專利名稱：1,5-脫水山梨醇的檢測方法和相關(guān)診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床生化診斷領(lǐng)域，涉及一種酶法檢測1，5_脫水山梨醇的檢測方法和相關(guān)診斷試劑盒。進一步而言，本發(fā)明涉及循環(huán)酶法檢測血液中1，5_脫水山梨醇的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
1，5-脫水山梨醇(1，5-anhydroglucitol, 1，5-AG)，又叫做 2_ 脫氧葡萄糖、1， 5-脫水葡萄糖醇，是一種具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的六碳單糖。它是吡喃葡萄糖的還原型(C-1位置上缺少一個羥基)，在吡喃位形成Cl椅形氧環(huán)，分子式為C6H12O5 (分子量164. 2，CAS號為 154-58-5)，結(jié)構(gòu)與葡萄糖的結(jié)構(gòu)十分相似，兩者主要區(qū)別在于葡萄糖C-I位置上的羥基被氫所取代，而這種取代恰恰是1，5-脫水山梨醇化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。二十世紀(jì)九十年代初日本就把1，5_脫水山梨醇作為糖尿病診斷和療效檢測的常規(guī)指標(biāo)，并為此做了大量的基礎(chǔ)與臨床研究工作。血清中1，5_脫水山梨醇濃度恒定在 12-40mg/L，其代謝穩(wěn)定。當(dāng)患有糖尿病時血清1，5_脫水山梨醇濃度會顯著降低，其機制是當(dāng)患有糖尿病時大量葡萄糖由尿中排出競爭性的抑制了 1，5_脫水山梨醇經(jīng)腎小管的重吸收，使1，5-脫水山梨醇大量經(jīng)尿排出，導(dǎo)致血中1，5-脫水山梨醇濃度降低，其水平可反映近一周的血糖和尿糖情況。目前大多數(shù)國家評價血糖水平需要監(jiān)測血漿葡萄糖、糖化血紅蛋白或果糖胺。糖化血紅蛋白水平反映蛋白質(zhì)半衰期內(nèi)的平均葡萄糖濃度，即過去2-3 個月的血漿葡萄糖濃度變化，而果糖胺反應(yīng)過去10-14天的血糖水平變化。1，5-脫水山梨醇可以十分敏感的反應(yīng)葡萄糖的排泌變化，對糖尿病的診斷與治療是個很好的指標(biāo)。當(dāng)葡萄糖濃度水平升高時，即使是暫時性的也會造成循環(huán)中1，5_脫水山梨醇濃度下降，例如妊娠造成的1，5_脫水山梨醇濃度的改變可能反應(yīng)糖代謝的的適度改變，而其他糖尿病的指標(biāo)都無法反應(yīng)出來。1，5_脫水山梨醇的特征在對血糖水平接近正常至血糖濃度中等升高程度的病人的評價很有價值，它對病人自我檢測和持續(xù)監(jiān)測血糖水平變化是個有效的補充，對特定的病人進行每天一次或每月一次的監(jiān)測，如果1，5-脫水山梨醇水平穩(wěn)定或持續(xù)升高，將反應(yīng)整體血糖水平穩(wěn)定或有所改善，如果1，5_脫水山梨醇水平下降，就要持續(xù)監(jiān)測血糖水平變化，改變生活方式，還要進行治療來糾正血糖隨后即將發(fā)生的惡化。1，5_脫水山梨醇不同于其他指標(biāo)，在臨床實踐中有潛在的應(yīng)用領(lǐng)域。1，5_脫水山梨醇反映餐后高血糖峰值，在非糖尿病人群中血漿1，5-脫水山梨醇水平可能作為一個篩查指標(biāo)，以監(jiān)測餐后高血糖相關(guān)的心血管危險的發(fā)生。1，5_脫水山梨醇與負載后血漿葡萄糖濃度明顯呈負相關(guān)。在慢性腎功能衰竭的病人中即使血糖正常，血清1，5_脫水山梨醇也會明顯下降，1， 5-脫水山梨醇的下降是由于1，5_脫水山梨醇重吸收減少造成的，這不依賴于葡萄糖的排泌，血漿或尿1，5_脫水山梨醇濃度可很好的反映腎小管重吸收功能，因為1，5_脫水山梨醇重吸收系統(tǒng)比葡萄糖重吸收系統(tǒng)更容易受損。糖耐量一樣的人血漿1，5_脫水山梨醇的濃度可能呈現(xiàn)各種變化，這依賴于他們的腎糖閾，這種內(nèi)在的特性可能限制1，5_脫水山梨醇的應(yīng)用。
對1，5_脫水山梨醇水平的檢測方法有很多，各有其優(yōu)缺點。其中高效液相、酶色譜法操作比較復(fù)雜，不適合大批量分析。目前適合自動分析儀的方法主要有ADP-HK-NADPH 方法和GK-PROD方法。1，5-脫水山梨醇在ADP依賴性己糖激酶(ADP-HK)的作用下生成AG-6磷酸 (AG-6-P)。AG-6-P再和NADP進行反應(yīng)，生成NADPH。NADPH具有還原性，和顯色劑作用生成顯色物質(zhì)。對顯色物質(zhì)進行比色，即可測定1，5-脫水山梨醇的濃度，該方法分為三個步驟
權(quán)利要求
1. 一種檢測血液中1，5-脫水山梨醇的方法，該方法包括下述步驟a.樣本與腺苷二磷酸在腺苷二磷酸依賴的己糖激酶催化下生成脫水葡萄糖-6-磷酸和腺苷一磷酸
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的方法，還包括步驟a前去除葡萄糖干擾的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的方法，所述的去除葡萄糖干擾的步驟選自a.葡萄糖與在己糖激酶催化作用下生成葡萄糖-6-磷酸和一磷酸腺苷，葡萄糖-6-磷酸與磷酸己糖異構(gòu)酶催化作用下生成果糖-6磷酸，果糖-6磷酸F-6-P與三磷酸腺苷在 6-磷酸果糖異構(gòu)酶催化作用下生成果糖-1，6- 二磷酸；b.葡萄糖與在葡萄糖激酶催化作用下生成葡萄糖-6-磷酸和一磷酸腺苷，葡萄糖-6-磷酸與磷酸己糖異構(gòu)酶催化作用下生成果糖-6磷酸，果糖-6磷酸與三磷酸腺苷在 6-磷酸果糖異構(gòu)酶催化作用下生成果糖-1，6-二磷酸；或c.葡萄糖在氧氣和水的條件下與葡萄糖氧化酶的作用，生成葡萄糖醛酸和過氧化氫， 過氧化氫通過過氧化氫酶進行分解水和氧氣。
