專利名稱：應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞并制備hpv16/18 l1蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供了通過采用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞來制備外源蛋白例如人乳頭瘤病毒16和18型Ll蛋白的方法。特別地，本發(fā)明優(yōu)化了使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的條件，以及用重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞以表達(dá)外源蛋白例如HPV16/18 Ll蛋白的條件，從而獲得了高水平表達(dá)外源蛋白例如HPV16/18 Ll 蛋白的方法。
背景技術(shù)：
昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在高效表達(dá)外源蛋白方面擁有獨特的優(yōu)勢，并因此得到了廣泛應(yīng)用。該表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點1)安全性高桿狀病毒只在無脊椎動物昆蟲體內(nèi)或昆蟲細(xì)胞中復(fù)制，而對人類、哺乳動物、其他無脊椎動物和植物都沒有感染性；2)表達(dá)水平高多角體蛋白啟動子是強啟動子，外源蛋白基因在該啟動子的調(diào)控下，可以高效表達(dá)；3)表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相似由于桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞具有廣泛的翻譯后修飾系統(tǒng)，因此表達(dá)產(chǎn)物的抗原性、免疫活性以及生物功能都類似于天然產(chǎn)物，并且重組蛋白具有較高的生物活性；4)成本低。此外，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)時的溫度較低，需要的營養(yǎng)成分也比哺乳動物細(xì)胞少，并且易于進(jìn)行無血清培養(yǎng)，因此，在大規(guī)模培養(yǎng)時不僅降低了能量消耗，而且還降低了重組目的蛋白下游純化的壓力，大大簡化了純化過程和純化所需的時間。由于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的獨特性質(zhì)，其被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)療診斷、動物和人類疫苗、生物殺蟲劑等諸多領(lǐng)域中。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)被廣泛用于表達(dá)病毒蛋白，產(chǎn)生病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)。VLP的獲得為了解病毒蛋白在細(xì)胞中的裝配過程和研究各蛋白間的相互作用提供了有利的工具。此外，VLP具有與天然病毒粒子極為相似的空間結(jié)構(gòu)，這種特定的構(gòu)象使得VLP必然具有較好的抗原性和免疫原性。因此，VLP的研究為發(fā)展有效的基因工程疫苗和敏感的診斷試劑提供了新的思路。目前已將VLP應(yīng)用于輪狀病毒、乙型肝炎病毒、漢坦病毒、微小病毒、藍(lán)舌病毒、乳頭瘤病毒等多種病毒的疫苗制備、免疫特性和形態(tài)發(fā)生學(xué)的研究，并取得了理想的效果。特別地，由于VLP是體外表達(dá)的若干病毒結(jié)構(gòu)蛋白在特定條件下自動裝配成的在形態(tài)上類似于真正病毒的空心顆粒，并且其內(nèi)部沒有病毒核酸而不能進(jìn)行復(fù)制，因此，由VLP制備的疫苗具有高效、安全的特點。已通過昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功制備了用于預(yù)防婦女宮頸癌的臨床用人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)疫苗。葛蘭素史克公司使用昆蟲細(xì)胞制備了 2價HPV疫苗(其商品名為“Cervarix”，可預(yù)防HPV 16和18病毒導(dǎo)致的宮頸癌)，這種疫苗可以迅速地使受試動物產(chǎn)生抗HPV病毒的中和抗體，并且對人畜安全，能夠有效預(yù)防HPV 病毒所導(dǎo)致的各種疾病(特別是宮頸癌)。使用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來制備感染性病毒的VLP具有獨特的優(yōu)越性。 與細(xì)菌相比，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅可以對外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工(包括例如糖基化、磷酸化、脂肪酸?；被┒艘阴；?、羧基末端酰胺化及硫酸化作用)，而且還能進(jìn)行正確的信號肽切割，蛋白水解以及適當(dāng)?shù)恼郫B作用，因此，利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以獲得與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白。特別地，使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的外源病毒蛋白可以在昆蟲細(xì)胞內(nèi)形成具有天然結(jié)構(gòu)的VLP。與酵母相比，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對外源蛋白的翻譯后加工作用更加接近于哺乳動物細(xì)胞；而與哺乳動物細(xì)胞相比，它可以以更高的水平產(chǎn)生外源重組蛋白。細(xì)菌、酵母等微生物可以利用發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，以利于對其產(chǎn)物的利用。