專利名稱：疾病相關(guān)基因的多態(tài)性檢測用探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測疾病相關(guān)基因的多態(tài)性的探針及其用途。
背景技術(shù)：
RAS蛋白質(zhì)和RAF蛋白質(zhì)是形成通過RAS/RAF/MAH(通路的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。上述RAS/RAF/MAPK通路，RAF蛋白質(zhì)被活性型RAS蛋白質(zhì)活化，MEK蛋白質(zhì)被活性型RAF蛋白質(zhì)活化，進(jìn)而MAHi蛋白質(zhì)被活性型MEK蛋白質(zhì)活化。由此調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化等。作為上述RAS蛋白質(zhì)的一種的K-Ras蛋白質(zhì)，是具有GTP酶活性的⑶P/GTP結(jié)合蛋白質(zhì)，在人體中，由位于第12染色體上的K-ras基因編碼。已知上述K_ras基因在密碼子12、密碼子13等中突變(非專利文獻(xiàn)1 3等)。密碼子12的突變有，在序列編號1的 K-ras基因的部分序列中，序列編號220的堿基(η)從鳥嘌呤(g)取代為腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)，序列編號221的堿基(η)從鳥嘌呤(g)取代為腺嘌呤(a)、胞嘧啶 (c)或胸腺嘧啶(t)。密碼子13的突變有，在序列編號1的K-ras基因的堿基序列中，序列編號223的堿基(k)從鳥嘌呤(g)取代為胸腺嘧啶(t)，序列編號2M的堿基(r)從鳥嘌呤 (g)取代為腺嘌呤(a)。通過上述密碼子12的突變，K-ras蛋白質(zhì)的第12位的甘氨酸(G) 突變?yōu)榻z氨酸(S)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、天冬酰胺(N)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)。通過上述密碼子13的突變，K-ras蛋白質(zhì)的第13位的甘氨酸(G)突變?yōu)樘於彼?D)或半胱氨酸(C)。有報(bào)告K-ras基因的密碼子12或密碼子13的突變與例如大腸癌、胰腺癌等癌癥、CFC(cardio-facio-cutaneous)等先天性疾病相關(guān)，與對于抗EGFR抗體藥物的耐藥性相關(guān)(非專利文獻(xiàn)1 3等)。因此，在K-ras基因中，這些突變的有無，即多態(tài)性的檢測，例如，對于上述疾病的診斷、更有效的疾病治療方法的選擇等至關(guān)重要。此外，作為上述RAF蛋白質(zhì)的一種的BRAF蛋白質(zhì)是具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，在人體中，由位于第7染色體上的BRAF基因編碼。有報(bào)告上述BRAF基因的突變也與上述K-ras基因相同，與上述癌癥和先天性疾病相關(guān)，與耐藥性相關(guān)(非專利文獻(xiàn)1 3等)。上述BRAF基因的突變已知在序列編號2的BRAF基因的部分序列中堿基序號2 的堿基(w)從胸腺嘧啶(t)取代為腺嘌呤(a)。當(dāng)上述堿基為野生型(t)時(shí)，BRAF蛋白質(zhì)的第600位的氨基酸為纈氨酸(V)，當(dāng)上述堿基為突變型(a)時(shí)，BRAF蛋白質(zhì)的第600位的氨基酸為谷氨酸(E)。據(jù)認(rèn)為通過該氨基酸殘基的突變，就可以獲得腫瘤原性。因此，除了上述K-ras基因以外，通過檢測上述BRAF基因突變的有無，即多態(tài)性，就能夠進(jìn)一步提高例如上述疾病的診斷以及選擇更有效的疾病治療方法等的精度。另一方面，檢測基因的多態(tài)性的方法報(bào)告了各種方法，例如，可以列舉 PCR(Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈反應(yīng))-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段長度多態(tài)性)法等。上述PCR-RFLP法是對于試樣的靶DNA，通過PCR擴(kuò)增檢測目的區(qū)域，以限制性內(nèi)切酶處理該擴(kuò)增產(chǎn)物，通過DNA雜交(Southern Hybridization)印跡由多態(tài)性造成的內(nèi)切酶片段長度的變化的方法。如果基因中存在目的突變，則限制性內(nèi)切酶的識別部位消失，所以通過切斷的有無，即，限制性片段長度的變化，就能夠檢測突變的有無。然而，上述PCR-RFLP法，例如，在PCR后，需要用各種限制性內(nèi)切酶處理所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析，很費(fèi)時(shí)間。另外，所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶處理，需要暫時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物取出再進(jìn)行。因此，有第一次反應(yīng)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物飛濺而混入到第二次的其他反應(yīng)中的危險(xiǎn)。由于這樣的問題，所以難以自動化進(jìn)行多態(tài)性的檢測。由于這樣的問題，近年來，作為多態(tài)性的檢測方法，Tm (Melting Temperature)分析備受關(guān)注。該方法如下首先使用與含有檢測目的多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)的探針，形成被檢測核酸與上述探針的雜交體(雙鏈核酸)；然后，對所得到的雜交體實(shí)施加熱處理，通過吸光度等的信號測定檢測出隨著溫度上升上述雜交體向單鏈核酸的解離(熔解)。通過基于該檢測結(jié)果決定Tm值來判斷多態(tài)性。雜交體中兩個(gè)單鏈核酸的互補(bǔ)性越高Tm值越高，互補(bǔ)性越低Tm值越低。這里，當(dāng)檢測對象部位的多態(tài)性為X或Y時(shí)，通過含有目的多態(tài)性(例如，Y)的核酸和與其100%互補(bǔ)的探針雜交，預(yù)先求出Tm值(評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值)；接著，測定上述被檢測核酸和上述探針的Tm值(測定值)；這樣，該測定值如果與上述評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值相同， 則上述被檢測核酸和上述探針為完全匹配(perfect match)，S卩，能夠判斷上述被檢測核酸的檢測對象部位為目的多態(tài)性(Y)。另一方面，上述測定值比上述評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值低時(shí)，上述被檢測核酸和上述探針不匹配(mismatch)。即，能夠判斷上述被檢測核酸的檢測對象部位為另一方的多態(tài)性(X)。根據(jù)這樣的方法，例如，能夠僅通過對添加有上述探針的PCR反應(yīng)液實(shí)施溫度處理并進(jìn)行信號測定來檢測多態(tài)性。因此，檢測裝置的自動化也成為可能。然而，這種利用Tm分析的檢測方法，例如，必須通過Tm值來判斷一個(gè)堿基的不同。 另外，在基因具有多種多態(tài)性的情況下，即使分析一個(gè)樣品也要伴隨大量的工作量。因此， 分析大量的樣品時(shí)也存在不能實(shí)用的問題。因此，特別是需要即使在野生型的多態(tài)性和大量突變型的多態(tài)性混合存在的情況等也可以準(zhǔn)確地檢測突變的有無。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Cancer Epidemiology Biomarkers，2000 年 11 月，ρ· 1193-1197非專利文獻(xiàn)2 J Mol Diagn.，2006 年 11 月，Vol. 8，No. 5，p. 540-543非專利文獻(xiàn)3 :J Natl Cancer Inst.，2009 年 10 月 7 日，Vol. 101，No. 19， ρ· 1308-1324 (Epub :2009 年 9 月 8 日)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題出于這樣的原因，K-ras基因的多態(tài)性的檢測在例如上述疾病的診斷和治療方法的選擇中非常重要。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種對于疾病相關(guān)基因κ-ras基因可以簡便且以優(yōu)異的可靠性判別多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針及其用途。用于解決課題的方法為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針是用于檢測疾病相關(guān)基因K-ras 基因的多態(tài)性的探針，其特征在于，包含下述(PI)、(P2)、(P3)、(P1，)、(P2，)和(P3，)中的至少任意一個(gè)寡核苷酸。