專利名稱：甾體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，天然、人工合成的留體類及多環(huán)芳烴化合物無限制的排放到自然環(huán)境中， 這類污染物的激素活性及對生物體的消極影響倍受人們關(guān)注。由于其分布廣泛，在極低的 濃度下都具有激素活性，對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生嚴重危害，所以能夠靈敏、快速、高效的檢 測甾體類及多環(huán)芳烴化合物的新技術(shù)亟待發(fā)展。目前傳統(tǒng)的檢測分析技術(shù)主要是氣相色 譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(HC-MS)，另外國內(nèi)外專家基于人體留體激素受體的研 究已研制成多種留體類激素檢測系統(tǒng)。這些檢測系統(tǒng)大多數(shù)需要人體或酵母細胞培養(yǎng)，檢 測周期長、成本高，此外還存在靈敏度低、只能檢測一種化合物等弊端，因此將這些技術(shù)應(yīng) 用于環(huán)境檢測方面是極為有限的。睪丸酮叢毛單胞菌(C. testosteroni, C. T)的顯著特性是其具有特異性降解甾體 類及多環(huán)芳烴化合物酶基因，并且已有關(guān)于其降解留體類及多環(huán)芳烴化合物基因表達與甾 體類激素和多環(huán)芳烴化合物應(yīng)答機制的研究。是否可以用C. T以留體類及多環(huán)芳烴化合物 為信號體系，構(gòu)建一種敏感、快速、簡單的生物傳感器，用來檢測環(huán)境中的留體類及多環(huán)芳 烴化合物混合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種留體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器及構(gòu)建方 法，將質(zhì)粒PK-3 α -GFP3和ρ6分別轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中，建立了一種綠色熒光蛋白標記的生 物熒光檢測系統(tǒng)，檢測對象為留體類激素和多環(huán)芳烴兩大類物質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明構(gòu)建了基于睪丸酮叢毛單胞菌(C. testosteroni, C. T)的甾體類激素及多 環(huán)芳烴生物熒光檢測系統(tǒng)。睪丸酮叢毛單胞菌能夠以睪丸酮等留體類激素作為唯一碳源和 能源，還能降解非固醇類的多環(huán)芳烴等物質(zhì)，通過3 α-羥類固醇脫氫酶(3CI-HSD)等酶的 代謝，消化這類底物。綠色熒光蛋白(GFP)是近年來廣泛應(yīng)用于生物學(xué)標記領(lǐng)域的報告基 因，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色熒光，根據(jù)其熒光 強度通過對照標準曲線可以計算出特異底物的相對含量。本發(fā)明將質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3和ρ6分別轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中并分別制備成非細胞體 系檢測試劑，建立了一種綠色熒光蛋白標記的生物熒光檢測系統(tǒng)。在重組質(zhì)粒ρΚ-3 α-GFP3 的順勢β -半乳糖苷酶(LacZ)啟動子基因(見序列1)下游依次插入了 3 α -HSD啟動子等 調(diào)控序列(見序列2、470堿基對及GFP報告基因(見序列3) 717堿基對；重組質(zhì)粒ρ6含有 3 α-HSD全部調(diào)控基因(見序列4)，共5257堿基對。當環(huán)境中存在雌激素等底物時，可以 誘導(dǎo)Ρ6質(zhì)粒上3 α -HSD的調(diào)控序列表達調(diào)控作用的蛋白，該蛋白可使質(zhì)粒ρΚ_3 α -GFP3上 的啟動子啟動進而表達出GFP蛋白，此時GFP的表達量嚴格受到誘導(dǎo)底物量的控制。
質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3中順勢LacZ啟動子基因能夠作用于其本身質(zhì)粒中的3 α -HSD 的調(diào)控序列和啟動子基因，促進其后的綠色熒光蛋白大量表達，對熒光信號具有放大、增強 作用。根據(jù)該熒光傳感器的熒光強度大小，通過對照標準曲線可以計算出特異性底物的相
對含量。本發(fā)明的構(gòu)建方法是(1)質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)12至14小時，將培養(yǎng)后大腸桿菌 按體積比1 20接種于培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)后菌液離心，棄上清，加入無菌水洗滌 菌體，離心棄上清，重復(fù)洗滌兩次，加入無菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20°C至25°C反復(fù)凍融 三次，離心，取上清即為制備的非細胞體系細胞漿(_20°C可保存一個月)。 (2)將質(zhì)粒p6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)12至14小時，將培養(yǎng)后大腸桿菌按體積比
