用于與egfr基因雜交的dna探針庫及采用其富集egfr基因片段的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于與EGFR基因雜交的DNA探針庫，所述DNA探針庫包括一個或多個能夠與EGFR基因雜交的DNA探針，所述DNA探針包含以下序列：SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8、SEQ?ID?NO.9、或SEQ?ID?NO.10。本發(fā)明還提供了采用該DNA探針庫富集EGFR基因片段的方法?；诖耍景l(fā)明還提供了一種檢測EGFR基因的基因結(jié)構(gòu)突變的方法。采用本發(fā)明的方法可以成數(shù)千倍、甚至上萬倍地富集得到EGFR基因片段，并可以將其用于下一代測序技術以進行基因結(jié)構(gòu)突變的檢測，包括單堿基突變、mRNA缺失或增多、mRNA結(jié)構(gòu)顛換、mRNA剪接變化。
【專利說明】用于與EGFR基因雜交的DNA探針庫及采用其富集EGFR基因片段的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因檢測領域，具體而言，本發(fā)明涉及一種EGFR基因片段的富集和提取方法，所述方法可以精準地富集EGFR基因片段，進而可以選擇性地進行EGFR基因結(jié)構(gòu)突變的檢測。
【背景技術】
[0002]DNA測序技術正處在天翻地覆的劇變中，其突出特點為同時對眾多的位點進行觀察分析(大規(guī)模平行)，從而逐步實現(xiàn)測序通量的大幅增長，原始數(shù)據(jù)中每個堿基的測序成本的急劇下跌?；诖?，以前高不可攀的奢侈性活動(如個人基因測序、宏基因組學研究)，逐漸變得越來越切實可行。特別是隨著科學的發(fā)展，由于傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，下一代測序技術(第二代測序技術，Next-generation sequencing)應運而生。
[0003]下一代測序技術是同步化三磷酸核苷酸的洗脫方法和同步化的光學檢測方法的結(jié)合。例如采用以魯米那(Illumina)提供的儀器，以短的連續(xù)性的片段序列和測序閱讀長度的形式，每周輸出數(shù)億以計的堿基的DNA序列。這是一種由DNA連接酶和聚合酶主導化學過程的第二代測序方法，DNA序列將會用生物信息學的方法拼接還原。在成本方面，下一代測序技術比第一代測序技術大體上降低了 1000倍，并且還正以指數(shù)級的速度下降。目前下一代測序技術已經(jīng)廣泛應用于全基因組測序，但是在其它基因分析領域，例如特定基因結(jié)構(gòu)突變的檢測等方面尚未得到充分開發(fā)。
[0004]基因檢測是利用血液、其他體液或細胞對核酸進行檢測的技術，其通過特定設備對被檢測者核酸分子信息作檢測，分析它所含有的各種基因情況，從而使人們能了解自己的基因信息，判斷身體患有疾病的情況或風險，從而可適應性地選擇疾病治療方案，甚至預防疾病的發(fā)生。
[0005]現(xiàn)有的基因突變檢測方法還主要集中于以下3個技術:
[0006]1)PCR突變檢測
[0007]基于PCR片段擴增和凝膠電泳分離的方法，從而分辨出野生型和突變性的差異。其缺點包括:其為單堿基突變類型檢測，不能對mRNA進行定量，不能檢測基因顛換；敏感性低；耗時長，單次只能檢測一個基因突變；不能確定堿基的具體變化；無法進行高通量檢測。
[0008]2) Q-PCR (定量 PCR)檢測
[0009]基于熒光和PCR片段擴增來對模板mRNA多少來進行定量。其缺點包括:不能檢測單堿基類型突變；不能檢測基因顛換；只能檢測已知突變；耗時長，單次只能檢測一個基因突變；不能確定堿基的具體變化。
[0010]3)基因芯片技術
[0011]用高精度技術將·DNA片段打印在芯片上，然后通過DNA雜交結(jié)合特性來確定突變性質(zhì)。其缺點包括:不能檢測基因顛換；只能檢測已知突變；成本高，通量較??；準確率低，通常需要重復2次以上才能確定結(jié)果。
[0012]因此可知，目前在基因檢測技術方面尚缺少更為全面、快速、簡便、準確的檢測方法，特別是在目前擁有下一代測序技術這種以高通量、低成本基因測序為特點的技術的情況下，如何基于下一代測序技術開發(fā)新型基因檢測和篩查技術，是本領域研究人員廣泛關注的問題。并且，如果應用下一代測序技術來檢測基因的結(jié)構(gòu)突變情況，如何獲得能夠滿足下一代測序技術要求的基因檢測樣本，也是期待解決的一個技術問題。
