專利名稱：融合表達含有二硫鍵蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在真核宿主細胞中正確表達重組蛋白質(zhì)的方法和應(yīng)用，特別是正確表達生物活性與二硫鍵(鏈內(nèi)和鏈間)的形成密切相關(guān)的真核重組蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
早在七八十年代有文獻報道，發(fā)現(xiàn)一種后翻譯酶(Post-I^anslational Enzymes) -—Prolyl 4-hydroxylase,即脯氨?；鵢4_羥化酶，簡稱P4H。它能夠?qū)δz原家族蛋白的特征重復(fù)序列(Gly-X-Y) n中的Y進行羥化修飾(當Y是脯氨酸殘基時)，成為羥脯氨酸。只有當一定數(shù)量的脯氨酸殘基被修飾成4羥脯氨酸以后，膠原蛋白的三條多肽鏈才能正確折疊成三螺旋結(jié)構(gòu)域，也就是說只有被羥基化的膠原蛋白才可溶，才能正確折疊成有活性的蛋白。(Prockop et al.，N. Engl. J. Med. 311 :376-386 (1984).)脯氨?；?4-羥化酶，P4H是以α 2 β 2四聚體的形式存在的。(Berg et al. , J. Biol. Chem. 248 :1175-1192(1973) ；Tuderman e t al. , Eur. J. Biochem. 52 9-16(1975).)其中，α亞基包含有4脯氨?；u化的活性位點，是具有催化活性的部分。但是α亞基在沒有β亞基存在時不可溶，也沒有活性；而β亞基單獨能夠催化二硫鍵的形成，提高蛋白的穩(wěn)定性，有助于蛋白的正確折疊，被稱作二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，即PDI)。當形成四聚體以后，β亞基仍然保留有50 %的二硫鍵異構(gòu)活性。 (Pihlajaniemi et al. , Embo J. 6 :643-649(1987) ；Parkkonen et al. , Biochem. J. 256 1005-1011(1988) ；Koivu et al.，J.Biol. Chem. 262 :6447-6449(1987))。由于對膠原家族蛋白有翻譯后修飾作用，近年來，脯氨?；?4-羥化酶成為世界各國研究的熱點。美國、加拿大、芬蘭、澳大利亞、日本等國均有相關(guān)研究。其中，芬蘭的科學(xué)家Kari. Kivirikko在對脯氨酰基_4_羥化酶與各類型膠原蛋白的關(guān)系方面有十分卓著的研究成果，他有多篇論文和相關(guān)專利(美國)發(fā)表。Kari. Kivirikko關(guān)于脯氨酰基_4_羥化酶的最近一篇專利(美國)發(fā)表于2005 年7月觀日(U. S. Pat. NO. 2005/0164345A1)。在該專利中，他描敘了在釀酒酵母表達系統(tǒng)、 甲醇酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)中，用重組人脯氨酰基-4-羥化酶(P4H)協(xié)助表達重組人膠原蛋白或膠原蛋白原的方法。其中對重組人膠原蛋白Type I、TypeII、TypeIII、 TypeIV、TypeXIII、TypeX V、TypeX VIII在昆蟲細胞中表達系統(tǒng)中表達、和重組人膠原蛋白 TypeIII在酵母表達系統(tǒng)中表達作了比較詳細的介紹。另一篇發(fā)表于2002年的美國專利(U. S. I^at. N0. 6，451，557B1)，則通過表達重組人膠原蛋白TypeIII為例，詳細描敘了用酵母宿主菌共同表達重組人脯氨酰基_4_羥化酶 (P4H)和重組人膠原蛋白的方法。而最近的一篇發(fā)表于今年QOlO年)的美國專利，是由臺灣學(xué)者Chou，et al.的 (U. S. Pat. NO. 7279329)做出的，描敘了利用與重組人脯氨酰基_4_羥化酶(P4H)在昆蟲細胞株中的共表達，來分泌表達XXI型膠原蛋白的NCl區(qū)(C-terminal noncollagenous (NCl)
4domain)的方法。以上這些工作，指出了重組人脯氨?；?4-羥化酶(P4H)在細菌、酵母和昆蟲細胞表達系統(tǒng)中，對膠原蛋白家族的蛋白表達時的促進作用。也為我們表達膠原類蛋白，以及其它一些活性與二硫鍵的形成密切相關(guān)的真核重組蛋白質(zhì)，提供了一條思路。但是，在實際實驗工作中我們發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建重組人脯氨?；?4-羥化酶(P4H)兩個亞基(α和β)的共表達載體，方法較為繁瑣；并且，在工業(yè)上使用較多的真核表達系統(tǒng)畢赤酵母宿主菌(Pichia pastoris)中，重組人脯氨?