(Pl)堿基長度為11 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 230的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(Pl')由與上述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P2)堿基長度為15 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 234的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序列234的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P2’ )由與上述(P2)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P3)堿基長度為17 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 236的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序列236的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P3’ )由與上述(P3)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用試劑是用于檢測疾病相關(guān)基因的多態(tài)性的試劑，其特征在于，包含本發(fā)明的K-ras基因的多態(tài)性檢測用探針。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法是檢測疾病相關(guān)基因的多態(tài)性的方法，其特征在于，包括使用本發(fā)明的κ-ras基因的多態(tài)性檢測用探針，檢測疾病相關(guān)基因κ-ras基因的多態(tài)性的工序。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，例如，能夠通過Tm分析簡便且以優(yōu)異的可靠性判別κ-ras基因的多態(tài)性。具體而言，例如，即使在試樣中目的多態(tài)性為野生型κ-ras基因和突變性的κ-ras基因共存的情況下，通過進(jìn)行使用了本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的Tm分析，也能夠簡便且以優(yōu)異的可靠性檢測出多態(tài)性的種類或突變的有無。因此，本發(fā)明對于含有野生型K-ras基因和突變性的K-ras基因這兩者的試樣特別有用。這樣，根據(jù)本發(fā)明，就能夠簡便且以優(yōu)異的可靠性判別K-ras基因的多態(tài)性，所以，例如就能夠?qū)z測結(jié)果反映到上述那樣的疾病的診斷和治療方法的選擇等上。因此，可以說本發(fā)明在醫(yī)療領(lǐng)取中極為有用。


圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施例1中含有野生型和突變型寡核苷酸的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖2是表示本發(fā)明的實(shí)施例2中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖3是表示本發(fā)明的實(shí)施例3中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖4是表示本發(fā)明的實(shí)施例4中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖5是表示本發(fā)明的實(shí)施例4中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。
圖6是表示本發(fā)明的實(shí)施例4中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖7是表示本發(fā)明的實(shí)施例4中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖8是表示本發(fā)明的實(shí)施例5中含有來自臨床檢測體的DNA提取液的反應(yīng)液的Tm 分析結(jié)果的圖。圖9是表示本發(fā)明的實(shí)施例6中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖10是表示本發(fā)明的實(shí)施例6中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖11是表示本發(fā)明的實(shí)施例6中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖12是表示本發(fā)明的實(shí)施例6中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖13是表示本發(fā)明的實(shí)施例7中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖14是表示本發(fā)明的實(shí)施例7中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。圖15是表示本發(fā)明的實(shí)施例7中含有野生型和突變型質(zhì)粒的反應(yīng)液的Tm分析結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，K-ras基因中的檢測目的多態(tài)性為密碼子12和密碼子13中的多態(tài)性。具體而言，例如，在序列編號1的κ-ras基因的部分序列中，為堿基序號220-222 (rmt) 的密碼子12的多態(tài)性，和堿基序號223-225 (krc)的密碼子13的多態(tài)性。η為g、c、t或a， k為g或t，r為g或a。密碼子12的野生型的多態(tài)性為ggt，密碼子12的突變型的多態(tài)性可以列舉例如agt、cgt、tgt、gat、get、gtt、aat、ttt或ctt9種。密碼子13的野生型的多態(tài)性為ggc，密碼子13的突變型的多態(tài)性可以列舉例如gac或tgc。在K-ras基因中，如果密碼子12的多態(tài)性和密碼子13的多態(tài)性的至少一方為突變型，則顯示對例如西妥昔單抗等抗EGFR抗體藥物的耐藥性，如果為野生型，則能夠判斷不顯示耐藥性。以下，作為K-ras 基因的正義鏈中的上述堿基序號220-225的密碼子12的多態(tài)性和密碼子13的多態(tài)性，列舉了野生型(1)和突變型0 13)。在下述序列中，下劃線部位為突變型的堿基。
11野生型 1 (WT)ggtggc
突變型 2 (C12-AGT)agtggc
3(cl2-CGT)cgtggc
4(C12-TGT)tgtggc
5(C12-GAT)gatggc
6 (C12-GCT)gctggc
7(C12-GTT)gttggc
8(cl3-TGC)ggttgc
9(cl3-GAC)ggtgac
10(c 12-AAT)aatggc
11(C12-TTT)tttggc
12(cl2-CTT)cttggc (C12-AGT cl3-GAC)agtgacK-ras基因的堿基序列，例如，在GenBank Accession No. NG_007524中，作為第 5001位 第50675位的區(qū)域登錄。序列編號1為K-ras基因的部分序列，相當(dāng)于在上述登錄號的堿基序列中從第10351位 第10850位的區(qū)域。上述密碼子12和密碼子13的序列相當(dāng)于上述登錄號的堿基序列中從第10570位 第10575位的區(qū)域。在本發(fā)明中，以下，密碼子12和密碼子13的任一個(gè)堿基為突變型的K-ras基因稱為“突變型K-ras基因”，密碼子12和密碼子13的堿基為野生型的K_ras基因稱為“野生型K-ras基因或正常型K-ras基因”。在本發(fā)明中，上述多態(tài)性產(chǎn)生的部位，S卩，序列編號1的堿基序列(正義鏈)中堿基序號220-225的堿基，或者其互補(bǔ)序列(反義鏈)中對應(yīng)于上述正義鏈的堿基序號 220-225的堿基稱為“檢測對象部位”。在序列編號1的序列(正義鏈)或其互補(bǔ)序列(反義鏈)中，含有上述檢測對象部位，上述多態(tài)性檢測用探針可以雜交的區(qū)域稱為“雜交區(qū)域或檢測對象序列”。在上述檢測對象序列中，與上述多態(tài)性檢測用探針完全匹配的檢測對象序列也稱為“完全匹配序列”，與上述多態(tài)性檢測用探針不匹配的檢測對象序列也稱為“不匹配序列”。在本發(fā)明中，完全匹配意指上述檢測對象部位的堿基與上述多態(tài)性檢測用探針中的對應(yīng)堿基互補(bǔ)，優(yōu)選上述檢測對象序列與上述多態(tài)性檢測用探針完全互補(bǔ)。在本發(fā)明中，不匹配意指上述檢測對象部位的堿基與上述多態(tài)性檢測用探針中的對應(yīng)堿基不互補(bǔ)， 優(yōu)選上述檢測對象序列與上述多態(tài)性檢測用探針除了上述檢測對象部位以外完全互補(bǔ)。在本發(fā)明中，擴(kuò)增K-ras基因，使所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針雜交時(shí)，κ-ras基因中的擴(kuò)增區(qū)域在下文中稱為“擴(kuò)增對象區(qū)域”。上述擴(kuò)增對象區(qū)域，例如，可以是κ-ras基因的正義鏈中的區(qū)域，也可以是與其對應(yīng)的反義鏈中的區(qū)域，還可以是這兩者。在本發(fā)明中，正義鏈和反義鏈也包含例如正義鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物、反義鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物的含義。在本發(fā)明中，堿基序列的末端意指堿基序列的5’側(cè)和3’側(cè)的最末端的堿基。5’末端區(qū)域?yàn)閺膲A基序列的5’末端開始數(shù)個(gè)堿基的區(qū)域，3’末端區(qū)域?yàn)閺膲A基序列的3’末端開始數(shù)個(gè)堿基的區(qū)域。上述數(shù)個(gè)堿基例如為從末端開始1個(gè)堿基 10個(gè)堿基、1 4個(gè)堿基、1 3個(gè)堿基、1 2個(gè)堿基。在本發(fā)明中，從堿基序列的末端開始第Z個(gè)堿基(Z為正整數(shù))，為將末端的堿基作為第一位的順序，例如，從末端開始第1位堿基意指末端的堿基，從末端開始第2位堿基意指末端相鄰的堿基。<多態(tài)性檢測用探針>本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，如上所述，是用于檢測疾病相關(guān)基因K-ras基因的多態(tài)性的探針，其特征在于，包含下述(PI)、(P2)、(P3)、(P1，)、(P2，)和(P3，)中的至少