[0013]EGFR是一種可以激活細胞增殖的穿膜信號蛋白。受到上皮生長因子刺激時，會與EGFR家族的其他成員或者自身形成蛋白雙體，從而激活它自身的酪氨酸激酶活性，啟動其下游的一系列傳導因子的磷酸化。EGFR的下方通路包括MAPK和PI3K-AKT等。因此，EGFR在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、修復和生存、新生血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中都具有重要的作用，同時在三分之二的人類腫瘤中都有廣泛表達。各種研究都表明，EGFR突變/表達增加在多種癌癥中扮演重要角色，如非小細胞肺癌類，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌以及大腸癌。此外，在很多惡性腫瘤中，EGFR的表達往往與較差的預后和較低的生存率相關。
[0014]目前已經(jīng)開發(fā)了多種針對EGFR突變的單抗體，或者作為小分子抑制劑來隔斷癌癥細胞表面EGFR受體與受質(zhì)的相互作用，或者抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，從而既能減緩或者抑制癌細胞生長，也能增加化療和放療的抗腫瘤功效。目前針對EGFR的腫瘤藥物主要有西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(Panitumumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、以及小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙(Gefitinib)、特羅凱(Erlotinib)和TO168393。
[0015]檢測EGFR基因突變，對判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療藥物的選擇等方面均有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]針對上述技術問題，本發(fā)明人通過大量實驗，開發(fā)了基于雜交選擇而捕獲EGFR基因片段序列的方法，采用該方法可以獲得成幾千倍、甚至上萬倍富集的EGFR基因片段，該經(jīng)富集的EGFR基因片段樣本可以選擇`性地應用于各種基因檢測技術，特別是可以應用下一代測序技術進行基因突變、缺失、增加、和顛換等方面的檢測。
[0017]具體而言，本發(fā)明的技術方案如下:
[0018]一方面，本發(fā)明提供了一種用于與EGFR基因雜交的DNA探針庫，所述DNA探針庫包括一個或多個能夠與EGFR基因雜交的DNA探針，所述DNA探針包含以下序列:
[0019]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；
[0020]優(yōu)選地，所述DNA探針的序列如以下序列所示:
[0021]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
[0022]另一方面，本發(fā)明提供一種富集EGFR基因片段的方法，所述方法包括以下步驟:
[0023]1)獲得受試者的DNA樣本庫；
[0024]2)獲得能夠與EGFR基因雜交的DNA探針庫；
[0025]3)使所述DNA探針庫與所述DNA樣本庫進行雜交；和[0026]4)分離步驟3)的雜交產(chǎn)物，然后釋放經(jīng)雜交富集的EGFR基因片段。
[0027]其中，所述步驟1)中的DNA樣本庫由雙鏈DNA片段組成，并且，所述步驟1)包括:
[0028]1-1)提取受試者的全基因組DNA，然后將其片段化；或者
[0029]1-2)提取受試者的mRNA，將其片段化，然后以該經(jīng)片段化的mRNA為模板合成雙鏈 cDNA ；
[0030]其中，所述受試者為哺乳動物，優(yōu)選人，且從受試者的細胞、組織或體液樣本中提取全基因組DNA或mRNA ； [0031]優(yōu)選地，所述DNA片段的長度為150_600bp ；
[0032]進一步優(yōu)選地，所述DNA片段的長度為150_200bp。
[0033]所述步驟2)中的DNA探針庫為如上所述的DNA探針庫。具體而言，所述DNA探針庫包括一個或多個能夠與EGFR基因雜交的DNA探針，所述DNA探針包含以下序列:
[0034]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；
[0035]優(yōu)選地，所述DNA探針的序列如以下序列所示:
[0036]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
