片，如圖2所示，其包括基底1和修飾于基底上的自組裝層，自組裝層包括環(huán)糊精2與第一鏈狀分子3包合形成的(準)聚輪烷部分和第二鏈狀分子部分4。所述的基底可為金屬類如金、銀、鉬、銅、鋁、鉻，金屬氧化物類如A1203、TiO2, SnO2, Si，玻璃，石英，高分子聚合物以及前述幾種基材以各種形式復(fù)合而成的基材；所述的環(huán)糊精可為α -環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、Y -環(huán)糊精；環(huán)糊精上含功能基團，該功能基團可為-C00H、-NH2, -SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、-CHO ；功能基團在環(huán)糊精上的取代度為1-12，環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)圖見圖3。所述的第一鏈狀分子為聚乙二醇、聚丙二醇或聚乙二醇聚丙二醇的嵌段共聚物， 其一端含可固定于基底的基團，如單巰基、雙巰基、羧基、氨基、氨基硅烷；另一端含功能基團如-C00H、-NH2, -SH、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、-CH0、NTA-螯合基團、-OH、-CH3、-0CH3 ；分子量為 400-50000 ；所述的第二鏈狀分子為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物或脂肪鏈，其一端含可固定于基底的基團，如單巰基、雙巰基、羧基、氨基、氨基硅烷；另一末端功能基團可為-OH、-CH3、-0CH3、-C00H、-ΝΗ2、-SH、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、-CH0、NTA-螯合基團；分子量為50-10000 ；所述的第一鏈狀分子和第二鏈狀分子的摩爾數(shù)比為1:0-1: 10000。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，本發(fā)明提供了上述基于環(huán)糊精超分子自組裝的生物芯片的制備方法，包括如下步驟1)選擇基材，進行相應(yīng)的表面處理，作為預(yù)備芯片以備有機分子自組裝用；用乙醇和水清洗多次，吹干并在氮氣中保存?zhèn)溆茫?)配制含不同功能基團的一定濃度的(優(yōu)選飽和的)環(huán)糊精水溶液，過濾，去掉溶液中的雜質(zhì)；3)分別配制一端含能固定到基材的基團的第一鏈狀分子和第二鏈狀分子的溶液， 及特定摩爾比例的鏈狀分子的混合溶液，溶劑可為水、PBS等；4)使環(huán)糊精和第一鏈狀分子包合形成(準)聚輪烷，與第二鏈狀分子以一定比例混合，通過共價鍵固定到預(yù)備芯片表面，用水清洗未固定到表面的鏈狀分子及未包合到第一鏈狀分子上的環(huán)糊精，晾干并在氮氣中保存?zhèn)溆谩?br> 所述制備方法的第1步中，選擇不同的基材可有不同的處理方法，如基材為金、 銀、鉬或它們包被其他材料的復(fù)合基材，可用MV/Ozone清洗機進行臭氧紫外線清洗，除去表面雜質(zhì)，或用乙醇、水多次清洗，后氮氣吹干保存，含巰基的分子可通過金屬與硫形成的共價鍵固定在表面；如基材為玻璃、石英、高分子聚合物等，可用乙醇、水清洗，用等離子體轟擊進行表面活化固定有機分子；如基材為金屬氧化物，可對其表面處理，使在其表面形成一層親水氧化膜，使含羧基的有機分子和其表面的羥基反應(yīng)進而得到固定。所述制備方法的第4步可按如下兩種方案進行方案一1)將帶有一定形狀凹槽的聚二甲基硅氧烷(PDMS)槽(結(jié)構(gòu)示意圖見圖4)里注滿特定比例的兩種鏈狀分子的混合液，然后將裸金芯片壓在此PDMS上，倒置，使溶液與芯片金膜表面充分接觸，或?qū)⒙憬鹦酒萑胍欢ū壤逆湢罘肿踊旌弦豪铮蛴眯酒蛴C在裸金芯片上打印指定數(shù)目的一定比例的鏈狀分子的混合液點，指定溫度如4°C孵育1小時以上，使其在指定區(qū)域形成一層均勻致密的有兩種鏈狀分子的自組裝分子層；將芯片取下或取出后用去離子水、乙醇反復(fù)清洗多次，將未固定到金表面的化合物清洗掉。2)將帶有一定形狀凹槽的PDMS槽里注滿含不同功能基團的環(huán)糊精飽和水溶液， 然后將上述芯片壓在此PDMS上，倒置，使溶液與芯片金膜表面充分接觸，或?qū)⑸鲜鲂酒萑肱渲坪玫暮煌δ芑鶊F的環(huán)糊精溶液中，或?qū)h(huán)糊精溶液滴加在打印好的上述芯片表面，使溶液完全覆蓋打印的點，指定溫度如室溫孵育至少1小時以上；然后取出或取下芯片用二次水清洗若干次，晾干，在氮氣中保存?zhèn)溆?。