任意一個(gè)寡核苷酸。(Pl)堿基長度為11 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 230的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(ΡΓ )由與上述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P2)堿基長度為15 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 234的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序列234的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P2’ )由與上述(P2)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P3)堿基長度為17 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 236的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序列236的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P3’ )由與上述(P3)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。下文中也將本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針稱為K-ras用探針。上述(Pl)和(ΡΓ ) 的寡核苷酸的堿基長度為11 50個(gè)堿基，優(yōu)選為13 30個(gè)堿基，更優(yōu)選為15 20個(gè)堿基。上述(P》和(P2’ )的寡核苷酸的堿基長度為15 50個(gè)堿基，優(yōu)選為15 30個(gè)堿基，更優(yōu)選為15 20個(gè)堿基。上述(P； )和(P3’)的寡核苷酸的堿基長度為17 50個(gè)堿基，優(yōu)選為17 30個(gè)堿基，更優(yōu)選為17 20個(gè)堿基。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，是用于檢測在序列編號1的K-ras基因的部分序列中，序列編號220-222 (rmt)的密碼子12的多態(tài)性和序列編號223-225 (krc)的密碼子13的多態(tài)性的探針。具體而言，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，例如，是用于檢測在序列編號1的堿基序列中，堿基序號220的堿基(η)的多態(tài)性(g/a、g/c、g/t)、堿基序號221的堿基(η) 的多態(tài)性(g/a、g/c、g/t)、堿基序號223的堿基(k)的多態(tài)性(g/t)或堿基序號224的堿基(r)的多態(tài)性(g/a)的探針。在序列編號1的堿基序列220-225的序列“rmtkrc”中，η 為鳥嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)，k為鳥嘌呤(g)或胸腺嘧啶(t)，r 為鳥嘌呤(g)或腺嘌呤(a)。上述序列“rmtkrc”可以列舉例如上述的多態(tài)性(野生型1和突變型2 13)的序列。上述(Pl)、(P2)和(P3)的寡核苷酸，例如與K_ras基因的正義鏈互補(bǔ)，并能夠通過與上述正義鏈的雜交確認(rèn)多態(tài)性。上述(Pl)、(P2)和(p;3)的寡核苷酸優(yōu)選包含與序列編號1中堿基序號220-225的堿基序歹Ij (5，-nntkrc-3，)互補(bǔ)的堿基序列(5，-gymann-3，)。 上述“rmtkrc”例如可以列舉上述野生型1和突變型2 13的序列。在與上述“nntkrc”互補(bǔ)的“gymarm”序列中，y為胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)，m為胞嘧啶(c)或腺嘌呤(a), η 為鳥嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)(以下，相同)。上述(Pl)、(P2)和(P3)的寡核苷酸，作為“gymarm”，例如優(yōu)選具有“gccacc”的序列。在具有該序列時(shí)，在K-ras基因中，與密碼子12和密碼子13的野生型的序列完全匹配。因此，例如根據(jù)與K-ras基因的密碼子12和密碼子13的序列是否完全匹配，就能夠檢測出K-ras基因的多態(tài)性。具體而言，例如，能夠檢測出K-ras基因的多態(tài)性是野生型還是突變型，對于突變型而言，能夠檢測出是單堿基突變還是雙堿基突變。在下文中，包含具有該序列的寡核苷酸的探針也稱為野生型探針。上述(Pl)、(P2)和(P3)的寡核苷酸，作為“gymarm”，例如也可以具有“gccact”、
"gccacg，，、"gccaca，，、"gccatc，，、"gccagc，，、"gccaac，，、"gcaacc，，、"gtcacc，，、"gccatt，，、
“gCCaaa”、“gCCaag”、“gtCaCt”的序列。在具有這些序列時(shí)，分別依次與K-ras基因中的密碼子12和13的突變型2 13的序列完全匹配。因此，根據(jù)與K-ras基因的密碼子12和密碼子13的突變型2 13的序列是否完全匹配，就能夠檢測出K-ras基因的多態(tài)性。在下文中，包含具有這些序列的寡核苷酸的探針也稱為突變型探針。上述(Pl)的寡核苷酸，在5’末端區(qū)域，優(yōu)選在從5’末端開始數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選在第1 3位，特別優(yōu)選在第1位(5’末端)或第2位的位置具有與上述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基。上述(P》的寡核苷酸，在5’末端區(qū)域，優(yōu)選在從5’末端開始數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選在第1 3位，特別優(yōu)選在第1位(5’末端)或第2位的位置具有與上述堿基序號234的堿基互補(bǔ)的堿基。上述(P； )的寡核苷酸，在5’末端區(qū)域，優(yōu)選在從5’末端開始數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選在第1 3位，特別優(yōu)選在第1位(5’末端) 或第2位的位置具有與上述堿基序號236的堿基互補(bǔ)的堿基。上述(Pl)的寡核苷酸，例如可以列舉序列編號3的寡核苷酸，上述(P》的寡核苷酸，例如可以列舉序列編號4、5或四的寡核苷酸，上述(P； )的寡核苷酸，例如可以列舉序列編號6的寡核苷酸。在序列編號3、4、5、6、四的堿基序列中，下劃線部分的gymarm為與序列編號1所示的K-ras基因的檢測對象部位rmtkrc互補(bǔ)的序列。其中，優(yōu)選含有序列編號6的寡核苷酸的探針。在上述(PI)、(P2)和(P3)的寡核苷酸中，上述gymarm如上所述可以為例如 “gccacc，，、“ gccact，，、“ gccacg，，、“ gccaca，，、“ gccatc，，、“ gccagc，，、“ gccaac，，、“ gcaacc，，、 “ gtcacc，，、“ gccatt，，、“ gccaaa，，、“ gccaag，，禾口 “ gtcact，，的至少任一種。上述序列編號3的寡核苷酸例如可以列舉序列編號7的寡核苷酸，上述序列編號 4的寡核苷酸例如可以列舉序列編號8的寡核苷酸，上述序列編號5的寡核苷酸例如可以列舉序列編號9的寡核苷酸，上述序列編號6的寡核苷酸例如可以列舉序列編號10的寡核
5'-cctacgymannagctccaactac-3' 5'-cttgcctacgymannagctccaactac-3' 5'-cttgcctacgymannagctccaactacca-3 5 '-cttgcctacgymann-3' 5 '-ctcttgcctacgymannagctccaact-3 ’
(序列編號3) (序列編號4) (序列編號5) (序列編號29) (序列編號6)苷酸。在各堿基序列中，下劃線部分的gccacc與野生型K-ras基因的正義鏈中的檢測對象 部位互補(bǔ)，能夠作為野生型探針使用。上述序列編號四的寡核苷酸例如可以列舉序列編號 30的寡核苷酸，下劃線部分的gtcacc與密碼子13的突變型9互補(bǔ)，能夠作為突變型探針使 用。另外，也可以使用具有上述序列編號10的3’末端區(qū)域添加序列(大寫字母的區(qū)域)的 序列編號31的寡核苷酸。其中，優(yōu)選含有序列編號10或序列編號31的寡核苷酸的探針。
