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      一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCB1的方法

      文檔序號(hào):8425885閱讀:452來源:國知局
      一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCB1的方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBI的方法,屬于生物基因工程領(lǐng)域。
      【背景技術(shù)】
      [0002]ABCBl是ABC七大家族轉(zhuǎn)運(yùn)體中B族的蛋白成員之一,在人的正常細(xì)胞和腫瘤組織中均有表達(dá),如小腸上皮頂膜、胎盤合胞體滋養(yǎng)層、腸小管膜、大腦微血管皮細(xì)胞、乳腺小葉、和乳腺癌細(xì)胞等。ABC蛋白的主要功能是小分子物質(zhì)及多肽分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)會(huì)通過改變形態(tài)允許某些分子通過。免疫組化顯示ABCBl主要在細(xì)胞膜和胞漿中表達(dá),不僅具有吸收、分泌和排泄功能,而且具有抑制消化道吸收某些外源性物質(zhì),參與形成血腦、胎血屏障等生理功能;同時(shí)ABCBl是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,需要結(jié)合水解胞漿中的ATP,以此確保轉(zhuǎn)運(yùn)底物所需的足夠能量,該蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)的這些特殊反應(yīng)能夠使轉(zhuǎn)運(yùn)子與底物像齒輪一樣吻合并通過水解ATP來轉(zhuǎn)運(yùn)底物。此外,ABCBl也是與腫瘤多藥耐藥有關(guān)的新的藥物排出泵,是腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制之一。因此,對(duì)ABCBl的抑制劑或底物的研究具有重要意義。目前尚未有在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)hABCBI的相關(guān)方法報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003]本發(fā)明的目的是提出一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)hABCBI的方法,通過該方法制得的hABCBI可用于hABCBI底物或抑制劑的檢測(cè)。本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):
      一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)人hABCBI的方法,包括如下步驟:
      步驟一,人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的hABCBI基因;
      步驟二,將hABCBI基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點(diǎn),得到重組質(zhì)粒pFastBac1-hABCBI ;
      步驟三,將重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCBl轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組,獲得插入hABCBI基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl ;
      步驟四,脂質(zhì)體介導(dǎo)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,獲高滴度的hABCBI的重組病毒;
      步驟五,hABCBI的重組病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞,大量表達(dá)hABCBI蛋白。
      [0004]本發(fā)明進(jìn)一步地,步驟一所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的人hABCBI基因通過如下方法獲得:根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000927.4,在5 ‘端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列,在3’端添加HindIII酶切位點(diǎn)序列,序列總長(zhǎng)度為4056bp。
      [0005]本發(fā)明進(jìn)一步地,還包含對(duì)所述重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl的鑒定方法。所述的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl的鑒定方法采用PCR鑒定,步驟如下:分別以T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T_hABCBl F: (SEQ ID N0.3)和T-hABCBl R: (SEQ ID N0.4)、或\和T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-hABCBl R: (SEQ IDN0.4)為引物組合對(duì)SF9-hABCBl基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的4372bp、460bp、875bp目標(biāo)片段,即為hABCBl基因在SF9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完成。
      [0006]本發(fā)明進(jìn)一步地,還包括重組hABCBl蛋白功能的鑒定方法,步驟如下:將ABCBl蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物加入表達(dá)ABCBl蛋白的細(xì)胞膜中,參與ATP/AMP反應(yīng),反應(yīng)終止后將細(xì)胞膜中微囊泡外面的轉(zhuǎn)運(yùn)底物洗去,通過液質(zhì)聯(lián)用、熒光測(cè)定法或同位素標(biāo)記底物法中的一種來測(cè)定微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度,從而判定ABCBl蛋白的活性。