；鵢4_羥化酶(P4H)單獨的表達量很低， 四聚體蛋白難以被檢測(Myllyharju et al. ,EMBO J. 16，1173-1180，1997)。實現(xiàn)四聚體蛋白與目的蛋白在同一宿主細胞中的共同表達也很難達到滿意的效果。為了解決這一問題， 我們把研究重點由人脯氨酰基-4-羥化酶(P4H)四聚體蛋白轉(zhuǎn)向了其中的β亞基，也就是重組人蛋白質(zhì)二鍵異構(gòu)Bl (human protein disulphide isomerase) 對于許多蛋白來講，二硫鍵的形成通常是蛋白正確折疊的基礎(chǔ)(Derman et al. (1993)Science262 :1744。7)。而蛋白正確折疊的過程需要依靠其它蛋白因子或折疊酶的輔助作用，這類蛋白因子或折疊酶被稱作分子伴侶(foldase and chaperone)。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)是折疊酶中的一種，它的家族成員廣泛存在于哺乳動物中，它們常見于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，主要職能是催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈的二硫鍵的形成、異構(gòu)及還原，進而幫助肽鏈正確折疊成有活性三級結(jié)構(gòu)。它是目前發(fā)現(xiàn)幫助蛋白質(zhì)折疊活性最高的折疊酶。另外在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解途徑ERAD蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、鈣穩(wěn)態(tài)、 抗原提呈及病毒入侵等方面它們也起重要作用(ELLGAARDL，RUDDOCK L W. EMBO Rep, 2005, 6:28-32.)?；赑DI蛋白作為脯氨?；?4-羥化酶(P4H)四聚體蛋白的β亞基，和作為折疊酶的這些關(guān)鍵特性，我們相信，它應(yīng)該能夠從基因工程的層面，為我們提供一個解決生物工程研發(fā)和生產(chǎn)蛋白類藥物的過程中廣泛存在的包涵體(Inclusion Bodies, IB)問題的方法。畢赤酵母(Pichia pastoris)是工業(yè)上使用較多的真核表達系統(tǒng)，由于它培養(yǎng)方便，產(chǎn)量高，成本低等特點，被廣泛地用來做表達外源蛋白的真核宿主。雖然，畢赤酵母本身同樣帶有 PDI 蛋白(TIAN G, XIANG S, NOIVA R, et al. Cell，2006，124 :61-73.)，能夠輔助表達蛋白的折疊，但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，仍舊有大量外源蛋白在畢赤酵母中不表達，或者表達量極低。采用多拷貝或改用酵母偏好密碼子等方法仍然不能改變這一狀況。經(jīng)過多次嘗試后，我們試著從重組蛋白本身尋找原因。由于我們的重組蛋白多半來源于哺乳動物，例如人源的蛋白就非常廣泛，而哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在著自己的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，這些酶與酵母菌的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶同源性并不高。由此推測，在畢赤酵母體系表達的重組蛋白，在缺少相對應(yīng)來源的折疊酶的情況下，無法折疊成它們的天然結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了上敘問題。于是我們設(shè)想，在酵母宿主中，用融合的方式表達重組人源蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(hPDI)和目的蛋白(特別是人源蛋白)，即將人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶全長蛋白或者其突變體，以直接或者通過連接肽Linker連接的方式，連接在目的蛋白的N端， 實現(xiàn)融合表達。這樣設(shè)計的好處，一來是能夠利用hPDI蛋白在畢赤酵母中的高表達特性， 詳見本人專利(申請?zhí)?01010567613. 5) JfhPDI蛋白作為引導(dǎo)序列，帶出目的蛋白分泌表達；二來，突變后的hPDI蛋白具有-HDEL尾巴，更有利于定位酵母宿主細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜， 使目的蛋白在hPDI的輔助下形成正確的二硫鍵，進而折疊成正確的構(gòu)象；再者，融合在目的蛋白N末端的hPDI蛋白，也避免了畢赤酵母表達產(chǎn)物的N端不均一現(xiàn)象(Boehm，Τ.