5'-cctacgccaccagctccaactac-31(序列編號 7)
5'-cttgcctacgccaccagctccaactac-3'(序列編號 8)
5 '-cttgcctacgccaccagctccaactacca-3 ‘(序列 編號 9 )
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaact-3'(序列 編號 10)
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaactTGCTGGCTACGC-3' (序列編號 31) 5'-cttgcctacgtcacc-3'(序列編號 30)上述(P1，)、(P2，)和(P3，)的寡核苷酸，如上所述，分別與上述(Pl)、(P2)和 (P3)的寡核苷酸互補(bǔ)。上述(P1’) (P3’)的寡核苷酸例如也能夠如下表述。(Pl')堿基長度為11 50個(gè)堿基，由包含序列編號1中堿基序號220 230的 堿基序列構(gòu)成，且在3’末端區(qū)域具有上述堿基序號230的堿基的寡核苷酸(P2’ )堿基長度為15 50個(gè)堿基，由包含序列編號1中堿基序號220 234的 堿基序列構(gòu)成，且在3’末端區(qū)域具有上述堿基序號234的堿基的寡核苷酸(P3’ )堿基長度為17 50個(gè)堿基，由包含序列編號1中堿基序號220 236的 堿基序列構(gòu)成，且在3’末端區(qū)域具有上述堿基序號236的堿基的寡核苷酸上述(P1’)、(P2’)和(P3’)的寡核苷酸與K-ras基因的正義鏈相同，通過與上述 反義鏈雜交能夠確認(rèn)多態(tài)性。在上述(P1’)、(P2’)和(P3’)的寡核苷酸中，與上述反義鏈 的檢測對象部位的堿基序列(gymarm)互補(bǔ)的堿基序列用nntkrc表示。上述序列“rmtkrc” 如上所述。在上述序列為野生型吋，包含具有該序列的寡核苷酸的探針稱為野生型探針。在 上述序列為突變型吋，包含具有該序列的寡核苷酸的探針稱為突變型探針。上述(Pl’ )的寡核苷酸，在3’末端區(qū)域，優(yōu)選在從3’末端數(shù)第1 4位的位置， 更優(yōu)選第1 3位，特別優(yōu)選在第1位(3’末端)或第2位具有上述堿基序號230的堿基。 上述(P2’ )的寡核苷酸，在3’末端區(qū)域，優(yōu)選在從3’末端數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選 第1 3位，特別優(yōu)選在第1位(3’末端)或第2位具有上述堿基序號234的堿基。上述 (P3’ )的寡核苷酸，在3’末端區(qū)域，優(yōu)選在從3’末端數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選第1 3位，特別優(yōu)選在第1位(3’末端)或第2位具有上述堿基序號236的堿基。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，例如可以是包含上述寡核苷酸的探針，也可以由上 述寡核苷酸構(gòu)成的探針。在為前者的情況下，例如也可以還具有添加序列。上述(Pl) (P3)的寡核苷酸優(yōu)選例如在其3’末端具有上述添加序列，具有上述添加序列的寡核苷酸 可以列舉例如上述的序列編號31的寡核苷酸。上述(P1’) (P3’)的寡核苷酸例如優(yōu)選在其5’末端具有上述添加序列。上述(Pl) (P； )的添加序列例如優(yōu)選為與正義鏈不互補(bǔ)的序列，上述(ΡΓ ) (P3’ )的添加序列例如優(yōu)選與正義鏈不相同的序列，堿基長度例如優(yōu)選為1 30個(gè)堿基。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，也可以是例如上述(Pl) (P3)的寡核苷酸除了對應(yīng)于上述檢測對象部位的堿基部位和堿基序號230、234、236的堿基互補(bǔ)的堿基以外，缺失、取代或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成，且與上述檢測對象序列能夠雜交的寡核苷酸。另外，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針。也可以是例如上述(ΡΓ) (P3’)的寡核苷酸除了對應(yīng)于上述檢測對象部位的堿基部位和堿基序號230、234、236的堿基以外，缺失、 取代或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成，且與上述檢測對象序列能夠雜交的寡核苷酸。這些探針，例如可以使用任意一種，也可以并用2種以上。在并用2種以上的情況下，例如優(yōu)選并用野生型探針和突變型探針。由此，不僅可以檢測出是野生型還是突變型， 還可以進(jìn)行突變型的鑒定。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針優(yōu)選為具有標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針，例如，優(yōu)選上述寡核苷酸被上述標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化(修飾)。在上述寡核苷酸中，被上述標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化的部位沒有特別限制，例如，優(yōu)選為5’端區(qū)域或3’末端區(qū)域，更優(yōu)選為5’末端或3’末端。如下所述，在上述寡核苷酸中，被上述標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化的堿基例如優(yōu)選胞嘧啶(c)或鳥嘌呤(g)。 上述標(biāo)記物質(zhì)例如可以直接標(biāo)記化堿基，也可以間接地標(biāo)記化上述堿基。在后者的情況下， 例如，能夠通過標(biāo)記含有上述堿基的核苷酸殘基的任意部位來間接地標(biāo)記化上述堿基。上述的(Pl) (P； )的核苷酸，例如優(yōu)選5’末端的胞嘧啶(c)被上述標(biāo)記物質(zhì)所標(biāo)記化，上述(ΡΓ ) (P3’ )的核苷酸，例如優(yōu)選3’末端的鳥嘌呤(g)被上述標(biāo)記物質(zhì)所標(biāo)記化。上述(Pl)、(P2)和(P； )的寡核苷酸優(yōu)選在5’末端區(qū)域具有上述標(biāo)記物質(zhì)，具體而言，例如，優(yōu)選在從5’末端開始數(shù)第1 4位的堿基的位置上具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選在從5’末端開始數(shù)第1 3位的堿基，特別優(yōu)選從5’末端開始數(shù)第2位或5’末端的堿基的位置上具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(Pl)的寡核苷酸例如優(yōu)選與上述堿基序號227 233 的任一個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選與上述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(P》的寡核苷酸例如優(yōu)選與上述堿基序號231 237的任一個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選與上述堿基序號234的堿基互補(bǔ)的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(P； )的寡核苷酸例如優(yōu)選與上述堿基序號233 239的任一個(gè)堿基互補(bǔ)的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選與上述堿基序號236的堿基互補(bǔ)的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(PI’)、(P2’ )和(P3’ )的寡核苷酸優(yōu)選在3’末端區(qū)域具有上述標(biāo)記物質(zhì)， 具體而言，例如，優(yōu)選在從3’末端開始數(shù)第1 4位的堿基的位置上具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選在從3’末端開始數(shù)第1 3位的堿基，特別優(yōu)選從3’末端開始數(shù)第2位或3’末端的堿基的位置上具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(ΡΓ)的寡核苷酸例如優(yōu)選上述堿基序號227 233的任一個(gè)堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選上述堿基序號230的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)。 上述(P2’ )的寡核苷酸例如優(yōu)選上述堿基序號231 237的任一個(gè)堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選上述堿基序號234的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(P3’ )的寡核苷酸例如優(yōu)選上述堿基序號233 239的任一個(gè)堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選上述堿基序號236的堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述標(biāo)記物質(zhì)沒有特別限制，例如，優(yōu)選上述標(biāo)記探針單獨(dú)或者通過形成雜交體而發(fā)出信號的物質(zhì)。