      [0007]本發(fā)明進(jìn)一步地,所述微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度越大,ABCBl的活性越高。
      [0008]本發(fā)明進(jìn)一步地,所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。
      [0009]本發(fā)明的應(yīng)用和實(shí)施使其顯著技術(shù)效果為:
      ①參照序列合成了hABCBl基因,進(jìn)而將其克隆入pFastBacl載體,并進(jìn)一步獲得含hABCBl基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,成功實(shí)現(xiàn)了 hABCBl基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá),為hABCBl的大量獲得提供一條新途徑,為人ABCBl蛋白的應(yīng)用開發(fā)打下工作基礎(chǔ);
      ②通過本發(fā)明方法可獲得高滴度的重組的桿狀病毒,進(jìn)而直接感染昆蟲細(xì)胞,有利于大規(guī)模生產(chǎn)其外源蛋白;
      ③利用本發(fā)明方法制得的重組人hABCBl蛋白制作成藥物體外測(cè)試試劑盒,可實(shí)現(xiàn)hABCBl蛋白底物或抑制劑藥物體外吸收測(cè)試的全自動(dòng)高通量篩選,與現(xiàn)有體外細(xì)胞ABCBl模型測(cè)試方法相比,靈活性更高、重復(fù)性更好。
      [0010]以下便結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步的詳述,以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。
      【具體實(shí)施方式】
      [0011 ] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明,但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法;所述試劑和材料,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑獲得。在以下的實(shí)施例中,未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
      [0012]一種在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)人hABCBl的方法,包括如下步驟:
      步驟一,人工合成兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的hABCBl基因。
      [0013]步驟二,將hABCBl基因克隆入pFastBacl載體的BamHI/Hindlll位點(diǎn),得到重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCBl ;所述的兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的人hABCBl基因通過如下方法獲得:根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000927.4,在5 ‘端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列,在3’端添加HindIII酶切位點(diǎn)序列,序列總長(zhǎng)度為4056bp,可將該序列信息發(fā)送至基因合成公司進(jìn)行人工合成基因。
      [0014]步驟三,將重組質(zhì)粒pFastBacl-hABCBl轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,與其中的桿狀病毒穿梭載體Bacmid重組,獲得插入hABCBl基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl ;該重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl的鑒定方法包括但不限于PCR鑒定,具體步驟詳述如下:
      分別以T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和T-pFast R: (SEQ ID N0.2)、T_hABCBl F: (SEQ IDN0.3)和T-hABCBl R:(SEQ ID N0.4)、T-pFast F:(SEQ ID N0.1 )和T-hABCBl R:(SEQ IDN0.4)為引物組合對(duì)SF9-hABCBl基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的4372bp、460bp、875bp目標(biāo)片段,即為hABCBI基因在SF9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完成。
      [0015]所述的重組病毒培養(yǎng)基為無血清無抗生素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。
      [0016]步驟四,脂質(zhì)體介導(dǎo)重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,獲高滴度的hABCBI的重組病毒;
      步驟五,hABCBI的重組病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞,大量表達(dá)hABCBI蛋白。
      [0017]本發(fā)明具體實(shí)施例的,還包括重組hABCBI蛋白功能的鑒定方法,步驟如下:將ABCBl蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物加入表達(dá)ABCBl蛋白的細(xì)胞膜中,加入ATP/AMP反應(yīng),反應(yīng)終止后將細(xì)胞膜中微囊泡外面的轉(zhuǎn)運(yùn)底物洗去,細(xì)胞微囊泡是各類細(xì)胞遭受一系列應(yīng)激(激活或凋亡)時(shí),從細(xì)胞質(zhì)膜上脫落而釋放的膜性小囊泡,可通過液質(zhì)聯(lián)用、熒光測(cè)定法或同位素標(biāo)記底物法中的一種來測(cè)定微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度,從而判定ABCBl蛋白的活性,所述微囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度越大,ABCBl的活性越高。