同樣，昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞也可以采用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)從而制備更多的有益產(chǎn)品。隨著生物反應(yīng)器以及生物反應(yīng)器工程相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)逐漸由在傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化為在自動化生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)。自1956年Waytt設(shè)計出昆蟲組織培養(yǎng)液以來，人們開始了對昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)，并且其培養(yǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大由最初的靜止培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，到搖瓶培養(yǎng)，再到渦旋罐培養(yǎng)。同時，人們還積極地探索利用生物反應(yīng)器對昆蟲細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。由于昆蟲細(xì)胞是一種傳統(tǒng)意義上的非貼壁細(xì)胞，不會貼壁至懸浮的微載體， 所以昆蟲細(xì)胞的生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)是一種純粹的細(xì)胞懸于培養(yǎng)液中的培養(yǎng)。然而，昆蟲細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需氧量很高，這使得必須進(jìn)行大量的輸氧操作如攪拌、噴氣等，但這些操作所產(chǎn)生的剪切力，往往引起細(xì)胞的損傷和死亡，因此，如果想要進(jìn)一步提高懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞的濃度，那么就需要從多方面進(jìn)行考慮，例如生物反應(yīng)器的設(shè)計、傳質(zhì)傳氧的通暢、 剪切力的強弱、細(xì)胞接種濃度的高低、培養(yǎng)基組分的選擇等等。這些因素直接影響著昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模。因此，需要對這些因素進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的培養(yǎng)條件，從而進(jìn)一步提高使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明提供了使用昆蟲細(xì)胞制備外源蛋白的方法，其包括1)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞；2)用攜帶編碼所述外源蛋白的基因的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞；和3)收獲細(xì)胞，并分離和純化產(chǎn)生的外源蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，外源蛋白是HPV16 Ll蛋白或HPV18 Ll蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，昆蟲細(xì)胞是Sf-9細(xì)胞、Sf-21細(xì)胞或HighFive細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的條件如下溶氧為 30-70 %，例如 50 % ；溫度為 27°C ；pH 為 6. 2-6. 8，例如 6. 5 ；轉(zhuǎn)速為 50-180rpm,例如 IOOrpm ；氣流速為1-2L/分鐘，例如2L/分鐘。在一個優(yōu)選實施方案中，以lX105/ml至10X105/ml的起始密度，優(yōu)選以5X IO5/ ml的起始密度培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，以1-40的MOI，例如以10、20、30或40的MOI用重組桿狀
病毒感染昆蟲細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，在桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后60-72小時時，分離和純化產(chǎn)生的外源蛋白。發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益效果(1)針對NBS公司的生物反應(yīng)器，優(yōu)化了培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的條件和方法，有利于進(jìn)一步提高昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模；(2)探索了重組桿狀病毒感染在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞以及增殖的條件， 有利于大量產(chǎn)生外源蛋白，例如HPV16/18 Ll蛋白。這對于規(guī)?；a(chǎn)抗HPV16/18的二價疫苗具有重要的現(xiàn)實意義。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。附圖概述

圖1顯示在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞。圖2顯示在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞的生長曲線。圖3顯示在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞的葡萄糖消耗。圖4顯示在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞的乳酸積累。圖5顯示在不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的情況下重組桿狀病毒在生物反應(yīng)器中的增殖曲線。圖6顯示在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞在不同MOI的情況下表達(dá)的HPV16 Ll