上述信號的種類沒有特別限制，例如，可以列舉熒光、顯色等。當(dāng)上述信號為熒光時(shí)，信號值例如可以列舉熒光強(qiáng)度。當(dāng)上述信號為顯色時(shí)，上述信號值例如可以列舉反射率、吸光度、透射率等。上述信號例如可以是由上述標(biāo)記物質(zhì)直接發(fā)光，也可以是間接的發(fā)光。上述標(biāo)記物質(zhì)沒有特別限制，例如，可以列舉熒光基團(tuán)等熒光物質(zhì)等。上述熒光物質(zhì)，可以列舉例如熒光素、磷光體、羅丹明、聚次甲基色素衍生物等，市售的熒光物質(zhì)可以列舉例如Pacific Blue(注冊商標(biāo)，Molecular Probe公司制造)、BODIPY FL(注冊商標(biāo)， Molecular Probe 公司制造)、FluorePrime (商品名，Amersham Pharmacia 公司制造)、 Fluoredite (商品名，Millipore公司制造)、FAM(注冊商標(biāo)，ABI公司制造)、Cy3和Cy5 (商品名，Amersham Pharmacia公司制造)、TAMRA(注冊商標(biāo)，Molecular Probe公司制造)等。 上述熒光物質(zhì)的檢測條件沒有特別限制，例如能夠根據(jù)使用的熒光物質(zhì)的種類適當(dāng)決定。 例如，Pacific Blue能夠在檢測波長450 480nm檢測，TAMRA能夠在檢測波長585 700nm 檢測，BODIPY FL能夠在檢測波長515 555nm檢測。若使用這樣的探針，例如通過作為信號檢測熒光，作為信號值測定熒光強(qiáng)度，由熒光強(qiáng)度的變化就能夠容易地確認(rèn)雜交和解離。上述標(biāo)記探針優(yōu)選例如單獨(dú)顯示信號，且通過形成雜交體而不顯示信號的標(biāo)記探針，或者單獨(dú)不顯示信號，且通過形成雜交體而顯示信號的標(biāo)記探針。上述標(biāo)記物質(zhì)為熒光物質(zhì)時(shí)，上述標(biāo)記探針優(yōu)選為例如被上述標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記化而單獨(dú)顯示熒光，且通過雜交體的形成而熒光減少(例如，淬滅)的探針。這樣的現(xiàn)象一般稱為熒光淬滅現(xiàn)象(Quenching phenomenon) 0利用該現(xiàn)象的探針，一般稱為熒光淬滅探針。其中，上述熒光淬滅探針，例如優(yōu)選寡核苷酸的3’末端或5’末端被上述熒光物質(zhì)標(biāo)記化，被標(biāo)記化的上述末端的堿基優(yōu)選為胞嘧啶(c)或鳥嘌呤(g)。上述末端的堿基為胞嘧啶(c)時(shí)，上述熒光淬滅探針優(yōu)選例如以如下方式設(shè)計(jì)上述熒光淬滅探針的堿基序列，即，與被檢測核酸形成雜交體時(shí)，上述被檢測核酸中，與被標(biāo)記化的末端的胞嘧啶(c)配對的堿基或距離形成上述堿基對的堿基 1 3個(gè)堿基的堿基為鳥嘌呤(g)。距離形成上述對的堿基一個(gè)堿基的堿基意指形成上述堿基對的堿基相鄰的堿基。這樣的探針一般稱為鳥嘌呤淬滅探針，作為所謂的QProbe (注冊商標(biāo))而廣為人知。這樣的鳥嘌呤淬滅探針若與上述被檢測核酸雜交，則例如隨著以上述熒光物質(zhì)標(biāo)記化的末端的胞嘧啶(c)接近上述被檢測核酸中的鳥嘌呤(g)，上述熒光物質(zhì)的熒光減弱。即，顯示出熒光強(qiáng)度減少的現(xiàn)象。若使用這樣的探針，就能夠通過熒光強(qiáng)度的變動而容易地確認(rèn)雜交和解離。同樣，當(dāng)上述末端的堿基為鳥嘌呤(g)時(shí)，上述熒光淬滅探針例如優(yōu)選以如下的方式設(shè)計(jì)上述熒光淬滅探針的堿基序列，即，在與上述被檢測核酸形成雜交體時(shí)，上述被檢測核酸中，與被標(biāo)記化的末端的鳥嘌呤(g)成對的堿基或距離形成上述堿基對的堿基1 3個(gè)堿基的堿基為胞嘧啶(c)。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，例如可以在3’末端添加磷酸基團(tuán)。如下所述，被檢測核酸例如能夠通過PCR等的核酸擴(kuò)增法制備，此時(shí)，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針可以在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中共存。在這種情況下，如果在上述多態(tài)性檢測用探針的3’末端添加磷酸基團(tuán)，則能夠充分防止上述多態(tài)性檢測用探針本身通過上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)而延伸。通過在3’末端上添加上述那樣的標(biāo)記物質(zhì)也能夠獲得同樣的效果。
在使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的多態(tài)性檢測中，檢測方法沒有限制，只要是利用上述檢測對象序列和探針的雜交的方法即可。作為上述多肽性的檢測方法，下面，說明本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法。<多態(tài)性檢測方法>本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法，如上所述，是一種疾病相關(guān)基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括使用本發(fā)明的κ-ras基因的多態(tài)性檢測用探針，檢測κ-ras基因的多態(tài)性的工序。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法，優(yōu)選包括例如下述(A)工序和(B)工序。(A)使反應(yīng)體系的溫度變化，該反應(yīng)體系包含檢測上述多態(tài)性的被檢測核酸和本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，并測定顯示上述被檢測核酸和上述多態(tài)性檢測用探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值的工序(B)根據(jù)伴隨上述溫度變化的上述信號值的變動，檢測上述被檢測核酸中上述多態(tài)性的工序本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法的特征在于使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，其他構(gòu)成或條件等并不受以下的記載所限制。本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針優(yōu)選如上所述的標(biāo)記探針。在本發(fā)明中，上述反應(yīng)體系例如為反應(yīng)液。在本發(fā)明中，上述被檢測核酸可以是單鏈核酸，也可以是雙鏈核酸。上述被檢測核酸為上述雙鏈核酸時(shí)，例如，如下所述，優(yōu)選包括在上述(A)工序中，加熱上述反應(yīng)體系使雙鏈的上述被檢測核酸解離的工序。通過將上述雙鏈核酸解離成單鏈核酸，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和上述單鏈雜交。在本發(fā)明中，上述被檢測核酸，例如可以是試樣中本來含有的核酸，也可以是上述核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。后者例如能夠提高檢測精度，故而優(yōu)選，上述擴(kuò)增產(chǎn)物，例如，能夠?qū)⑸鲜鲈嚇又械纳鲜龊怂嶙鳛槟０搴怂?，通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增而制備。上述擴(kuò)增產(chǎn)物例如可以為將上述試樣中的DNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，也可以是將由上述試樣中的RNA合成的cDNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。上述試樣中的RNA例如可以列舉總RNA、mRNA等RNA，上述cDNA例如能夠由上述RNA通過例如RT-PCR(Reverse Transcription PCR)進(jìn)行合成。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法，例如，在上述被檢測核酸為上述擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，例如還可以包括下述(X)工序。上述(X)工序例如優(yōu)選先于上述(A)工序進(jìn)行。另外，上述(X)工序例如也可以是在上述多態(tài)性檢測用探針的存在下，在上述反應(yīng)體系中由上述模板核酸生成上述擴(kuò)增產(chǎn)物的工序。(X)由模板核酸生成上述擴(kuò)增產(chǎn)物的工序在上述(A)工序中，上述多態(tài)性檢測用探針例如可以包含于上述反應(yīng)體系中，其添加的時(shí)間沒有特別限制。