方案?)取適量配制好的含不同功能基團的一定濃度的(優(yōu)選飽和的)環(huán)糊精的溶液， 將相應(yīng)要包合的第一鏈狀分子固體或用其配制成的適量的溶液加入到一定濃度的(優(yōu)選飽和的)環(huán)糊精溶液中，室溫攪拌1小時以上，使產(chǎn)生包合產(chǎn)物，后如需要可加入相適應(yīng)的封端劑如ζ型酪氨酸(Z-Tyr)，提純干燥后，將其溶解于特定溶液，與第二鏈狀分子以一定比例混合；或取適量配制好的未功能化的一定濃度的(優(yōu)選飽和的)環(huán)糊精溶液，將相應(yīng)要包合的第一鏈狀分子固體或用其配制成的適量的溶液加入到一定濃度的(優(yōu)選飽和的)環(huán)糊精溶液中，室溫攪拌1小時以上，使產(chǎn)生包合產(chǎn)物，后如需要可加入相適應(yīng)的封端劑如Z 型酪氨酸(Z-Tyr)，再加入特定溶液將環(huán)糊精功能化后，提純干燥，將其溶解于特定溶液與第二鏈狀分子以一定比例混合；2)將帶有一定形狀凹槽的PDMS槽里注滿上述制備的混合液，然后將裸金芯片壓在此PDMS上，倒置，使溶液與芯片金膜表面充分接觸，或?qū)⒙憬鹦酒萑胍欢可鲜鲋苽涞幕旌弦豪?，或用芯片打印機在裸金芯片上打印指定數(shù)目的上述制備的混合液點，指定溫度如4°C孵育1小時以上，使其在指定區(qū)域形成一層均勻致密的有第二鏈狀分子及(準) 聚輪烷結(jié)構(gòu)的自組裝分子層；將芯片取下或取出后用去離子水、乙醇反復(fù)清洗多次，將未固定到金表面的化合物清洗掉。此外，本發(fā)明還提供了一種基于環(huán)糊精超分子自組裝的生物芯片進行表面等離子體共振免疫檢測的方法，具體檢測步驟如下1)選擇金屬包覆的玻璃為基底，先在玻璃基片的一個表面上蒸鍍或濺射l-2nm鉻膜，再在鉻膜上蒸鍍或濺射45-55nm厚的金膜，制備成裸金芯片；
2)按照前述方法制備環(huán)糊精超分子組裝的生物芯片，選擇環(huán)糊精和第一鏈狀分子末端功能基團一致為-COOH或-NH2 ；3)將芯片固定在Sra儀器上，通入PH = 7. 4的PBS緩沖液穩(wěn)定基線并開始進行實時監(jiān)測；4)通入EDC\NHS (NHSS)或戊二醛對芯片表面羧基或氨基進行活化，通入PH = 7. 4 的PBS緩沖液清洗；5)通入一定濃度的抗原或抗體進行表面包被，后通入PBS以較高流速清洗未固定到表面的抗原或抗體以及未被蛋白分子封端的第一鏈狀分子上的環(huán)糊精；6)通入乙醇胺或牛血清白蛋白封閉未被固定上抗原或抗體的功能基團，通入PBS 緩沖液清洗；7)檢測抗體或抗原檢測樣本，通入PBS緩沖液清洗；8)采用一定濃度的NaOH溶液或磷酸溶液重生，備再次使用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點首先，本發(fā)明的生物芯片表面的自組裝層采用了環(huán)糊精與第一鏈狀分子包合而成的(準)聚輪烷及第二鏈狀分子，三維空間結(jié)構(gòu)疏密可控、結(jié)構(gòu)多變，比二維表面能固定更多的檢測分子如蛋白質(zhì)分子；其次，在本發(fā)明的生物芯片中可引入聚乙二醇和聚丙二醇及其嵌段共聚物，可以降低蛋白質(zhì)非特異性吸附，并且表面功能基團種類多樣，為不同目的的檢測提供了更廣闊的選擇空間，從而提高了檢測的靈敏度、檢測限和準確性；再次，在本發(fā)明的生物芯片表面基礎(chǔ)上還可構(gòu)建更復(fù)雜新穎的表面結(jié)構(gòu)，為不同目的的生化檢測提供更廣闊的選擇空間，體現(xiàn)了優(yōu)越的綜合性能，深度開發(fā)的潛力很大， 為基因診斷及研究、免疫檢測、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、疾病診斷和藥物篩選等提供了強有力的工具。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明，其中圖1為本發(fā)明所述的表面等離子共振成像儀(SPRI)的工作原理示意圖。其中1為芯片；2為入射光；3為反射光檢測器CXD ；4為棱鏡；5為流通池；6為檢測樣本。