，et al. Yeast 15，563. 572)，保護了目的蛋白的完整性。這一設(shè)想，經(jīng)過我們對來自于人膠原家族的幾個蛋白Endostatin、Tumstatin, Canstatin、ArrestiruAngiostatin進行所述方式的融合表達，——得到了驗證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容是提供一種在真核宿主細胞中表達外源重組蛋白質(zhì)的方法，特別是活性結(jié)構(gòu)與二硫鍵(鏈內(nèi)和鏈間)的形成密切相關(guān)的真核重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法包括1.制備能表達、具有生物活性的hPDI全長基因；2.突變hPDI全長基因，并與連接肽連接，得到hPDI491_L突變基因；3.制備能表達、具有生物活性的人內(nèi)皮抑制素(Endostatin)全長基因；4.將hPDI491_L突變基因和人內(nèi)皮抑制素(Endostatin)全長基因與表達載體重組；5.用所述載體轉(zhuǎn)染宿主細胞；6.培養(yǎng)所述宿主細胞；7.純化融合蛋白，并在酶切后進一步純化目的蛋白。本發(fā)明從人肝臟cDNA文庫中用PCR的方法克隆hPDI cDNA全長基因。所述hPDI cDNA全長基因?qū)?yīng)的氨基酸序列如序列表SEQ-I所示。本發(fā)明的hPDI cDNA全長基因來源不局限于任何特定的人體細胞、細胞株或組織， 只要它含hPDI mRNA。本發(fā)明所述的重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的突變體，不限于該酶何種形式的突變體，只要它有利于目的蛋白在真核宿主中的表達和正確折疊。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用的突變體去掉了重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶自身的信號序列(l-17aa)，并將蛋白的末端由-KDEL改為-HDEL，突變后的氨基酸序列如序列表SEQ-2所示。本發(fā)明的表達產(chǎn)物分泌到胞外，存在于宿主細胞培養(yǎng)液上清內(nèi)。離心去除宿主細胞，可從培養(yǎng)液上清分離和純化融合蛋白。融合蛋白經(jīng)過腸激酶酶切后，可以分離得到純化的目的蛋白。所述表達產(chǎn)物重組人內(nèi)皮抑素(Endostatin)蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表SEQ-4所示。本發(fā)明用融合表達的方式對膠原蛋白家族的蛋白重組人內(nèi)皮抑素 (Endostatin)進行大量生產(chǎn)，所得的蛋白產(chǎn)物為分泌、可溶蛋白。經(jīng)過簡單純化后，可以得到可溶的、末端均一的、活性很高的目的蛋白。該方法與已知的方法相比，不僅蛋白活性更高，產(chǎn)量更高，而且蛋白均一，安全，更適合用于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明所述的方法，不限于任何特定的蛋白，只要它能夠與重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶融合，并且在重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的輔助下進行正確的折疊。本專利設(shè)及到的大腸桿菌已于2010年12月16日提交保藏。保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址中國、湖北省武漢市、武漢大學(xué)；菌種保藏號為CCTCC M 2010353 ；分類命名為大腸埃希氏菌 K-12/pPICZalpha-hPDI 091)-Endostatin E2 ； Escherichia coliK-12/pPICZalpha-hPDI (491)-Endostatin E2。
本發(fā)明上述技術(shù)方法中分子生物學(xué)操作均參照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社，2002)。