在上述被檢測核酸為上述擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，上述(A)工序中的上述反應(yīng)體系例如可以是使用上述(X)工序中所得到的上述擴(kuò)增產(chǎn)物和上述多態(tài)性檢測用探針而新制備的，也可以是在上述(X)工序中上述擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系。在后者的情況下，上述多態(tài)性檢測用探針例如可以在上述(X)工序之前或途中添加到上述擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中，也可以在上述(X)工序之后添加到上述擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中。上述核酸擴(kuò)增法沒有特別限制，例如，可以列舉PCR(聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chain Reaction)法、NASBA (核酸序列依賴性擴(kuò)增Nucleic Acid Sequence BasedAmplification)法、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增=Transcription-Mediated Amplification)法、 SDA(鏈取代擴(kuò)增Strand Displacement Amplification)法等，其中，優(yōu)選PCR法。上述核酸擴(kuò)增法的條件沒有特別限制，可以通過現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行。由上述模板核酸生成上述擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，優(yōu)選使用用于擴(kuò)增包含κ-ras基因中的檢測目的的多態(tài)性的區(qū)域的引物(在下文中，也稱為“κ-ras用引物”)。上述引物的序列沒有特別限制，例如能夠擴(kuò)增含有上述檢測對象部位的檢測對象序列即可，能夠根據(jù)上述檢測對象序列和其周圍的序列等通過現(xiàn)有公知的方法適當(dāng)設(shè)定。上述引物的長度沒有特別限制，能夠設(shè)定為一般的長度，例如，可以列舉10 40個(gè)堿基長度。上述κ-ras用引物，例如能夠使用擴(kuò)增基因的正義鏈的正向引物(下文中也稱為 “F引物”)和擴(kuò)增反義鏈的反向引物(下文中也稱為“R引物”)的任一方，但優(yōu)選使用將兩者設(shè)為一對的引物組合。下面，列舉F引物和R引物，但這些僅為一個(gè)例子，并不限制本發(fā)明。
(F引物)
Fl(序列編號11) 5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3'
F2
5 '-aaggcctgctgaaaatgactg-3 ‘ Fl-LP
5 '-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3 ‘
(R引物) R2
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3' Rl-LP
5 '-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3 ‘
m=c 或 a
(序列編號12) (序列編號32)
(序列編號18) (序列編號33)
(序列編號34)
R3-LP
5 '-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3 ‘ 另外，F(xiàn)引物和R引物，例如可以是能夠與包含密碼子12和密碼子13的全部序列或部分序列的區(qū)域退火而設(shè)計(jì)的引物。此時(shí)，密碼子12和密碼子13的序列，例如，能夠設(shè)定為野生型，但優(yōu)選設(shè)定為突變型。由此，例如即使在突變型K-ras基因?yàn)槲⒘康那闆r下，也能夠有效地?cái)U(kuò)增上述突變型的檢測對象序列。以下，舉例R引物，但這些僅為一個(gè)例子，并不限制本發(fā)明。在下述序列中，下劃線部分是與密碼子12和密碼子13的全部序列(rmtkrc) 或部分序列互補(bǔ)的序列，大寫字母的堿基是與突變型的多態(tài)性互補(bǔ)的堿基。下述R-WT引物是具有與作為全部序列nntkrc的ggtggc互補(bǔ)的序列，且擴(kuò)增野生型的靶部位的引物。下述 R-cl2-XGT、R-C12-GXT和R_cl3_TGC分別是擴(kuò)增突變型的靶部位的引物。下述R_cl2_XGT具有與作為全部序列nntkrc的ngtggc互補(bǔ)的序列。下述R_cl3_TGC具有與作為密碼子13 的全部序列krc的tgc互補(bǔ)的序列。下述R-C13-GAC具有與作為密碼子13的部分序列rc 的ac互補(bǔ)的序列。
權(quán)利要求
1.一種疾病相關(guān)基因κ-ras基因的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，包含下述(Pl)、 (P2)、(P3)、(ΡΓ )、(P2，)和(P3，)中的至少任意一種寡核苷酸(Pl)堿基長度為11 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 230的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與所述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(ΡΓ )由與所述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P2)堿基長度為15 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 234的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與所述堿基序列234的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P2’ )由與所述(P》的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P3)堿基長度為17 50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220 236的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與所述堿基序列236的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P3’ )由與所述(P； )的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述序列編號1表示的堿基序列中第220 225位的堿基序列為ggtggc、agtggc、 cgtggc、tgtggc、gatggc、gctggc、gttggc、ggttgc、ggtgac、aatggc、tttggc、cttggc 和 agtgac中的至少任意一個(gè)。
3.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸在從5’末端數(shù)第1 4位的位置具有與所述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基，所述(P》的寡核苷酸在從5’末端數(shù)第1 4位的位置具有與所述堿基序號234的堿基互補(bǔ)的堿基，所述(P； )的寡核苷酸在從5’末端數(shù)第1 4位的位置具有與所述堿基序號236的堿基互補(bǔ)的堿基。
4.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸在5’末端的位置具有與所述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基，所述(P》的寡核苷酸在5’末端的位置具有與所述堿基序號234的堿基互補(bǔ)的堿基，所述(P； )的寡核苷酸在5’末端的位置具有與所述堿基序號236的堿基互補(bǔ)的堿基。
5.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸為序列編號3所示的寡核苷酸，所述(P》的寡核苷酸為序列編號4、序列編號5或序列編號四所示的寡核苷酸，所述(P； )的寡核苷酸為序列編號6所示的寡核苷酸。 5 '-cctacgymannagctccaactac-3 ‘5'-cttgcctacgymannagctccaactac-3 ‘ 5 '-cttgcctacgymannagctccaactacca-3 ’ 5'-cttgcctacgymann-3' 5 '-ctcttgcctacgymannagctccaact-3 ‘(序列編號3) (序列編號4) (序列編號5) (序列編號29) (序列編號6)
6.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸為序列編號7所示的寡核苷酸，所述(P》的寡核苷酸為序列編號8、序列編號9或序列編號30所示的寡核苷酸，所述(P； )的寡核苷酸為序列編號10或序列編號31所示的寡核苷酸。5'-ctcttgcctacgccaccagctccaacttgctggctacgc-3' (序列編號 31)5'-cctacgccaccagctccaactac-3' 5'-cttgcctacgccaccagctccaactac-3' 5'-cttgcctacgccaccagctccaactacca-3 5 '-cttgcctacgtcacc-3 ‘ 5'-ctcttgcctacgccaccagctccaact-3'(序列編號7) (序列編號8) (序列編號9) (序列編號30) (序列編號10)