圖2為本發(fā)明所述基于環(huán)糊精的超分子自組裝生物芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為基底，2為環(huán)糊精，3為第一鏈狀分子，4為第二鏈狀分子。圖3為本發(fā)明所涉及的環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為本發(fā)明所述的用于制備芯片的由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的槽的結(jié)構(gòu)示意圖，其中A、B.....N表示槽的次序數(shù)。圖5為本發(fā)明實施例1所述的通過SPRI進行人IgG和羊抗人IgG免疫反應(yīng)檢測曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述。應(yīng)當(dāng)理解給出的實施例僅為了對制備和使用本發(fā)明的特定方法和產(chǎn)品進行說明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中所用的芯片打印機為Continy ομ s Flow Microspotter(CFM)Printer, Wasatch Company，USA。所用的 BIAOMIANDENGLIZISPRI 為 Plexera Analyzer 第三代， Plexera Bioscience Company，USA。所用的熒光顯微鏡為熒光倒置顯微鏡IX71-F22FL/PH， 奧林巴斯，日本。使用的MV/Ozone清洗機為BioForce Nanosciences, IA, USA。實施例1 選擇金屬包覆的玻璃為基底，先在玻璃基片的一個表面上蒸鍍或濺射l-2nm鉻膜，再在鉻膜上蒸鍍或濺射45-55nm厚的金膜，制備成裸金芯片，用MV/Ozone清洗機進行臭氧紫外線清洗，除去表面雜質(zhì)，或用乙醇、水多次清洗，后氮氣吹干保存?zhèn)溆谩Ｅ渲艸S-PEG-OCH3 (分子量=2000)、HS-PEG-OH (乙二醇單元數(shù)為6)及二者摩爾比例為10 1、1 1、1 10的溶液，溶劑可為水或PBS，總濃度均為ImM，通過芯片打印機打印到裸金芯片的可檢測區(qū)域，每種溶液打五個點，共五行，放置在4°C孵育1小時，然后用乙醇和水清洗，將未固定到芯片表面的分子清洗掉，氮氣吹干。安裝上流通池，將配制好的羧甲基化的α -環(huán)糊精飽和水溶液注滿此流通池，封閉進出口，室溫孵育M小時，使環(huán)糊精和長鏈PEG發(fā)生包合作用，后打開進出口，通入水和PBS進行多次清洗，清洗掉未包合到長鏈PEG上的環(huán)糊精，將其安裝到表面等離子體共振成像儀上進行免疫檢測。檢測步驟如下1)以10 μ 1/s的流速通入PBS直到基線穩(wěn)定；2)以2μ 1/s的流速通入EDC/NHS(NHSS)對其表面的羧基進行活化30min，以 10 μ 1/s的流速后通入PBS清洗；3)以 2 μ 1/s 的流速通入 100 μ g/ml H-IgG IOmin,以 10 μ 1/s 的流速后通入 PBS ；4)以2μ 1/s的流速通入lmg/ml H-IgG lOmin，使H-IgG吸附達到飽和狀態(tài)，后以 10 μ 1/s的流速后通入PBS進行多次清洗直到基線穩(wěn)定；5)以 2 μ 1/s 的流速通入 1 μ g/ml G-H-IgG 5min，以 10 μ 1/s 的流速通入 PBS 清洗；6)以 2 μ 1/s 的流速通入 10 μ g/ml G-H_IgG5min，以 10 μ 1/s 的流速通入 PBS 清洗；7)以 2 μ 1/s 的流速通入 100 μ g/ml G-H_IgG5min，以 10 μ 1/s 的流速通入 PBS 清洗；8)以10 μ 1/s的流速通入0. IM NaOH和PBS清洗，重生表面。其結(jié)果如圖5所示。其中A代表HS-PEG-OCH3(分子量=2000)，B代表HS-PEG_0H(乙二醇單元數(shù)為 6)。A B分別等于1 0、1 10、1 UlO 1和0 1代表A和B的摩爾比例分別為1 0、1 IOU UlO 1和0 1。從圖5結(jié)果可看出，在芯片上A B分別等于 1 OUO 1、1 1、1 10的修飾點中的長鏈PEG分子即第一鏈狀分子包合上了羧甲基環(huán)糊精，而且環(huán)糊精上的羧甲基經(jīng)EDC/NHSS活化后能成功的固定H-IgG，并在通入lmg/ml H-IgG 10分鐘后發(fā)現(xiàn)吸附趨于飽和。