圖 1 融合表達質(zhì)粒ppICh-hPDI-L-Endostatin基因構(gòu)建過程示意圖。圖2:2-1 從人肝cDNA Lib中PCR擴增endostatin基因，2號樣品擴增出了 600bps左右大小的的條帶，與endostatin基因大小相符。2-2,2-3 構(gòu)建的融合表達質(zhì)粒ppICh-hPDI-L-Endostatin酶切鑒定3號樣品，質(zhì)粒用》ιο I單酶切。由于hPDI基因帶有兩個Bio I位點，加上質(zhì)粒ppIC^i載體部分帶有一個》ιο I位點，因此Bio I單酶切質(zhì)粒能夠切下一條500bps和一條900bps的條帶，結(jié)果符合預(yù)期；4號樣品，質(zhì)粒用EcoR I+Not I雙酶切。構(gòu)建的載體上，EcoR I 位于Linker上，Not I是基因的下游插入位點，因此雙酶切能夠切下Endostatin基因， 也就是600bps左右的條帶，結(jié)果符合預(yù)期。由此圖可以從酶切的角度確定構(gòu)建的質(zhì)粒 pp I CZa-hPD I -L-Endo statin IE石角。圖 3 構(gòu)建的質(zhì)粒ppICh-hPDI-L-Endostatin用3，AOX引物的測序報告，測序結(jié)果顯示，插入的基因Endostatin序列以及位置正確。圖 4 構(gòu)建的質(zhì)粒ppICh-hPDI-L-Endostatin，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入甲醇酵母宿主菌X33 后，篩選出了 PE1、PE2、PE8#三個單克隆樣品，甲醇誘導(dǎo)48小時，將三個樣品的誘導(dǎo)培養(yǎng)上清液進行濃縮、脫鹽，以及EK酶酶切后，分別走濃度為8%的SDS-PAGE還原和非還原電泳， 比較結(jié)果。M 蛋白 marker1 樣品誘導(dǎo)前樣品上清2 :ΡΕ1#樣品誘導(dǎo)后上清3 :ΡΕ1#樣品誘導(dǎo)后，上清經(jīng)過濃縮脫鹽，用EK酶酶切1小時結(jié)果4 :ΡΕ2#樣品誘導(dǎo)后上清5 :ΡΕ2#樣品誘導(dǎo)后，上清經(jīng)過濃縮脫鹽，用EK酶酶切1小時結(jié)果6 :ΡΕ8#樣品誘導(dǎo)后上清7 :ΡΕ8#樣品誘導(dǎo)后，上清經(jīng)過濃縮脫鹽，用EK酶酶切1小時結(jié)果(1-8號樣品為還原電泳結(jié)果)M 蛋白 marker8 :PE2#樣品誘導(dǎo)前樣品上清9 :PE2#樣品誘導(dǎo)后上清10 :PE2#樣品誘導(dǎo)后，上清經(jīng)過濃縮脫鹽，用EK酶酶切1小時結(jié)果11 :PE8#樣品誘導(dǎo)后上清12 :PE8#樣品誘導(dǎo)后，上清經(jīng)過濃縮脫鹽，用EK酶酶切1小時結(jié)果(8-12號樣品為非還原電泳結(jié)果)電泳結(jié)果顯示，篩選的PE^i樣品在甲醇誘導(dǎo)48小時后，上清液里出現(xiàn)了大小在75KDa位置附近的蛋白條帶(hPDI-L-Endostatin蛋白大小是78. 3KDa)，經(jīng)過EK酶酶切1小時后，蛋白條帶被切成兩段，其中較大的一段略大于52KDa(hPDI-L蛋白大小是58. 2KDa)， 由此，我們可以認為表達的蛋白條帶是目的蛋白hPDI-L-Endostatin。
具體實施例方式實施例1 設(shè)計、構(gòu)建重組質(zhì)粒，表達融合蛋白(1)克隆 hPDI5tl8CDNA 基因參照hPDI基因序列，設(shè)計引物，用PCR方法，從商業(yè)化人肝臟cDNA文庫中擴增全長hPDI基因。擴增產(chǎn)物從限制性內(nèi)切酶Bio I和NotI位點切出，與畢赤酵母表達質(zhì)粒 pPICZ α重組，構(gòu)建表達質(zhì)粒pPICZ α -hPDI508,轉(zhuǎn)化NovaBlue宿主菌。抽提質(zhì)粒，再通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點酶切分析，以特征片段篩選質(zhì)粒，然后用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有hPDI全長基因的陽性克隆。本發(fā)明所采用的限制性內(nèi)切酶來自Takara公司，商業(yè)化人肝臟cDNA文庫來自 Biochain公司，甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母菌株X33、畢赤酵母多拷貝表達載體pPICZ α來自 Invitrogen 公司。(2)突變?nèi)LhPDI基因用常規(guī)PCR方法，通過合成上下游引物，突變?nèi)L基因。反映在氨基酸水平上就是去掉hPDI蛋白的信號序列(l-17aa)，以及突變基因的3’末端-KDEL成為-HDEL，參考本人專利(申請?zhí)?01010567613. 5)。并用另外合成的引物，同樣用常規(guī)PCR的方式，在突變后的hPDI491基因的3，端加入連接序列Linker (SEQ-3)，即得到hPDI491_L的PCR產(chǎn)物。 將擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體重組，構(gòu)建新的表達質(zhì)粒pGEM-T-hPDI491_L，轉(zhuǎn)化 NovaBlue宿主菌。