[0037]此外，所述步驟3 )包括:
[0038]3-1)采用選擇性標記標記DNA探針庫中的DNA探針；和
[0039]3-2)使所述DNA探針庫與DNA樣本庫進行雜交；
[0040]優(yōu)選地，所述步驟3-1)中的選擇性標記為生物素；進一步優(yōu)選地，所述步驟3-2)包括在PCR擴增儀中，在65°C下將所述DNA探針庫與DNA樣本庫孵育24小時。
[0041 ] 因此，所述方法的步驟4)中，優(yōu)選利用DNA探針上的選擇性標記分離雜交產(chǎn)物。進一步優(yōu)選地，所述步驟3-1)中的選擇性標記為生物素，所述步驟4)中利用鏈霉親和素-生物素的親和作用分離雜交產(chǎn)物。
[0042]另一方面，本發(fā)明還提供一種檢測EGFR基因的基因結(jié)構(gòu)突變的方法，所述方法包括以下步驟:
[0043]1)根據(jù)上述方法富集EGFR基因片段；和
[0044]2)檢測所述EGFR基因的基因結(jié)構(gòu)突變。
[0045]優(yōu)選地，所述步驟2)中采用下一代測序技術，通過對富集到的EGFR基因片段進行測序而檢測所述EGFR基因的結(jié)構(gòu)突變。
[0046]又一方面，本發(fā)明提供一種用于富集EGFR基因片段的試劑盒，所述試劑盒包含上述的DNA探針庫。具體而言，所述DNA探針庫包括一個或多個能夠與EGFR基因雜交的DNA探針，所述DNA探針包含以下序列:
[0047]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；
[0048]優(yōu)選地，所述DNA探針的序列如以下序列所示:
[0049]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
[0050]以下是本發(fā)明的詳細描述:[0051]本發(fā)明提供一種富集EGFR基因片段的方法。具體而言，本發(fā)明的方法包括:從哺乳動物例如人的細胞、體液或組織樣本中提取基因組DNA或mRNA，經(jīng)處理或合成cDNA，從而獲得片段化的雙鏈DNA作為DNA樣本庫；此外，針對要富集的EGFR基因，設計與該EGFR基因雜交的DNA探針，從中篩選出多個探針作為DNA探針庫；然后，將該DNA樣本庫與DNA探針庫進行雜交，從而從DNA樣本庫中富集得到EGFR基因片段。根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，可以先將DNA探針庫中的各個探針進行生物素化，然后在雜交后用鏈霉親和素磁珠吸附雜交產(chǎn)物，再從磁珠上釋放出富集的EGFR基因片段。經(jīng)適應性處理，可以采用下一代測序基因?qū)GFR基因進行基因結(jié)構(gòu)突變的檢測，包括單堿基突變、mRNA缺失或增多、mRNA結(jié)構(gòu)顛換、mRNA剪接變化。
[0052]下面以富集得到的EGFR基因片段用于基于下一代測序技術的基因結(jié)構(gòu)突變檢測為例，示例性地說明本發(fā)明，其中總體工藝流程見圖1。
[0053]一、準備 mRNA / DNA 樣本庫
[0054]1.準備基因組DNA樣本(采用此種方式獲得的DNA樣本庫稱為“源自全基因組的DNA樣本庫”)
[0055]1.1DNA 提取
[0056]DNA提取，包括新鮮組織，新鮮血液和細胞，固定和石蠟樣本，商業(yè)化公司提取試劑盒。以上均按說明書指示方法操作。
[0057]使用分光光度定量儀以及凝膠電泳系統(tǒng)檢測DNA模板質(zhì)量和濃度。dsDNA模板260nm吸光率大于0.0 5以上，吸光率A260/A280比值在1.8到2之間為合格。
[0058]1.2DNA 片段化
[0059]將3微克高質(zhì)量的基因組DNA用低TE緩沖液稀釋至120微升。按照組織勻漿機使用說明書，將DNA片段化，片段長度為150-200堿基。
[0060]DNA過柱純化,商業(yè)化公司純化試劑盒。
[0061 ] 1.3DNA樣本庫質(zhì)量檢測
[0062]用生物分析儀進行DNA定性定量分析，確認DNA片段長度峰值合理。
[0063]2.準備cDNA樣本(采用此種方式獲得的DNA樣本庫稱為“源自mRNA的DNA樣本庫”即cDNA樣本庫)
[0064]2.1mRNA 提取
[0065]mRNA提取，包括新鮮組織，新鮮血液和細胞，固定和石蠟樣本，商業(yè)化公司提取試劑盒。以上均按說明書指示方法操作。
[0066]使用分光光度定量儀以及凝膠電泳系統(tǒng)檢測mRNA質(zhì)量和濃度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之間為合格。
