專利名稱：血液1,5-脫水葡萄糖醇的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化技術(shù)以及生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，特別是用于體外定量測定血液中1， 5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)含量的檢測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
糖尿病屬于臨床常見病、多發(fā)病，原因是胰島素分泌不足引起，血液中1，5_脫水山梨醇(1，5-AG)與葡萄糖(GLU)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、果糖胺(FMN)呈顯著的負(fù)相關(guān)。 有資料表明，血漿葡萄糖(GLU) >8.3mmol/L者，無一例伴有高水平的血漿1，5_脫水葡萄糖醇(1，5-AG)。1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)可以作為糖尿病患者早期診斷的靈敏性特異性指標(biāo)，亦可作為糖尿病治療與愈后觀察的評(píng)價(jià)指標(biāo)?，F(xiàn)行的糖尿病診斷指標(biāo)有明顯的不足，空腹血糖測定不靈敏，其決定水平難以定論，尤其對(duì)于II型糖尿病病人漏診率較高；口服糖耐量實(shí)驗(yàn)雖可動(dòng)態(tài)監(jiān)測血糖變化，但操作繁瑣，對(duì)于已確診患者在治療、愈后的觀察中使用危險(xiǎn)性較大，且易誘發(fā)高血糖危象；糖化血紅蛋白(HbAlC)雖然是一種早期診斷指標(biāo)，但屬于半定量分析，不能滿足臨床要求。1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)與現(xiàn)有的糖尿病指標(biāo)均呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)，血液中1，5-脫水葡萄糖醇的減少程度與糖尿病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。1，5-脫水葡萄糖醇(1， 5-AG)與其他指標(biāo)最顯著的區(qū)別是反映糖尿病病情變化的周期不同，血糖(GLU)反映病人當(dāng)時(shí)血糖狀況，果糖胺(FMN)反應(yīng)病人半個(gè)月內(nèi)血糖的平均狀況，糖化血紅蛋白(HbAlc)反映病人最近3個(gè)月左右的血糖平均水平，而1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)可以反映近幾天至1周的平均血糖水平。目前國內(nèi)外主要采用全酶法測定1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)，主要有氧化酶法與脫氫酶法兩種方法。這兩種方法都需要一系列的酶參與消除葡萄糖干擾與生成有色物質(zhì)進(jìn)行檢測。目前主要缺點(diǎn)是原料來源困難，黃遞酶(DI)、1，5-脫水葡萄糖醇脫氫酶(1， 5-AG-HK)與吡喃糖氧化酶(PROD)(氧化酶方法)價(jià)格均較高，且來源困難。目前市場上大多為干粉試劑(現(xiàn)有試劑穩(wěn)定性較差)，檢測容易受到內(nèi)源性物質(zhì)如葡萄糖、膽紅素、抗壞血酸、血脂等干擾，特異性有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的測定血液中1，5_脫水葡萄糖醇的方法，在該方法中，通過吡喃糖氧化酶(PROD)催化1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)生成1，5-脫水果糖和H2A ；4-氨基安替比啉0^六 )、3-羥基-2，4，6-三羥基苯甲酸(HTIB)和H2O2在辣根過氧化物酶(HRP) 的催化作用下生成醌類化合物(紅色)；利用比色分析原理可以得出血液中1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)水平。因此，本發(fā)明一方面涉及一種測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的方法，所述方法通過下述反應(yīng)測定血液1，5_脫水葡萄糖醇含量
權(quán)利要求