抽提質(zhì)粒，再通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點酶切分析，以特征片段篩選質(zhì)粒，然后用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有hPDI491-L基因的陽性克隆。本發(fā)明所采用的pGEM-T載體來自Promega公司。(3)克隆人內(nèi)皮抑制素(endostatin)基因參照網(wǎng)上公布的膠原蛋白家族的的幾個蛋白的基因序列，設(shè)計引物，用PCR方法， 從商業(yè)化人肝臟cDNA文庫中擴增膠原蛋白家族的人內(nèi)皮抑制素(endostatin)基因，將擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體重組，構(gòu)建新的表達質(zhì)粒pGEM-T-Endostatin，轉(zhuǎn)化NovaBlue宿主菌。 抽提質(zhì)粒，再通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點酶切分析，以特征片段篩選質(zhì)粒，然后用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有Endostatin基因的陽性克隆。(4)構(gòu)建質(zhì)粒，篩選及表達融合蛋白hPDI491-L-Endostatin將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pGEM-T-hPDI491-L 和 pGEM-T-Endostatin 分別用 XhoI+BamHI、 BamHI+NotI雙酶切，酶切產(chǎn)物與畢赤酵母表達質(zhì)粒pPICZ α重組，構(gòu)建表達質(zhì)粒 pPICZ α -hPDI491-L_Endostatin轉(zhuǎn)化NovaBlue宿主菌。抽提質(zhì)粒，再通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點酶切分析，以特征片段篩選質(zhì)粒，然后用核苷酸序列分析，證實基因重組的位置以及序列正確，獲得帶有IiPDI491-L-End0Statin融合基因的陽性克隆。抽提構(gòu)建好的質(zhì)粒pPICZ α -hPDI491-L-EndOStatin，用限制性內(nèi)切酶McI線性化以后，電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母野生型宿主菌X33中。經(jīng)過kocin抗性平板篩選，獲得陽性克隆。將陽性克隆接種至BMGY培養(yǎng)基，其中含酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH6. 0),1.34% YNB, 0X 10_5) %生物素和1 %甘油，30°C培養(yǎng)至菌體光密度OD6tltlnm達到 2 6時，離心去除培養(yǎng)液，將菌體沉淀用甲醇復(fù)合型培養(yǎng)基BMMY稀釋至OD6tltlnm到1，培養(yǎng)基 BMMY含有酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0)，1. 34% YNB, (4X IO"5) % 生物素，0. 5%甲醇。30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時，每12小時取樣并補加甲醇維持其濃度0. 5%, 保留培養(yǎng)液上清，用上清做8% SDS-PAGE非還原電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，掃描定純度，分子量。結(jié)果顯示，甲醇誘導(dǎo)后，上清液在相應(yīng)的分子量位置有濃集的條帶。經(jīng)掃描大致確定目的蛋白占上清液菌體表達總蛋白的50 %以上。實施例2 融合蛋白的純化1. CM Sepharose Fast Flow 柱層析用50mM HAc-NaAc (pH 4. 2)平衡柱子，把含有目的蛋白的樣液稀釋到電導(dǎo)與平衡緩沖液一致，并調(diào)節(jié)PH至4. 2，開始上樣，上樣結(jié)束后用平衡緩沖液沖洗6個柱體積，再用 50mMHAc-NaAc (pH4. 0) +IM NaCl 洗脫，收集 2 個柱體積。2. Chelating Sepharose Fast Flow 層析CM洗脫液用水稀釋1倍，再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7. 4，上已用50mMTris-HCl (pH 7. 4)+0. 