7.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于 所述探針為具有熒光標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針。
8.如權(quán)利要求7所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸、(P》的寡核苷酸和(P； )的寡核苷酸在5’末端區(qū)域具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(ΡΓ )的寡核苷酸、(P2’ )的寡核苷酸和(P3’ )的寡核苷酸在3’末端區(qū)域具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求7所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸、(P2)的寡核苷酸和(P； )的寡核苷酸在從5’末端數(shù)第1 4位的堿基的位置具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(ΡΓ)的寡核苷酸、(P2’)的寡核苷酸和(P3’)的寡核苷酸在從3’末端數(shù)第1 4位的堿基的位置具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求7所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于所述(Pl)的寡核苷酸在與所述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(ΡΓ)的寡核苷酸在所述序列編號1中堿基序號230的堿基處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P》的寡核苷酸在所述堿基序號234的堿基互補(bǔ)的堿基處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P2’)的寡核苷酸在所述序列編號1中堿基序號234的堿基處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P； )的寡核苷酸在所述堿基序號236的堿基互補(bǔ)的堿基處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P3’)的寡核苷酸在所述序列編號1中堿基序號236的堿基處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于 所述多態(tài)性檢測用探針為Tm分析用探針。
12.—種疾病相關(guān)基因的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的K-ras基因的多態(tài)性檢測用探針。
13.如權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于還包含用于擴(kuò)增含有K-ras基因中的檢測目的的多態(tài)性的區(qū)域的引物。
14.如權(quán)利要求13所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于所述引物為用于擴(kuò)增含有序列編號1的堿基序列中堿基序號220 225的區(qū)域的引物。
15.如權(quán)利要求13所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于所述引物為由序列編號11、序列編號12和序列編號32中的至少任意一個(gè)所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物，和由序列編號13 18、序列編號33和序列編號34中的至少任意一個(gè)所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物的至少一方。5 ‘ -accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3 ‘(序列編號11)5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3'(序列編號12)5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3 ’(序列編號32)5’-ctcttgcctacgccacc-3’(序列編號13)5'-cactcttgcctacgccacd-3'(序列編號14)5'-gcactcttgcctacgccad-3'(序列編號15)5'-caaggcactcttgcctacgca-3'(序列編號16)5 '-tcaaggcactcttgcctacgt-3'(序列編號17)5 '-ggtcctgcaccagtaatatgca-3'(序列編號18)5 '-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3 ’(序列編號33)5 '-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3 ’(序列編號34)
16.如權(quán)利要求13所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于所述引物為由序列編號13所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物，和由序列編號14 17中至少任意一個(gè)所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物的至少一方。
17.如權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于 還含有BRAF基因的多態(tài)性檢測用探針，所述探針為由能夠與含有序列編號2中堿基序號2 的堿基的區(qū)域雜交的寡核苷酸構(gòu)成的探針。
18.如權(quán)利要求17所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于所述BRAF基因的多態(tài)性檢測用探針為包含由序列編號27和序列編號36的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的探針。5 ‘ -ctagctacagagaaatctc-3 ‘ (序列編號 27) 5 ‘ -gctacagagaaatctc-3 ‘ (序列編號 36)
19.如權(quán)利要求17所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于還包含用于擴(kuò)增BRAF基因中的檢測目的的多態(tài)性的區(qū)域的引物。
20.如權(quán)利要求19所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于所述引物為用于擴(kuò)增含有序列編號2的堿基序列中堿基序號229的堿基的區(qū)域的引物。
21.如權(quán)利要求20所述的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于所述引物為由序列編號20和序列編號38的至少一方所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物，和由序列編號21和序列編號39的至少一方所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物的至少一方。 5 ‘ -cctttacttactacacctcagatatat-3 ‘ (序列編號 20) 5 ‘ -tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3 ‘ (序列編號 38) 5 ‘ -acaactgttcaaactgatgggac-3 ‘ (Ιψ^}^^ 21) 5 ‘ -aaactgatgggacccactccat-3 ‘ (序列編號 39)
22.—種疾病相關(guān)基因的多態(tài)性檢測方法，其特征在于包括使用權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針檢測疾病相關(guān)基因K-ras基因的多態(tài)性的工序。
23.如權(quán)利要求22所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括下述(A)工序和(B)工序(A)使反應(yīng)體系的溫度變化，該反應(yīng)體系包含檢測所述多態(tài)性的被檢測核酸和權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，并測定顯示所述被檢測核酸和所述多態(tài)性檢測用探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值的工序；(B)根據(jù)伴隨所述溫度變化的所述信號值的變動，檢測所述被檢測核酸中所述多態(tài)性的工序。
24.如權(quán)利要求23所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述反應(yīng)體系包含兩種以上的所述多態(tài)性檢測用探針，所述兩種以上的多態(tài)性檢測用探針分別具有不同的熒光標(biāo)記物質(zhì)。