1 20接種于培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)后菌液離心，棄上清，加入無菌水洗滌菌體，離心 棄上清，重復(fù)洗滌兩次，加入無菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20°C至25°C反復(fù)凍融三次，離心， 取上清即為制備的非細胞體系細胞漿(_20°C可保存一個月)。(3)將質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3的非細胞體系細胞漿與質(zhì)粒Ρ6的非細胞體系細胞漿分 別測定蛋白含量并分別制備成蛋白含量=0. lmg/mL的工作液，兩種工作液按體積比1
2 1 10混合。應(yīng)用此混合非細胞體系構(gòu)建高效生物熒光傳感器。建立生物熒光標準檢測曲線(1)將檢測底物標準品用無水乙醇溶解，分別配制濃度為10_3M、10_6M、10_9M、 io42M、IO-15M/L的標準檢測液。(2)取非細胞體系檢測試劑分別加入標準檢測液，空白對照加入無水乙醇，靜置， 用熒光酶標儀檢測其熒光發(fā)光值，建立標準檢測曲線。本發(fā)明檢測對象是留體類激素和多環(huán)芳烴兩類物質(zhì)，樣品檢測濃度范圍為10_15至10_3摩爾每升。本發(fā)明的有益效果是針對現(xiàn)有檢測系統(tǒng)的儀器要求嚴格、檢測周期長、成本高、靈敏度低、檢測物單一 等弊端，本發(fā)明檢測線性范圍寬，技術(shù)操作簡單，儀器要求不高，適宜推廣應(yīng)用于檢測環(huán)境、 食品中留體類激素及多環(huán)芳烴污染物。


圖1是質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3示意圖；圖2是質(zhì)粒ρ6示意圖；圖3是睪丸酮熒光檢測結(jié)果圖；圖4是雌二醇熒光檢測結(jié)果圖；圖5是萘熒光檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例1以睪丸酮為例建立生物熒光檢測標準曲線1、非細胞體系細胞漿的制備(1)將質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，37°C，180 200轉(zhuǎn)每分鐘恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12至14小時，將培養(yǎng)后的大腸桿菌按體積比1 20接種于SIN培養(yǎng)基中， 370C，180 200轉(zhuǎn)每分鐘恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至0D595 = 3. 0，將培養(yǎng)后菌體4000轉(zhuǎn)每 分鐘離心20 30分鐘棄上清，加入無菌水洗滌菌體，4000轉(zhuǎn)每分鐘離心20 30分鐘，棄上 清，重復(fù)洗滌兩次，加入無菌水及終濃度為100 μ g/mL溶菌酶，重懸菌體，-20°C至25°C反復(fù) 凍融三次，10000轉(zhuǎn)每分鐘離心20 30分鐘，取上清即為制備的非細胞體系細胞漿(_20°C 可保存一個月)。(2)將質(zhì)粒p6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，370C，180 200轉(zhuǎn)每分鐘恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)12至14小時，將培養(yǎng)后的大腸桿菌按體積比1 20接種于SIN培養(yǎng)基中，37°C，180 200轉(zhuǎn)每分鐘恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD595 = 3. 0，將培養(yǎng)后菌體4000轉(zhuǎn)每分鐘離心20 30分鐘棄上清，加入無菌水洗滌菌體，4000轉(zhuǎn)每分鐘離心20 30分鐘，棄上清，重復(fù)洗滌 兩次，加入無菌水及終濃度為100 μ g/mL溶菌酶，重懸菌體，-20°C至25°C反復(fù)凍融三次， 10000轉(zhuǎn)每分鐘離心20 30分鐘，取上清即為制備的非細胞體系細胞漿(_20°C可保存一 個月)。(3)將質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3的非細胞體系細胞漿與質(zhì)粒Ρ6的非細胞體系細胞漿分別 測定蛋白含量并分別制備成蛋白含量=0. lmg/mL的工作液，并按按體積比1 1混合。2、建立生物熒光標準檢測曲線(1)將睪丸酮標準品用無水乙醇溶解，分別配制濃度為lmM/L、lyM/L、lnM/L、 lpM/LUfM/L的標準檢測液。(2)取100 μ L混合非細胞體系細胞漿分別加入2 μ L標準檢測液，空白對照加入 2yL無水乙醇，30°C靜置10分鐘后，用熒光酶標儀檢測其熒光發(fā)光值，建立標準檢測曲線。熒光檢測結(jié)果如下表表1.睪丸酮熒光檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種留體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器，其特征是將質(zhì)粒ρΚ-3 α-GFP3 和Ρ6分別轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中并分別制備成非細胞體系檢測試劑，建立了一種綠色熒光蛋 白標記的生物熒光檢測系統(tǒng)；在重組質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3的順勢β -半乳糖苷酶啟動子基因 下游依次插入了 3 α -HSD啟動子等調(diào)控序列470堿基對及GFP報告基因717堿基對；重組 質(zhì)粒Ρ6含有3 α -HSD全部調(diào)控基因，共5257堿基對；當環(huán)境中存在雌激素等底物時，可以 誘導(dǎo)Ρ6質(zhì)粒上3 α -HSD的調(diào)控序列表達調(diào)控作用的蛋白，該蛋白可使質(zhì)粒ρΚ_3 α -GFP3上 的啟動子啟動進而表達出GFP蛋白，此時GFP的表達量嚴格受到誘導(dǎo)底物量的控制。