5M NaCl 平衡好的 Chelating Sepharose Fast Flow 柱，上樣結(jié)束后用平衡緩沖液沖洗6個柱體積，再用50mMTris-HCl (pH 7. 4) +20mM咪唑洗去雜質(zhì)，最后用 50mMTris-HCl (pH7. 4) +200mM咪唑洗脫，收集2個柱體積。3. Chelating Sepharose Fast Flow 洗脫液用 IOKD 超濾膜超濾。4.蛋白用牛源腸激酶(rEK)在37°C酶切1小時。5. SP Sepharose Fast Flow 柱層析用50mMTris-HCl(pH 7. 0)平衡柱子，把酶切后溶液的電導(dǎo)和pH調(diào)節(jié)到與平衡緩沖液一致，開始上樣，上樣結(jié)束后用平衡緩沖液沖洗6個柱體積，再用50mMTriS-HCl (pH 7. 0) +0. 3MNaCl洗滌雜質(zhì)，最后用50mMTris_HCl (pH 7. 0) +IMNaCl洗脫，收集3個柱體積。6. Sephadex G-25脫鹽后得到可溶的目的蛋白Endostatin。蛋白質(zhì)分子序列SEQ-I序列說明(1)序列描述人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶全長蛋白(2)分子類型蛋白質(zhì)(3)序列特征a.長度:508aab.分子量57. IKDac.等電點4.761 MLRRALLCLA VAALVRADAP EEEDHVLVLR KSNFAEALAA HKYLLVEFYA51 PffCGHCKALA PEYAKAAGKL KAEGSEIRLA KVDATEESDL AQQYGVRGYP101TIKFFRNGDT ASPKEYTAGR EADDIVNWLK KRTGPAATTL PDGAAAESLV151ESSEVAVIGF FKDVESDSAK QFLQAAEAID DIPFGITSNS DVFSKYQLDK201DGVVLFKKFD EGRNNFEGEV TKENLLDFIK HNQLPLVIEF TEQTAPKIFG251GEIKTHILLF LPKSVSDYDG KLSNFKTAAE SFKGKILFIF IDSDHTDNQR
9
301ILEFFGLKKE ECPAVRLITL EEEMTKYKPE SEELTAERIT EFCHRFLEGK351IKPHLMSQEL PEDffDKQPVK VLVGKNFEDV AFDEKKNVFV EFYAPffCGHC40IKQLAPIffDKL GETYKDHENI VIAKMDSTAN EVEAVKVHSF PTLKFFPASA451DRTVIDYNGE RTLDGFKKFL ESGGQDGAGD DDDLEDLEEA EEPDMEEDDD501QKAVKDELSEQ-2(4)序列描述人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體(5)分子類型蛋白質(zhì)(6)序列特征a.長度491aab.分子量55. 3KDac.等電點4.691 DAPEEEDHVL VLRKSNFAEA LAAHKYLLVE FYAPffCGHCK ALAPEYAKAA51GKLKAEGSEI RLAKVDATEE SDLAQQYGVR GYPTIKFFRN GDTASPKEYT101AGREADDIVN WLKKRTGPAA TTLPDGAAAE SLVESSEVAV IGFFKDVESD151SAKQFLQAAE AIDDIPFGIT SNSDVFSKYQ LDKDGVVLFK KFDEGRNNFE201GEVTKENLLD FIKHNQLPLV IEFTEQTAPK IFGGEIKTHI LLFLPKSVSD251YDGKLSNFKT AAESFKGKIL FIFIDSDHTD NQRILEFFGL KKEECPAVRL301ITLEEEMTKY KPESEELTAE RITEFCHRFL EGKIKPHLMS QELPEDffDKQ351PVKVLVGKNF EDVAFDEKKN VFVEFYAPffC GHCKQLAPIff DKLGETYKDH40IENIVIAKMDS TANEVEAVKV HSFPTLKFFP ASADRTVIDY NGERTLDGFK451KFLESGGQDG A⑶DDDLEDL EEAEEPDMEE DDDQKAVHDE L-SEQ-3(7)序列描述連接肽(8)分子類型多肽(9)序列特征a.長度30aab.分子量2. 8KDac.等電點5.721GTEFGGGGSG GGGSHHHHHH GGGGSDDDDKHSEQ-4(10)序列描述人內(nèi)皮抑素全長蛋白(Endostatin)(11)分子類型蛋白質(zhì)(12)序列特征a.長度183aab.分子量20. IKDac.等電點9.301 HSHRDFQPVL HLVALNSPLS GGMRGIRGAD FQCFQQARAV GLAGTFRAFL