而A B等于0 1的點在通入H-IgG時只是溶液體折射率變化產(chǎn)生的變化。之后通過此表面分別檢測ι μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml羊抗人IgG，A B分別等于1 0、10 1、1 1、1 10的修飾點均有響應(yīng)信號，并且A B 分別等于1 0和10 1的信號要大于其它的點，而A B等于0 1的點在檢測羊抗人1 μ g/mlUOyg/mllgG時基本無信號，在檢測ΙΟΟμ g/ml羊抗人IgG時有很小的信號，認為有可能是非特異性吸附。實施例2 本案例選擇基材為玻片、硅片、石英、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷，將其表面用乙醇、水進行清洗，氮氣吹干，按如下步驟制備芯片1.放入以1 50丙酮稀釋的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)中，停留20 30秒， 取出稍停片刻，再放入純丙酮溶液中除去未結(jié)合的APES，使3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES) 與基材鍵合，在基材表面形成一層單分子層；2.在25%戊二醛中浸泡30分鐘，用丙酮清洗，浸入ImM的兩端均為氨基的PEG(Mw =2000)和一端為氨基另一端為羥基的PEG(Mw = 400)且二者分子比例為10 1的水溶液中孵育1小時，后取出用水清洗以除去未固定到表面的雙氨基PEG;3.將其浸入飽和的α -環(huán)糊精水溶液中室溫孵育12小時，使環(huán)糊精與PEG產(chǎn)生包合，取出洗凈；4.放入Z型酪氨酸溶液中1小時與PEG未固定到基材的氨基進行反應(yīng)，對形成的 (準)聚輪烷進行封端；5.放入丁二酸酐的吡啶溶液中2小時對包合在PEG上的環(huán)糊精進行羧基化即可。按上述步驟制備得本發(fā)明所述芯片浸入EDC/NHS進行活化30分鐘，通過去離子水徹底清洗；然后表面均勻滴上lmg/ml的H-IgG，4°C孵育6小時，后用PBS清洗，再放入牛血清白蛋白溶液中進行封閉，后取出清洗吹干。通過芯片打印機在此芯片上打印ΙΟΟμ g/ml 熒光標記的兔抗人蛋白的6 X 6陣列，PBS清洗，用熒光顯微鏡觀察，可看到蛋白。實施例3 本案例選擇金屬包覆的玻璃為基底；本案例選擇含雙巰基的PEG，具體結(jié)構(gòu)見下
圖
權(quán)利要求
1.一種超分子自組裝生物芯片，其中所述生物芯片包括基底(1)，固定于基底表面的第一鏈狀分子C3)，以及固定于基底表面且其在基底上的固定位置與第一鏈狀分子在基底上的固定位置相間隔的第二鏈狀分子，其中第一鏈狀分子的相對遠離基底的一端部分被環(huán)糊精(4)包合，所述環(huán)糊精包含能夠直接或間接結(jié)合蛋白質(zhì)分子的功能基團，并且第二鏈狀分子的長度不長于第一鏈狀分子的長度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述第一鏈狀分子與第二鏈狀分子的摩爾比例為1 0 1 10000，優(yōu)選為大于1 0且小于等于1 10000，進一步優(yōu)選為 50 1 1 50。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物芯片，其特征在于，所述基底的材料選自金屬，例如金、銀、鉬、銅、鋁和鉻；金屬氧化物，例如Al2O3JiO2和SnO2 ；以及Si、玻璃、石英和高分子聚合物中的一種或多種；優(yōu)選為金、銀、Si、玻璃或石英。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的生物芯片，其特征在于，所述環(huán)糊精選自α-環(huán)糊精、β -環(huán)糊精和γ -環(huán)糊精中的一種或多種，且所述環(huán)糊精包含的功能基團為一種或多種能與蛋白分子發(fā)生鍵合作用的基團，優(yōu)選自-COOH、-NH2、-SH、乙二胺、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、乙醇胺、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和-CHO的取代功能基團；優(yōu)選地，所述取代功能基團在環(huán)糊精上的取代度為1 12，例如1 