[0067]2.2mRNA 片段化
[0068]采用NEBNext RNA Fragmentation系統(tǒng)或者其他商業(yè)化公司mRNA片段化試劑盒。
[0069]mRNA過柱純化,商業(yè)化公司純化試劑盒
[0070]2.3用商業(yè)化公司cDNA合成試劑盒進行mRNA合成第一鏈以及第二鏈cDNA。
[0071]cDNA過柱純化,商業(yè)化公司純化試劑盒。
[0072]3.cDNA / DNA 末端修補
[0073]利用T4聚合酶及Klenow大腸桿菌聚合酶片斷，對于cDNA/DNA5’突出粘末端補平以及3’突出粘末端打平，產(chǎn)生平末端，用于后續(xù)的平端連接。反應在PCR擴增儀中進行，20攝氏度，30分鐘。
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種用于與EGFR基因雜交的DNA探針庫，其特征在于，所述DNA探針庫包括一個或多個能夠與EGFR基因雜交的DNA探針，所述DNA探針包含以下序列:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；優(yōu)選地，所述DNA探針的序列如以下序列所示:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
2.一種富集EGFR基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:1)獲得受試者的DNA樣本庫；2)獲得能夠與EGFR基因雜交的DNA探針庫；3)使所述DNA探針庫與所述DNA樣本庫進行雜交；和4)分離步驟3)的雜交產(chǎn)物，然后釋放經(jīng)雜交富集的EGFR基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中的DNA樣本庫由雙鏈DNA片段組成，并且，所述步驟1)包括:1-1)提取受試者的全基因組DNA，然后將其片段化；或者1-2)提取受試者的mRNA，將其片段化，然后以該經(jīng)片段化的mRNA為模板合成雙鏈cDNA ；`其中，所述受試者為哺乳動物，優(yōu)選人，且從受試者的細胞、組織或體液樣本中提取全基因組DNA或mRNA ；優(yōu)選地，所述DNA片段的長度為150-600bp ；進一步優(yōu)選地，所述DNA片段的長度為150-200bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中的DNA探針庫為根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA探針庫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟3)包括:3-1)采用選擇性標記標記DNA探針庫中的DNA探針；和3-2)使所述DNA探針庫與DNA樣本庫進行雜交；優(yōu)選地，所述步驟3-1)中的選擇性標記為生物素；進一步優(yōu)選地，所述步驟3-2)包括在PCR擴增儀中，在65°C下將所述DNA探針庫與DNA樣本庫孵育24小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中利用DNA探針上的選擇性標記分離雜交產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述步驟3-1)中的選擇性標記為生物素，所述步驟4)中利用鏈霉親和素-生物素的親和作用分離雜交產(chǎn)物。
7.—種檢測EGFR基因的基因結(jié)構(gòu)突變的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:1)根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法富集EGFR基因片段；和2)檢測所述EGFR基因的基因結(jié)構(gòu)突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采用下一代測序技術，通過對富集到的EGFR基因片段進行測序而檢測所述EGFR基因的結(jié)構(gòu)突變。
9.一種用于富集EGFR基因片段的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA探針庫 。
【文檔編號】C12N15/10GK103667270SQ201310430173
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】邵陽 申請人:邵陽