51 SSRLQDLYSI VRRADRAAVP IVNLKDELLF PSffEALFSGS EGPLKPGARI101FSFDGKDVLR HPTffPQKSVff HGSDPNGRRL TESYCETffRT EAPSATGQAS151SLLGGRLLGQ SAASCHHAYI VLCIENSFMT ASKSEQ-5(13)序列描述融合蛋白(hPDI-L-Endostatin)(14)分子類型蛋白質(zhì)(15)序列特征a.長度:705aab.分子量78. 3KDac.等電點5.081 MDAPEEEDHV LVLRKSNFAE ALAAHKYLLV EFYAPffCGHC KALAPEYAKA51 AGKLKAEGSE IRLAKVDATE ESDLAQQYGV RGYPTIKFFR NGDTASPKEY101TAGREADDIV NWLKKRTGPA ATTLPDGAAA ESLVESSEVA VIGFFKDVES151DSAKQFLQAA EAIDDIPFGI TSNSDVFSKY QLDKDGVVLF KKFDEGRNNF201EGEVTKENLL DFIKHNQLPL VIEFTEQTAP KIFGGEIKTH ILLFLPKSVS251DYDGKLSNFK TAAESFKGKI LFIFIDSDHT DNQRILEFFG LKKEECPAVR301LITLEEEMTK YKPESEELTA ERITEFCHRF LEGKIKPHLM SQELPEDffDK351QPVKVLVGKN FEDVAFDEKK NVFVEFYAPff CGHCKQLAPI WDKLGETYKD40IHENIVIAKMD STANEVEAVK VHSFPTLKFF PASADRTVID YNGERTLDGF451KKFLESGGQD GAGDDDDLED LEEAEEPDME EDDDQKAVHD ELGTEFGGGG501SGGGGSHHHH HHGGGGSDDD DKHSHRDFQP VLHLVALNSP LSGGMRGIRG551ADFQCFQQAR AVGLAGTFRA FLSSRLQDLY SIVRRADRAA VPIVNLKDEL60ILFPSffEALFS GSEGPLKPGA RIFSFDGKDV LRHPTffPQKS VffHGSDPNGR65IRLTESYCETff RTEAPSATGQ ASSLLGGRLL GQSAASCHHA YIVLCIENSF70IMTASKH
權(quán)利要求
1.一種在真核宿主細胞中融合表達重組蛋白的方法，其特征在于融合表達的重組蛋白具有下列結(jié)構(gòu)之中的一種a)· P-Xb)·P-L-Xc).MP-Xd).MP-L-X其中，P代表重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(human protein disulphide isomerase)；MP代表重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體(mutant of human protein disulphide isomerase)；L 表示連接肽(linker sequence)；X 代表目的蛋白(interest protein)。
2.一種在真核宿主細胞中融合表達重組蛋白的方法，其特征在于融合表達的重組蛋白具有下列結(jié)構(gòu)之中的一種a)· P-Xb)·P-L-Xc).MP-Xd).MP-L-X其中，P代表重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(human protein disulphide isomerase)； MP代表重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體(mutant of human protein disulphide isomerase)；L 表示連接肽(linker sequence)；X 代表目的蛋白(interest protein)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中編碼重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(即P蛋白)的基因克隆自人體組織細胞總RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述，其中的人體組織細胞總RNA不限于人體特定的細胞、細胞株或組織，只要它含hPDI mRNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2和3所述，其中的重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(即P蛋白)的氨基酸序列是SEQ-I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體，即MP蛋白， 不限于該酶何種形式的突變體，只要它有利于目的蛋白在真核宿主中的表達和正確折疊。