2.一種留體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器的構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法是a、質(zhì)粒ρΚ_3α-GFP3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)12至14小時，將培養(yǎng)后大腸桿菌按體積 比1 20接種于培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)后菌液離心，棄上清，加入無菌水洗滌菌體，離 心棄上清，重復(fù)洗滌兩次，加入無菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20°C至25°C反復(fù)凍融三次，離 心，取上清即為制備的非細胞體系細胞漿；b、將質(zhì)粒p6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)12至14小時，將培養(yǎng)后大腸桿菌按體積比1 20 接種于培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)后菌液離心，棄上清，加入無菌水洗滌菌體，離心棄上 清，重復(fù)洗滌兩次，加入無菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20°C至25°C反復(fù)凍融三次，離心，取上 清即為制備的非細胞體系細胞漿；C、將質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3的非細胞體系細胞漿與質(zhì)粒Ρ6的非細胞體系細胞漿分別測定 蛋白含量并分別制備成蛋白含量=0.1mg/mL的工作液，兩種工作液按體積比1 2 1 10混合；應(yīng)用此混合非細胞體系構(gòu)建高效生物熒光傳感器；d、將檢測底物標準品用無水乙醇溶解，分別配制濃度為1(Γ3Μ、ΙΟ-、、101、10_12M、 10_15M/L的標準檢測液；f、取非細胞體系檢測試劑分別加入標準檢測液，空白對照加入無水乙醇，靜置，用熒光 酶標儀檢測其熒光發(fā)光值，建立標準檢測曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種留體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器，其特征 是質(zhì)粒ρΚ-3 α -GFP3中順勢LacZ啟動子基因能夠作用于其本身質(zhì)粒中的3 α -HSD的調(diào)控 序列和啟動子基因，促進其后的綠色熒光蛋白大量表達，對熒光信號具有放大、增強作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種留體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器，其特征 是根據(jù)該熒光傳感器的熒光強度大小，通過對照標準曲線計算出特異性底物的相對含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種留體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器，其特征 是檢測對象是留體類激素和多環(huán)芳烴兩類物質(zhì)，樣品檢測濃度范圍為10_15至10_3摩爾每 升。
全文摘要
一種甾體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，其特征是將質(zhì)粒pK-3α-GFP3和p6分別轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中并分別制備成非細胞體系檢測試劑，在重組質(zhì)粒pK-3α-GFP3的順勢β-半乳糖苷酶(LacZ)啟動子基因下游依次插入了3α-HSD啟動子等調(diào)控序列468堿基對及GFP報告基因722堿基對；可以誘導(dǎo)p6質(zhì)粒上3α-HSD的調(diào)控序列表達調(diào)控作用的蛋白，該蛋白可使質(zhì)粒pK-3α-GFP3上的啟動子啟動進而表達出GFP蛋白，此時GFP的表達量嚴格受到誘導(dǎo)底物量的控制。有益效果是針對現(xiàn)有檢測系統(tǒng)的儀器要求嚴格、檢測周期長、成本高、靈敏度低、檢測物單一等弊端，本發(fā)明檢測線性范圍寬，技術(shù)操作簡單，儀器要求不高，適宜推廣應(yīng)用于檢測環(huán)境、食品中甾體類激素及多環(huán)芳烴污染物。
文檔編號C12N15/65GK102128938SQ201010595059
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者于化東, 于源華, 何秀霞, 侯巍, 宋禹, 張淑華, 葛淑敏, 馬書林 申請人:長春理工大學(xué)