4.一種檢測血液中1，5-脫水山梨醇的試劑盒，該試劑盒包含腺苷二磷酸、腺苷二磷酸依賴的己糖激酶、硫代氧化性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶和還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中腺苷二磷酸的濃度范圍在l-50mmol/L，腺苷二磷酸依賴的己糖激酶的濃度范圍在0. 1-100KU/L，硫代氧化性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的濃度范圍在0. 1-2. Og/L，1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶濃度范圍在0. 1-100KU/L，還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸濃度范圍在0. l-10g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，進一步包括去除葡萄糖干擾組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，所述的去除葡萄糖干擾組合物選自a.己糖激酶、磷酸己糖異構(gòu)酶和6-磷酸果糖異構(gòu)酶的組合物；b.葡萄糖激酶、磷酸己糖異構(gòu)酶和6-磷酸果糖異構(gòu)酶的組合物；或c.葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，還包含緩沖液、酶保護劑、酶促進劑、螯合劑、表面活性劑和防腐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其包含 緩沖液20-500mmol/L腺苷二磷酸l-50mmol/l腺苷二磷酸依賴型己糖激酶 0.1-100KU/1硫代氧化性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0. 1-2. Og/11，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶0. 1-100KU/L還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.l-10g/l酶保護劑 1% -50%質(zhì)量體積比酶促進劑 1% -50%螯合劑 0. 1-10% 表面活性劑 0. 1-10% 防腐劑 0. 05% -0. 2%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、三乙醇氨緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、硼酸-硼酸鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液或者磷酸鹽、2-嗎啉乙磺酸、N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙基磺酸、 3-(N-嗎啉)丙磺酸、三羥甲基甲胺基乙磺酸、N' -二(2-羥基乙基)甘氨酸中的一種或幾種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中所述緩沖液的濃度在 20-500mmol/L。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中酶保護劑包括大分子物質(zhì)、聚乙二醇高分子化合物、蛋白類物質(zhì)、表面活性劑、醇類、磷化氫和胱氨酸，酶保護劑的優(yōu)選濃度為1 % -50 %，最優(yōu)選濃度1 % -20 %。
13.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中酶促進劑包括無機鹽，無機鹽包括醋酸鎂，氯化錳，氯化鉀，氯化鈉，氯化銨，酶促進劑的濃度優(yōu)選為 1% _50%，最優(yōu)選濃度為-10%。
14.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中螯合劑包括EDTA、EGTA, HPDH，螯合劑的優(yōu)選濃度為0. 1 % -10%，最優(yōu)選濃度為0. 。
15.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中表面活性劑為聚氧乙烯型表面活性劑，包括Triton X系列，Tween系列和十二烷基苯磺酸鈉，表面活性劑的優(yōu)選濃度為0. 1% -10%，最優(yōu)選濃度為0. 5% -2%。
16.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測血液中1，5_脫水山梨醇的試劑盒，其中防腐劑包括生物防腐劑PC系列、迭氮鈉、抗生素系列、苯甲酸、MIT、BND, CAA,防腐劑的優(yōu)選濃度為 0. 05% -0. 2%,最優(yōu)濃度為 0. 05-0. 1 %。
全文摘要
本發(fā)明涉及1，5-脫水山梨醇的檢測方法和相關(guān)診斷試劑盒。本發(fā)明涉及通過使樣本與腺苷二磷酸在腺苷二磷酸依賴的己糖激酶催化下生成脫水葡萄糖-6-磷酸和腺苷一磷酸，然后脫水葡萄糖-6-磷酸與硫代氧化性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在1，5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶催化下生成硫代還原性輔酶和化合物C6H11O8P，同時生成的C6H11O8P在AG-6-PDH及還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下再次生成AG-6-P和氧化性輔酶，由此循環(huán)放大使檢測1，5-脫水山梨醇的靈敏度提高。本發(fā)明還提供基于上述方法的1，5-脫水山梨醇的檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒使用方便、簡潔，可以在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上快速檢測，不需要特殊或者額外的儀器，其成本也低廉。
文檔編號C12Q1/48GK102154442SQ20101061501
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者劉希, 劉瑤, 杜愛銘, 蔡華雅 申請人:北京九強生物技術(shù)股份有限公司