蛋白的量。圖7顯示在生物反應(yīng)器中生長的昆蟲細(xì)胞在不同MOI的情況下表達(dá)的HPV18 Ll
蛋白的量。
具體實施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明的實施例來描述本發(fā)明。實施例1.利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Sf-9細(xì)胞的條件從液氮中取出凍存的昆蟲細(xì)胞Sf-9(InVitr0gen公司)，迅速將其置于27°C水浴中進(jìn)行化凍，然后以IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清液。將細(xì)胞沉淀重懸于0. 5ml Grace生長液(Grace (Gibco 公司)4. 572%、NaHC03 0 . 0 3 5%、水解乳蛋白(Oxid 公司)0. 33%、酵母浸提物(Oxid公司)0. 33%、胎牛血清(Hyclone公司)10%、青霉素4U、鏈霉素10U，pH 6. 5) 中，然后轉(zhuǎn)接到含有6ml Grace生長液的T25培養(yǎng)瓶中，并在27°C下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。 待Sf-9細(xì)胞匯合成單層后，棄去培養(yǎng)上清，加入新鮮的Grace生長液IOml。輕柔地將貼壁細(xì)胞吹落，然后轉(zhuǎn)移到無菌三角瓶內(nèi)(用透氣膜封口)，并將三角瓶置于搖床上，以150rpm在 27°C下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，將細(xì)胞全部轉(zhuǎn)接到含有100ml Grace生長液的三角瓶中，繼續(xù)在27°C下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，再將細(xì)胞全部轉(zhuǎn)接到含有1000ml SF900 II 無血清培養(yǎng)液anvitrogen公司)的攪拌瓶(Bellco公司)中，并將攪拌瓶置于磁力攪拌器(Bellco公司)上，在27°C下以IOOrpm進(jìn)行攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，取100 μ 1培養(yǎng)液， 向其中加入10 μ 1的臺盼藍(lán)(0.4%)染液，室溫放置2分鐘，然后在顯微鏡下計數(shù)未著色的 Sf-9細(xì)胞，計算活細(xì)胞濃度。向經(jīng)滅菌的NBS Celligen 310型細(xì)胞生物反應(yīng)器(配備的攪拌漿為I^tented double-screen cell-lift impeller)中加入IOL經(jīng)過濾除菌的SF900 II無血清培養(yǎng)液， 并加入Sf-9細(xì)胞。用HCl和NaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，并直接用空氣來供氧。生物反應(yīng)器的各種參數(shù)設(shè)置如下溶氧為50%、溫度為27°C、pH為6. 5、轉(zhuǎn)速為lOOrpm、氣流速為2L/ 分鐘。連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞10天，并且每天測定細(xì)胞密度(使用臺盼蘭染色法)，葡萄糖濃度以及乳酸濃度。根據(jù)制造商的說明書，分別使用葡萄糖檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒(北京泰樂祺科技有限公司)來測定葡萄糖濃度以及乳酸濃度。圖1顯示了在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞。圖2-4分別表示不同起始密度(低密度細(xì)胞1 Xio5Ail沖密度細(xì)胞5X105/ml ；高密度細(xì)胞10X105/ml)的Sf_9細(xì)胞的生長曲線(圖2)，葡萄糖消耗(圖3)和乳酸積累(圖4)。結(jié)果顯示，中起始密度(5X105/ml) 的Sf-9細(xì)胞的增殖倍數(shù)最高，并且葡萄糖消耗和乳酸積累的水平最合適。實施例2.重組桿狀病毒的增殖的測定當(dāng)Sf-9細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖到對數(shù)末期或平臺前期時，加入攜帶有HPV16 Ll基因(GeneBank登錄號1489082)的重組桿狀病毒(桿狀病毒來源于美國BD公司的試劑盒，BD BaculoGold , 560129)或攜帶有 HPV18 Ll 基因(GeneBank 登錄號 ADC35715)的重組桿狀病毒，繼續(xù)培養(yǎng)4天。每12小時取Iml細(xì)胞培養(yǎng)液，并測定其中的重組桿狀病毒滴度。簡言之，取Iml經(jīng)感染的細(xì)胞培養(yǎng)液，以IOOOrpm離心5分鐘，分別收集上清和細(xì)胞沉淀。用 Grace 稀釋液(Grace (Gibco 公司)4. 572%、NaHCO3 0.035%、水解乳蛋白(Oxid 公司)0. 33%、酵母浸提物(Oxid公司)0. 33%、青霉素4U、鏈霉素10U，pH 6. 5)對上清進(jìn)行10 倍梯度稀釋(從10_3依次10倍稀釋至10_8)。然后將Iml經(jīng)稀釋的上清接種到匯合成單層的培養(yǎng)于6孔板中的Sf-9細(xì)胞中，每個稀釋度接種2孔，然后在27°C下吸附2小時。吸附后，輕輕完全棄去孔中的培養(yǎng)液，加入2ml含瓊脂的Grace維持液(Grace (Gibco公司)4. 572%, NaHCO3 0.035%、水解乳蛋白(Oxid公司)0. 33%、酵母浸提物(Oxid公司)0. 33%、胎牛血清(Hyclone公司)2%、青霉素4U、鏈霉素10U，pH 6. 5，低熔點瓊脂(Solarbio公司))， 然后在27°C下倒置培養(yǎng)4-10天。