包含額外的二硫鍵的胰島素衍生物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2011年6月21日的中國專利申請201180031021. 4"包含額外 的二硫鍵的胰島素衍生物"的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及包含額外的二硫鍵的胰島素衍生物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 糖尿病是代謝病，在這種病中，利用葡萄糖的能力部分或完全喪失。在糖尿病的 治療中，已經(jīng)提出并使用了許多種胰島素制劑，如常規(guī)胰島素、低精蛋白鋅胰島素（指定為 NPH)，胰島素鋅懸浮液（如Semilente1''、Lcntc'Hlltralcntck.)以及兩相低精蛋白鋅 胰島素。
[0004] 人胰島素由兩個(gè)多肽鏈組成，即A和B鏈，其分別包含21個(gè)和30個(gè)氨基酸殘基。 A和B鏈通過兩個(gè)二硫鍵相互連接。來自大多數(shù)其它物種的胰島素是相似的，但在一些位置 可能包含氨基酸取代。在過去十年內(nèi)，已經(jīng)開發(fā)了許多人胰島素類似物。它們是設(shè)計(jì)用于 特定的作用模式，即快速作用或延長作用。包括這種胰島素類似物的商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品 包括Levemir?、NovoRapid?、Humalog?、Apidra?和Lantus?。
[0005] 多種蛋白酶的作用使人胰島素在胃腸道的內(nèi)腔中迅速降解，限制了其吸收進(jìn)入循 環(huán)系統(tǒng)。當(dāng)與天然胰島素相比，親水的并且對蛋白水解性降解穩(wěn)定的胰島素類似物在動物 模型中表現(xiàn)出更高的生物利用度。
[0006] 將二硫鍵引入蛋白是改善蛋白穩(wěn)定性一種天然方式：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)二硫鍵的豐度和 嗜熱生物體間最高的生長溫度之間的相關(guān)性，暗示了高溫環(huán)境中二硫鍵在蛋白穩(wěn)定中的重 要性〇\&1111。1^?，等，2002，？1'〇。.恥七1.八。&(1.5(^.舊八，99,9679-9684.:1^(16118七61111?，等， 2006, FEBS J.，273,4170-4185)。也有許多成功地將二硫鍵工程化進(jìn)蛋白并伴隨穩(wěn)定性增 加的例子。對于芽孢桿菌RNAse獲得了一種最高的穩(wěn)定作用（Clarke J.，F(xiàn)ersht A.，1993， Biochem. ,32,4322-4329)。通過增加解折疊（unfolding)所需的活化能，或者通過約束蛋 白的解折疊的構(gòu)象從而降低它們的構(gòu)象熵，帶來了這種穩(wěn)定作用（Pace C. N.，1990，Trends Biol. Sci.，14-17)。然而，在這個(gè)新興的研究領(lǐng)域，需要學(xué)習(xí)的多得多。至今，沒有胰島素 中工程化的二硫鍵的報(bào)道。
[0007] 仍然需要穩(wěn)定的新的胰島素衍生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及具有兩個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸取代和連接于胰島素的側(cè)鏈的胰島素衍 生物，其中保留人胰島素的三個(gè)二硫鍵，選擇半胱氨酸取代的位點(diǎn)的方式使得引入的半胱 氨酸殘基位于折疊的胰島素衍生物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于人胰島素中的一個(gè)或多 個(gè)額外的二硫鍵的形成。
[0009] 在一個(gè)方面，獲得了本發(fā)明的胰島素衍生物，其中選擇半胱氨酸取代的位點(diǎn)的方 式使得（1)引入的半胱氨酸殘基位于折疊的胰島素衍生物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于 人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的形成，以及（2)胰島素衍生物保留了與人胰島素 相關(guān)的期望的生物活性。
[0010] 在一個(gè)方面，獲得了本發(fā)明的胰島素衍生物，其中選擇半胱氨酸取代的位點(diǎn)的方 式使得（1)引入的半胱氨酸殘基位于折疊的胰島素衍生物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于 人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的形成，（2)胰島素衍生物保留了與人胰島素相關(guān) 的期望的生物活性，以及（3)胰島素衍生物相對于人胰島素和/或沒有一個(gè)或多個(gè)額外的 二硫鍵的胰島素衍生物增加了物理穩(wěn)定性。
[0011] 在一個(gè)方面，獲得了本發(fā)明的胰島素衍生物，其中選擇半胱氨酸取代的位點(diǎn)的方 式使得（1)引入的半胱氨酸殘基位于折疊的胰島素衍生物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于 人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的形成，（2)胰島素衍生物保留了與人胰島素相關(guān) 的期望的生物活性，以及（3)胰島素衍生物對蛋白水解性降解是穩(wěn)定的。
[0012] 本文中還描述了用于穩(wěn)定胰島素衍生物的方法，包括用半胱氨酸殘基取代胰島素 的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸并且將側(cè)鏈連接于胰島素，其中
[0013] a.保留人胰島素的三個(gè)二硫鍵，以及
[0014] b.選擇半胱氨酸取代的位點(diǎn)的方式使得引入的半胱氨酸殘基位于折疊的胰島素 衍生物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的形成，
[0015] 從而產(chǎn)生胰島素衍生物，其包含不存在于人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)額外的二硫 鍵。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明中，提供了新的胰島素衍生物，其中將二硫鍵工程化進(jìn)胰島素衍生物。
[0017] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的胰島素衍生物具有兩個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸取代，保留了人 胰島素的三個(gè)二硫鍵。
[0018] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的胰島素衍生物具有側(cè)鏈。在一個(gè)方面，側(cè)鏈連接于賴氨酸殘 基的S氨基。在一個(gè)方面，側(cè)鏈連接于B-鏈中賴氨酸殘基的 e氨基。
[0019] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的胰島素衍生物具有兩個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸取代，保留的人 胰島素的三個(gè)二硫鍵以及連接于如B-鏈中的賴氨酸殘基的 e氨基的側(cè)鏈。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，選擇半胱氨酸取代的位點(diǎn)的方式使得引入的半胱氨酸殘基 位于折疊的胰島素衍生物的三維結(jié)構(gòu)中，以允許不存在于人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)額外的 二硫鍵的形成。