1. 一種測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的方法，所述方法通過下述反應(yīng)測定血液1， 5-脫水葡萄糖醇含量葡萄糖氧化酶β-D-葡萄糖+O'2葡萄糖酸內(nèi)酯+過氧化氫過氧化氫酶- O7 + 2HoO吡喃糖氧化酶-^1,5-脫水果糖+過氧化氫過氧化氫1,5-脫水葡萄糖醇+O2-辣根過氧化物酶 HTIB+4-AAP +過氧化氫- 苯醌亞胺+H2O,其中，利用葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶清除血液中的葡萄糖，隨后利用吡喃糖氧化酶催化1，5-脫水葡萄糖醇產(chǎn)生過氧化氫，色原與過氧化氫在辣根過氧化物酶的催化作用下產(chǎn)生有色底物，進(jìn)行比色分析由此確定血液1，5_脫水葡萄糖醇的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的方法，進(jìn)一步包括下述步驟加入亞鐵氰化鉀與表面活性劑的組合消除樣本中高膽紅素對(duì)樣本測值的影響。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的方法，進(jìn)一步包括下述步驟加入表面活性劑消除樣本中甘油三酯對(duì)樣本測值的影響和/或加入抗壞血酸氧化酶消除樣本中高抗壞血酸對(duì)樣本的影響。
4.一種測定血液1，5_脫水葡萄糖醇含量的試劑盒，包括試劑I和試劑II兩部分，其中試劑I含有葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸氧化酶、表面活性劑、亞鐵氰化鉀、緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑；試劑Π含有吡喃糖氧化酶、4-氨基安替比啉、辣根過氧化物酶、3-羥基-2，4，6-三羥基苯甲酸、緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的試劑盒，每升試劑I溶液中各組分的含量為1-50KU 1-20KU 1-20KU 0. 01-10% 0.l-10000umol l-500mmol 0. 01-10% 0. 01-10% ； 每升試劑II中各組分的含量為 吡喃糖氧化酶1-500KU4-氨基安替比啉 0. l-5mmol 辣根過氧化物酶 1-20KU 3-羥基-2，4，6-三羥基苯甲酸 0. I-IOmmol葡萄糖氧化酶過氧化氫酶抗壞血酸氧化酶表面活性劑亞鐵氰化鉀磷酸鹽緩沖液穩(wěn)定劑防腐劑磷酸鹽緩沖液l-500mmol穩(wěn)定劑0.01-10%防腐劑0.01-10%。
6 根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的試劑盒，每升試劑I溶液中各組分的含量為葡萄糖氧化酶15KU過氧化氫酶2KU抗壞血酸氧化酶 IOKU 表面活性劑0.05%亞鐵氰化鉀IOOumol磷酸鹽緩沖液IOOmmol穩(wěn)定劑0.05%防腐劑0.05%;每升試劑Π中各組分的含量為 吡喃糖氧化酶200KU4-氨基安替比啉 5mmol 辣根過氧化物酶 IOKU 3-羥基-2，4，6-三羥基苯甲酸 5mmol 磷酸鹽緩沖液 400mmol 穩(wěn)定劑0.05%防腐劑0.05%。
7 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的方法，或根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的測定血液1，5_脫水葡萄糖醇含量的試劑盒，其中所述的表面活性劑選自曲拉通X-100、B66、吐溫20、十二烷基苯磺酸鈉、甜菜堿、十六烷基三甲基溴化銨中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的測定血液1，5_脫水葡萄糖醇含量的試劑盒，其中所述的穩(wěn)定劑與防腐劑選自疊氮鈉、疊氮鋰、PC300、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸二鈉中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明涉及血液1，5-脫水葡萄糖醇的檢測方法及試劑盒。本發(fā)明提供一種新的血液1，5-脫水葡萄糖醇含量的方法，在本發(fā)明的方法中，通過吡喃糖氧化酶催化1，5-脫水葡萄糖醇生成1，5-脫水果糖和H2O2；4-氨基安替比啉(4-AAP)、3-羥基-2，4，6-三羥基苯甲酸(HTIB)和H2O2在辣根過氧化物酶的催化作用下生成醌類化合物；利用比色分析原理確定血液中1，5-脫水葡萄糖醇水平。本發(fā)明還提供基于上述方法的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒操作簡單方便、安全，穩(wěn)定時(shí)間長，抗干擾能力強(qiáng)，特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以快速消除血樣中多葡萄糖的干擾，能夠?qū)μ悄虿〉脑\斷治療提供可靠的依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK102175670SQ201010615008
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者劉希, 劉瑤, 杜愛銘, 蔡華雅 申請(qǐng)人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司