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的生物芯片，其特征在于，所述第一鏈狀分子為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物、聚酯、聚醚、聚硅氧烷及鏈狀脂肪烴中的一種或多種，優(yōu)選為聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物的一種或多種；所述第二鏈狀分子選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物、聚酯、聚醚、聚硅氧烷以及鏈狀脂肪烴中的一種或多種，優(yōu)選聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的嵌段共聚物的一種或多種；優(yōu)選地，在第一鏈狀分子相對遠離基底的一端具有能夠直接或間接結(jié)合蛋白質(zhì)分子的功能基團，所述功能基團選自-C00H、-NH2, -SH、鏈霉親合素、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、-CHO, NTA-螯合基團、-OH、CH3和-OCH3中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的生物芯片，其特征在于，所述第一和第二鏈狀分子通過一種或多種選自單巰基、雙巰基、羧基、氨基和氨基硅烷的固定基團固定于基底。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的生物芯片，其特征在于，所述第一鏈狀分子的分子量為400 50000 ；所述第二鏈狀分子的分子量為50 10000。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的生物芯片的制備方法，該制備方法包括以下步驟將第一鏈狀分子和預(yù)先封端或長度短至無法被環(huán)糊精包合的第二鏈狀分子混合均勻后固定于基底，并以環(huán)糊精包合第一鏈狀分子。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，該方法包括以下步驟1)選擇基底，采取本領(lǐng)域已知技術(shù)進行相應(yīng)的表面處理使其適合制備超分子自組裝的生物芯片；2)選擇一端含固定基團的適合的第一鏈狀分子和第二鏈狀分子，并配制兩種鏈狀分子的混合溶液，其中，所述第二鏈狀分子的長度短至無法被環(huán)糊精包合或者混合前預(yù)先在另一端進行封端；3)室溫下配制含功能基團的環(huán)糊精溶液，過濾，去掉溶液中的雜質(zhì)；其中所述環(huán)糊精溶液優(yōu)選為飽和濃度的環(huán)糊精水溶液；4)使步驟幻中的鏈狀分子固定于基底，形成包含兩種鏈狀分子組成的自組裝分子層； 之后，將修飾后的基底與步驟幻中的環(huán)糊精溶液反應(yīng)，使環(huán)糊精與第一鏈狀分子形成包合產(chǎn)物；5)用水清洗未固定到表面的鏈狀分子及未包合的環(huán)糊精，干燥獲得的生物芯片并保存優(yōu)選地，步驟幻中的第一鏈狀分子的另一端經(jīng)修飾含功能基團；優(yōu)選地，步驟2、中第二鏈狀分子封端時采用的封端劑為Z型酪氨酸(Z-Tyr)和/或 2. 4-二硝基氟苯。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其中，所述方法中的步驟4)按以下操作進行首先，將帶有一定形狀的凹槽里注滿特定比例的步驟2、中鏈狀分子的混合液，然后將基底倒置壓在此槽上，使溶液與基底表面充分接觸，或?qū)⒒捉萑胩囟ū壤牟襟E2)中鏈狀分子的混合液里，或用芯片打印機在基底上打印指定數(shù)目的特定比例的步驟2、中鏈狀分子的混合液點，然后清洗，使其在指定區(qū)域形成一層均勻致密的鏈狀結(jié)構(gòu)的自組裝分子層；此操作在一定溫度下，優(yōu)選0 10°C進行，并孵育1小時以上，進一步優(yōu)選4°C孵育 1 12小時；之后，將帶有一定形狀的凹槽里注滿步驟幻中的環(huán)糊精水溶液，然后將上述基底倒置壓在此槽上，使溶液與基底指定表面充分接觸，或?qū)⑸鲜龌捉萑肱渲坪玫牟襟E幻中的環(huán)糊精溶液中，或?qū)⒉襟E幻中的環(huán)糊精溶液滴加在打印好的上述基底表面，使溶液完全覆蓋打印的點，使環(huán)糊精與第一鏈狀分子形成包合產(chǎn)物；優(yōu)選地，此操作在一定溫度下，優(yōu)選 0 10°C進行，并孵育1小時以上，進一步優(yōu)選4°C孵育4 48小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的生物芯片的制備方法，該制備方法包括以下步驟將第一鏈狀分子以環(huán)糊精包合后與第二鏈狀分子混合均勻，然后將混合物固定于基底。