      [0018]本發(fā)明方法參照序列合成了 hABCBI基因,進(jìn)而將其克隆入pFastBacl載體,并進(jìn)一步獲得含MBCBl基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,成功實(shí)現(xiàn)了 hABCBI基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá),為hABCBI的大量獲得提供一條新途徑,為人ABCBl蛋白的應(yīng)用開發(fā)打下工作基礎(chǔ);通過本發(fā)明方法可獲得高滴度的重組的桿狀病毒,進(jìn)而直接感染昆蟲細(xì)胞,有利于大規(guī)模生產(chǎn)其外源蛋白;利用本發(fā)明方法制得的重組人hABCBI蛋白制作成藥物體外測(cè)試試劑盒,可實(shí)現(xiàn)hABCBI蛋白底物或抑制劑藥物體外吸收測(cè)試的全自動(dòng)高通量篩選,與現(xiàn)有體外細(xì)胞ABCBl模型測(cè)試方法相比,靈活性更高、重復(fù)性更好。
      [0019]【實(shí)施例1】pFastBacl-hABCBl表達(dá)載體的構(gòu)建
      (I)獲得兩端分別包含BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的hABCBI基因:
      根據(jù)NCBI參考序列信息NM_000927.4,選定其中長(zhǎng)度為4044bp的序列為目標(biāo)序列,在目標(biāo)序列的5 ‘端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列和在3’端添加HindIII酶切位點(diǎn)序列,序列總長(zhǎng)度為4056bp,序列詳細(xì)信息可見附表中的(SEQ ID N0.5),把該序列信息發(fā)送至基因合成公司進(jìn)行人工合成基因(蘇州金唯智生物科技有限公司)。
      [0020](SEQ ID N0.5)酶切位點(diǎn)序列 GGATCC < ΝΜ_000927.4 堿基序列 4044bp >AAGCTT HindIII酶切位點(diǎn)序列。
      [0021](2)hABCBI 基因克隆入 pFastBacl 載體:
      利用BamHI和HindIII核酸內(nèi)切酶(New England B1labs Inc.)分別對(duì)步驟(I)得到的hABCBI基因和pFastBacl載體(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)進(jìn)行雙酶切,獲得hABCBI基因目的片段和pFastBacl載體線性片段,用DNA連接酶(New England B1labs Inc.)處理連接兩片段,得到連接產(chǎn)物。
      [0022](3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒鑒定:
      將步驟(2)得到的連接產(chǎn)物ΙΟμΙ加入200μ1感受態(tài)DH5a大腸桿菌(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)中,輕搖混勻,置冰上30分鐘;42°C熱處理90秒,迅速置冰上5分鐘;加入800μ? 37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)液,置于37°C,220rpm振搖I小時(shí);500rpm離心后全部涂布于含lOOPg/mL氨芐西林的LB平板,37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種含lOOPg/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)基37°C過夜振蕩培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定。
      [0023]分別以T-pFast F: (SEQ ID N0.1 )和 T-pFast R: (SEQ ID N0.2), T-hABCBlF: (SEQ ID N0.3)和 T-hABCBl R: (SEQ ID N0.4)、T-pFast F: (SEQ ID N0.1 ) 和T-hABCBl R: (SEQ ID N0.4)為引物組合對(duì)提取的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的4372bp、460bp、875bp目標(biāo)片段,即為真正含有整合了目的基因的重組表達(dá)載體pFastBacl-hABCBlo引物設(shè)計(jì)如下:
      (SEQ ID N0.1):名稱:T-pFast F,序列:GATAACCATCTCGCAAATAA ;
      (SEQ ID N0.2):名稱:T-pFast R,序列:AATGCAGTGAAAAAAATGCT ;
      (SEQ ID N0.3):名稱:T-hABCBl F,序列:CATGATGCTGGTGTTTGGA ;
      (SEQ ID N0.4):名稱:T-hABCBl R,序列:GGCCAAAATCACAAGGGTTA。
      [0024]【實(shí)施例2】重組桿狀病毒的獲得
      將pFastBacl-hABCBl重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)(其中含有一個(gè)桿狀病毒穿梭載體簡(jiǎn)稱Bacmid,還有一個(gè)輔助質(zhì)粒),以獲得插入hABCBl基因的重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid-hABCBl。
      [0025](I)重組pFastBacl-hABCBl轉(zhuǎn)化進(jìn)入DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)座): ①取Iug重組表達(dá)載體pFastBacl-h
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