25.如權(quán)利要求23所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于 在所述(A)工序中，所述被檢測核酸為來自模板核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
26.如權(quán)利要求25所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，還包括下述(X)工序 (X)由模板核酸生成擴(kuò)增產(chǎn)物的工序。
27.如權(quán)利要求沈所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述(X)工序?yàn)樵谒龆鄳B(tài)性檢測用探針的存在下，在所述反應(yīng)體系中，由所述模板核酸生成核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的工序，在所述(A)工序中，使所述(X)工序中的所述反應(yīng)體系的溫度變化，進(jìn)行所述信號值的測定。
28.如權(quán)利要求沈所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述(X)工序使用用于擴(kuò)增含有序列編號1的堿基序列中堿基序號220 225的區(qū)域的引物，生成所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
29.如權(quán)利要求觀所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述引物為由序列編號11、序列編號12和序列編號32中的至少任意一個(gè)所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物，和由序列編號13 18、序列編號33和序列編號34中的至少任意一個(gè)所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物的至少一方。. 5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3 (序列編號11) .5 '-aaggcctgctgaaaatgactg-3 ‘ (序列編號12).5 '-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3 ‘(序列編號32).5'-ctcttgcctacgccacc-3' (序列編號13). 5 '-cactcttgcctacgccacd-3 ’ (序列編號14) .5'-gcactcttgcctacgccad-3' (序列編號15) .5'-caaggcactcttgcctacgca-3'(序列編號16) .5 '-tcaaggcactcttgcctacgt-31 (序列編號17) .5 '-ggtcctgcaccagtaatatgca-3'(序列編號18) .5 '-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3,( 序列編號33) . 5 '-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-31 (序列編號34)
30.如權(quán)利要求觀所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述引物為由序列編號13所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物，和由序列編號14 17中至少任意一個(gè)所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物的至少一方。
31.如權(quán)利要求22所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于在同一反應(yīng)體系中檢測出所述疾病相關(guān)基因BRAF基因的多態(tài)性。
32.如權(quán)利要求31所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述(A)工序?yàn)槭狗磻?yīng)體系的溫度變化，該反應(yīng)體系包含檢測所述多態(tài)性的被檢測核酸、權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針和BRAF基因的多態(tài)性檢測用探針，并測定顯示所述被檢測核酸和所述各多態(tài)性檢測用探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值的工序。
33.如權(quán)利要求32所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述BRAF基因的多態(tài)性檢測用探針為由能夠與包含序列編號2的堿基序列中堿基序號229的堿基的區(qū)域雜交的寡核苷酸構(gòu)成的探針。
34.如權(quán)利要求33所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述BRAF基因的多態(tài)性檢測用探針為包含由序列編號27和序列編號36的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的探針。.5 ‘ -ctagctacagagaaatctc-3 ‘ (序列編號 27).5 ‘ -gctacagagaaatctc-3 ‘ (序列編號 36)
35.如權(quán)利要求32所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針和所述BRAF基因的多態(tài)性檢測用探針為分別具有不同標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針。
36.如權(quán)利要求觀所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述(X)工序同時(shí)使用用于擴(kuò)增含有序列編號2的堿基序列中堿基序號229的堿基的區(qū)域的引物，生成所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
37.如權(quán)利要求36所述的多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述引物為由序列編號20和序列編號38的至少一方所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物，和由序列編號21和序列編號39的至少一方所示的寡核苷酸構(gòu)成的引物的至少一方。.5 ‘ -cctttacttactacacctcagatatat-3 ‘ (序列編號 20)·5 ‘ -tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3 ‘ (序列編號 38) 5 ‘ -acaactgttcaaactgatgggac-3 ‘ (Ιψ^}^^ 21) 5 ‘ -aaactgatgggacccactccat-3 ‘ (序列編號 39)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對于K-ras基因能夠簡便且以優(yōu)異的可靠性判別不同多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針及其用途。將包含下述(P1)、(P2)、(P3)、(P1’)、(P2’)和(P3’)中的至少任意一種寡核苷酸的探針作為疾病相關(guān)基因K-ras基因的多態(tài)性檢測用探針。(P1)堿基長度為11～50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220～230的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序號230的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P1’)由與上述(P1)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P2)堿基長度為15～50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220～234的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序列234的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P2’)由與上述(P2)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；(P3)堿基長度為17～50個(gè)堿基，由與包含序列編號1中堿基序號220～236的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，且在5’末端區(qū)域具有與上述堿基序列236的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；(P3’)由與上述(P3)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。
文檔編號C12N15/09GK102317454SQ20108000825
公開日2012年1月11日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者小森真理子, 細(xì)見敏也 申請人:愛科來株式會社