[0021] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的胰島素衍生物具有改善的物理穩(wěn)定性。因此已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)，例如，類似物暴露于熱-機(jī)械應(yīng)激和/或與不穩(wěn)定的界面和表面如疏水表面和界面的相 互作用導(dǎo)致的本發(fā)明的胰島素衍生物形成胰島素類似物的無生物活性的和/或不溶性的 聚集體的趨勢降低。
[0022] 本發(fā)明的人胰島素衍生物結(jié)合于胰島素受體。本發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明 的人胰島素衍生物既具有改善的物理穩(wěn)定性又保留與胰島素受體的結(jié)合。
[0023] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的胰島素衍生物，即包含一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵，比沒有一 個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的相似胰島素衍生物更持效。"更持效"在本文中意味著它們具有 更長的清除半衰期，或者換言之，持續(xù)延長的期間即更長的作用持續(xù)時(shí)間的胰島素效應(yīng)。因 此，本發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，與沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的相似胰島素衍生物相比， 包含一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的胰島素衍生物可以具有長清除半衰期，或者換言之，持續(xù) 延長的期間即持效的作用持續(xù)時(shí)間的胰島素效應(yīng)。
[0024] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的胰島素衍生物針對蛋白水解性降解，即針對胃腸（GI)道中 或身體其它部位的快速降解，是穩(wěn)定的。在一個(gè)方面，相對于沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵 的胰島素衍生物，本發(fā)明的胰島素衍生物針對蛋白水解性降解是穩(wěn)定的。
[0025] 針對蛋白水解性降解穩(wěn)定的胰島素衍生物在本文被理解為胰島素衍生物，相對于 人胰島素，其經(jīng)受一種或多種蛋白酶的更慢的降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對于人胰島素， 本發(fā)明的胰島素衍生物經(jīng)受一種或多種蛋白酶的更慢的降解。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施 方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物針對一種或多種酶的降解是穩(wěn)定的，該酶選自：胃蛋白酶 (如，例如，同種型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶（如， 例如，同種型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)，胰蛋白酶，胰島素-降解酶（IDE)， 彈性蛋白酶（例如，同種型胰腺彈性蛋白酶I和/或II)，羧肽酶（例如，同種型羧基肽酶 A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，組織蛋白酶D及源自大鼠、豬或人的腸提取物中存在 的其它酶。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物針對一種或多種酶的降解是穩(wěn)定的， 該酶選自：糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰島素-降解酶（IDE)，彈性蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶和組織 蛋白酶D。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物針對一種或多種酶的降解是穩(wěn) 定的，該酶選自：糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生 物針對一種或多種酶的降解是穩(wěn)定的，該酶選自：糜蛋白酶和IDE。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，本發(fā)明的胰島素衍生物針對一種或多種酶的降解是穩(wěn)定的，該酶選自：糜蛋白酶和羧肽 酶。
[0027] "蛋白酶（protease) "或"蛋白酶（protease enzyme) "是消化酶，其可以使蛋白 和肽降解，并且可以在人體的各種組織中發(fā)現(xiàn)它，例如胃（胃蛋白酶），腸腔（糜蛋白酶，胰 蛋白酶，彈性蛋白酶，羧肽酶，等）或胃腸道的粘膜表面（氨肽酶，羧肽酶，腸肽酶，二肽基肽 酶，內(nèi)肽酶，等等），肝（胰島素降解酶，組織蛋白酶D等），和其它組織中。
[0028] 可以如實(shí)施例102中所述測定T1/2作為本發(fā)明的胰島素衍生物對蛋白酶如糜蛋 白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A或者對酶的混合物如組織提取液（來自肝，腎，十二指腸， 空腸，回腸，結(jié)腸，胃，等）的蛋白水解穩(wěn)定性的量度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，相對于 人胰島素，T1/2增力卩。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的胰 島素衍生物，T1/2增加。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于人胰島素，T1/2增加至少2倍。 在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的胰島素衍生物，T1/2增 加至少2倍。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于人胰島素，T1/2增加至少3倍。在仍進(jìn)一步 的實(shí)施方案中，相對于沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的胰島素衍生物，T1/2增加至少3倍。 在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于人胰島素，T1/2增加至少4倍。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，相對于沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的胰島素衍生物，T1/2增加至少4倍。在仍進(jìn)一 步的實(shí)施方案中，相對于人胰島素，T1/2增加至少5倍。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于 沒有一個(gè)或多個(gè)額外的二硫鍵的胰島素衍生物，T1/2增加至少5倍。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，相對于人胰島素，T1/2增加至少10倍。在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，相對于沒有一個(gè) 或多個(gè)額外的二硫鍵的胰島素衍生物，T1/2增加至少10倍。
[0029] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的胰島素衍生