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其中，所述方法包括以下步驟1)選擇基底，采取本領(lǐng)域已知技術(shù)進行相應(yīng)的表面處理使其適合制備超分子自組裝的生物芯片；2)配制含功能基團的環(huán)糊精溶液，向該溶液中加入相應(yīng)要包合的一端含固定基團的第一鏈狀分子，產(chǎn)生包合產(chǎn)物，其中所述環(huán)糊精溶液優(yōu)選為飽和濃度的環(huán)糊精水溶液；此操作在一定溫度下，優(yōu)選室溫進行，并攪拌1小時以上，進一步優(yōu)選攪拌1 M小時，之后將包合產(chǎn)物提純干燥；或者，配制不含功能基團的環(huán)糊精溶液，向該溶液中加入相應(yīng)要包合的一端含固定基團的第一鏈狀分子，產(chǎn)生包合產(chǎn)物，其中所述環(huán)糊精溶液優(yōu)選為飽和濃度的環(huán)糊精水溶液； 此操作在一定溫度下，優(yōu)選室溫進行，并攪拌1小時以上，進一步優(yōu)選攪拌1 M小時，之后加入特定溶液將環(huán)糊精功能化使之含功能基團，并將包合產(chǎn)物提純干燥；優(yōu)選地，所述包合產(chǎn)物產(chǎn)生后，先加入相適應(yīng)的封端劑如Z型酪氨酸(Z-Tyr)和/或2. 4-二硝基氟苯，再進行功能化使環(huán)糊精含功能基團；3)將環(huán)糊精和第一鏈狀分子的包合產(chǎn)物溶解，然后與第二鏈狀分子以一定比例混合， 該第二鏈狀分子一端含固定基團；4)使步驟幻中的鏈狀分子混合物固定于基底，形成包含兩種鏈狀分子的自組裝分子層；5)用水清洗未固定到表面的鏈狀分子，干燥獲得的生物芯片并保存?zhèn)溆茫?優(yōu)選地，步驟2、中的第一鏈狀分子的另一端經(jīng)修飾含功能基團。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法，其中，所述方法步驟4)按以下操作進行 將帶有一定形狀凹槽里注滿步驟幻制備的混合液，然后將基底倒置壓在此槽上，使溶液與基底處理過的表面充分接觸，或?qū)⒒捉萑胍欢坎襟E幻制備的混合液里，或用芯片打印機在基底上打印指定數(shù)目的步驟幻制備的混合液點使其在指定區(qū)域形成一層均勻致密的自組裝分子層；此操作在一定溫度下，優(yōu)選0 10°C進行，并孵育1小時以上，進一步優(yōu)選4°C孵育1 12小時。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的生物芯片的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述生物芯片用于蛋白質(zhì)的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種超分子自組裝生物芯片，其中所述生物芯片包括基底(1)，固定于基底表面的第一鏈狀分子(3)，以及固定于基底表面且其在基底上的固定位置與第一鏈狀分子在基底上的固定位置相間隔的第二鏈狀分子(4)，其中第一鏈狀分子的相對遠離基底的一端部分被環(huán)糊精(2)包合，所述環(huán)糊精包含能夠直接或間接結(jié)合蛋白質(zhì)分子的功能基團，并且第二鏈狀分子的長度不長于第一鏈狀分子的長度。所述生物芯片表面的自組裝層由于采用了環(huán)糊精與第一鏈狀分子包合而成的(準)聚輪烷及均勻間隔的第二鏈狀分子，三維空間結(jié)構(gòu)疏密可控、結(jié)構(gòu)多變，比二維表面能固定更多的檢測分子如蛋白質(zhì)分子。此外，本發(fā)明還提供了所述生物芯片的制備方法和應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102539777SQ201010595788
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者周大蘇, 宋爐勝, 朱勁松, 王坤, 王艷梅, 程志強 申請人:國家納米科學(xué)中心