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的方法，其中的重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶突變體(即MP 蛋白)是將全長的人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(hPDI)的編碼信號序列的1-17個氨基酸殘基截除，并將Lys (505)突變?yōu)镠is (505)，得到一條含有491個氨基酸的多肽鏈，其N-端前8個氨基酸殘基是DAPEEEDH-，C-端末尾6個氨基酸殘基是-AVHDEL (即r_hPDI491)，其氨基酸序列是SEQ-2，菌種保藏編號CCTCC M 2010318。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的linkersequence (L)序列不限于任何一種連接肽序列，它可以包含有(Gly4Ser)n, (Gly)n, (Ser)n, (His)6、腸激酶(rEK)識別序列DDDDK 1、 煙草蝕紋病毒蛋白酶(rTEV)的識別序列ENLYFQ 1 G、凝血酶(Thrombin)識別序列LVPR 1 GS 或凝血因子fe的識別序列IEGR 1的各種組合，只要它有利于蛋白連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和7所述的方法，其中的連接肽linkersequence (L)具有SEQ-3所示的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的目的蛋白，即X蛋白，不限于任何特定的蛋白， 只要它能夠與重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶融合，并且在重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的輔助下進行正確的折疊。
11.根據(jù)權(quán)利要求1和9所述的方法，其中的目的蛋白，即X蛋白，包括膠原蛋白家族的 Endostatin、Tumstatin、Arrestin、Canstatin 禾口 Angiostatin,以及它們的截短型或突變型蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、9和10所述，其中的目的蛋白，即X蛋白，當它特指Endostatin全長蛋白的時候，其全長蛋白的氨基酸序列是SEQ-4;融合表達時，分泌的融合蛋白的氨基酸序列是SEQ-5，菌種保藏編號CCTCC M 2010353。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的真核宿主細胞不局限于任何特定的宿主細胞， 只要它能夠表達所述的融合蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1和12所述的方法，其中所述的真核宿主細胞為甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母菌株X33。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合表達含有二硫鍵蛋白質(zhì)的方法。具體涉及一種在真核宿主細胞中，融合表達重組蛋白質(zhì)，特別是活性與二硫鍵的形成(鏈內(nèi)和鏈間)密切相關(guān)的真核重組蛋白質(zhì)的方法。通過一種融合重組人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(human protein disulphide isomerase，hPDI)或者融合其突變體的方法，在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中，表達外源重組蛋白。該方法適合表達蛋白活性或蛋白折疊(包括單體、二聚體或多聚體形式)有耐于二硫鍵的正確形成的真核外源蛋白質(zhì)。通過這種方式表達的蛋白質(zhì)容易被細胞分泌出胞外，產(chǎn)量高，產(chǎn)物不會大量聚集，產(chǎn)物容易被捕獲及純化，而且得到的目的蛋白N末端均一，活性高。該方法表達的重組蛋白質(zhì)，有利于進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/79GK102533839SQ20101060108
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者余彩霞, 張潔, 王建權(quán) 申請人:上海開陽生物科技有限公司