每天觀察產(chǎn)生的灰白色空斑，直至空斑數(shù)目不再發(fā)生變化，并如下計算病毒滴度(pfu/ml)病毒滴度(pfu/ml) = (1/稀釋倍數(shù))X每孔空斑數(shù)目 /(每孔接種的毫升數(shù))。圖5顯示，當(dāng)MOI為20時，重組桿狀病毒增殖最快，并且其滴度在感染后72小時達(dá)到最高值。實施例3.昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HPV16/18 Ll蛋白的測定在用重組桿狀病毒感染培養(yǎng)于生物反應(yīng)器中的Sf-9細(xì)胞后，每12小時測定昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HPV16/18 Ll蛋白。簡言之，取細(xì)胞培養(yǎng)液，分離細(xì)胞沉淀。向每IO6個細(xì)胞中加入 100 μ 1 裂解液(50mmol/LTris-HCl(pH 8. 0) ； 15mmol/L NaCl ；0. lmmol/L PMSF ；0. 1% NP40 ；5mmol/L EDTA)并進(jìn)行超聲破碎，以裂解Sf-9細(xì)胞。裂解后，在4°C下以IOOOOg離心 15分鐘，以去除細(xì)胞碎片。將100 μ 1上清液加入到包被了抗HPV16 Ll或抗HPV18 Ll多克隆抗體(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司)的96孔板中。同時，使用預(yù)先確定量的經(jīng)純化的HPV16/18 Ll蛋白作為對照，以制作定量蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，在37°C孵育板1小時。孵育后，用PBST溶液(PBS溶液+0. 5% Tween-20)洗滌板三次，并加入用PBS稀釋的抗HPV16 Ll或抗HPV18 Ll的單克隆抗體(abeam公司)。再次在37°C孵育板1小時后，用 PBST溶液洗滌板三次，并加入HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(KPL公司)。再次在37°C孵育1 小時后，用PBST溶液洗滌板三次，并加入OPD底物顯色液(檸檬酸0. 51 %，Na2HPO4 · 12H20 1.84%，鄰苯二胺(OPD)O. 05%, Η2&50μ 1)，避光顯色10分鐘。之后用2Ν H2SO4終止顯色反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀(BI0-RAD公司)測定492nm處的OD值。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每個樣品的Ll蛋白含量。 圖6和7分別顯示在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞表達(dá)的HPV16L1蛋白和HPV18 Ll蛋白的量。結(jié)果表明，在MOI為20-40的情況下，在桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后60-72小時時，Ll蛋白的產(chǎn)量最高。
權(quán)利要求
1.使用昆蟲細(xì)胞制備外源蛋白的方法，其包括1)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞；2)用攜帶編碼所述外源蛋白的基因的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞；和3)收獲細(xì)胞，并分離和純化產(chǎn)生的外源蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述外源蛋白是HPV16Ll蛋白或HPV18L1蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述昆蟲細(xì)胞是Sf-9細(xì)胞、Sf-21細(xì)胞或HighFive 細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中，用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的條件如下溶氧為30-70%，例如50% ；溫度為270C ；pH為6. 2-6. 8，例如6. 5 ；轉(zhuǎn)速為50_180rpm，例如 IOOrpm ；氣流速為1-2L/分鐘，例如2L/分鐘。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中以1XlO5Ail至10X105/ml的起始密度，優(yōu)選以5X105/ml的起始密度培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中以1-40的Μ0Ι，例如以10、20、30或40的MOI 用重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中在桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后60-72小時時，分離和純化產(chǎn)生的外源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過采用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞來制備外源蛋白例如人乳頭瘤病毒16和18型L1蛋白的方法。特別地，本發(fā)明優(yōu)化了使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的條件，以及用重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞以表達(dá)外源蛋白例如HPV16/18 L1蛋白的條件，從而獲得了高水平表達(dá)外源蛋白例如HPV16/18 L1蛋白的方法。
文檔編號C12N5/10GK102181425SQ20101060017
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者周蕾, 周長民, 張千, 李衛(wèi)東, 李春明, 段廣宇, 王敏文, 王玉峰, 王飛宇, 聶飛, 郭文軍, 閆昆明, 高偉星 申請人:大連雅立峰生物制藥有限公司