專利名稱：NPM1基因的exon12突變檢測用探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種NPMl基因的eXOnl2突變的檢測方法以及用于該檢測方法的核酸探針和試劑盒。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量與急性髓系白血病(AML)病因相關(guān)的DNA突變。目前已經(jīng)報告了 NPMl基因突變在成人急性髓系白血病患者體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，而且與通過將NPMl基因突變與FLT3-ITD基因突變的結(jié)果結(jié)合起來考慮來進(jìn)行預(yù)后預(yù)測相關(guān)(Blood. 2007 ；109 874-885)。作為NPMl基因的突變類型，例如，記載在New Eng J Med 352 =254-266,2005,Blood. 2005 ；106 :1419-1422, Blood. 2005 ；106 :3740-3746, Blood. 2005 ；106 :3733-3739,Blood. 2006 ；108 :1999-2005, Blood. 2005 ；106 :2854-2861 中，根據(jù)報告病例數(shù)的多少以及發(fā)生突變的堿基序列的部位，可以舉出具有代表性的突變TypeA、TypeB, TypeD, Type7、TypeQ、TypelO、TypeE、Type60
作為檢測堿基多態(tài)性的檢測方法已知以下方法。Blood. 2005，106 :2854-2861記載了如下方法，在PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行電泳分離，再從切出的凝膠中精制擴(kuò)增產(chǎn)物，然后進(jìn)行直接測序的方法。Haematologica 2007 ；92 1268-1269中記載了通過DHPLC法和序列測定法進(jìn)行檢測的方法。但是，上述這些方法存在以下問題(I)由于提取擴(kuò)增產(chǎn)物，所以有發(fā)生污染的可能性；(2)不能夠進(jìn)行自動化操作，而且需要對各個項目逐項進(jìn)行操作，因此需要花費(fèi)人力和費(fèi)用；(3)進(jìn)行結(jié)果分析時，需要專業(yè)知識和專業(yè)技能；(4)由于進(jìn)行序列分析的檢測特異性僅為20%左右，對于含有正常細(xì)胞比例較高的癌細(xì)胞，檢測變得困難。另一方面，已知如下方法對含有突變的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線分析的結(jié)果分析突變的方法(特開2001-286300號公報(專利文獻(xiàn)I)、特開2002-119291號公報(專利文獻(xiàn)2))。關(guān)于探針的設(shè)計，這些文獻(xiàn)給出了以下的啟示在末端部使用熒光染料標(biāo)記了的淬滅探針與靶標(biāo)核酸探針進(jìn)行雜交時，在末端部分，探針-核酸雜交體的多個堿基對中至少一對形成G和C堿基對。但是，這些方法在實施方面存在無法對全部的任意序列進(jìn)行實施的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于，確定一種有效檢測NPMl基因的eXonl2突變的探針，并提供NPMl基因的eXonl2突變的檢測方法以及用于該檢測的試劑盒。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過基于含有NPMl基因的exonl2突變的特定區(qū)域設(shè)計探針，并使用該探針進(jìn)行熔解曲線分析，能夠檢測相應(yīng)的突變，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述。(I)多態(tài)性檢測用探針，其為用于檢測NPMl基因的exonl2突變的探針，其特征在于，所述探針為由選自下述的P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、Pl、Pl ’、P2和P2’中的至少一種熒
光標(biāo)記寡核苷酸構(gòu)成，(P5)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P5’)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，并且與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P6)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P6’)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤、與編號第145位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；
(P7)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤、與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P7’)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤、與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(Pl)寡核苷酸具有與序列編號I所不的堿基序列中的、含有編號135 150的堿基的16 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第135位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸具有與序列編號I所不的堿基序列中的、含有編號135 150的堿基的16 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第135位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號164 182位的堿基的19 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；以及(P2’)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號164 182的堿基的19 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。(2)如⑴記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸在3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號145的堿基對應(yīng)的堿基，Pl以及P1’寡核苷酸在3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號135的堿基對應(yīng)的堿基，P2以及P2’寡核苷酸在5’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號182的堿基對應(yīng)的堿基。(3)如(I)記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，？5、？5’、？6、？6’、？7和？7’寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號145的堿基對應(yīng)的堿基，Pl和P1’寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與編號135的堿基對應(yīng)的堿基，P2和P2’寡核苷酸在5’末端具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號182的堿基對應(yīng)的堿基。(4)如⑴記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，Pl和P1’寡核苷酸以與編號153 156的堿基中的任意堿基對應(yīng)的堿基為5’末端，并且熒光染料標(biāo)記的與編號135的堿基對應(yīng)的喊基位于3’末端；P2和P2’寡核苷酸以與編號153 156的堿基中的任意堿基對應(yīng)堿基為3’末端，以熒光染料標(biāo)記的與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為5’末端。(5)如⑴記載的多態(tài)性檢測用探針，其中， 515’16、？6’、？7和？7’寡核苷酸以編號16 2的堿基為5’末端，在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與編號145的堿基對應(yīng)的堿基，Pl和P1’寡核苷酸以編號155的堿基為5’末端，在3’末端具有熒光染料標(biāo)記的與編號135的堿基對應(yīng)的堿基，P2和P2’寡核苷酸以編號156的堿基為3’末端，在5’末端具有熒光染料標(biāo)記的與編號182的堿基對應(yīng)的堿基。(6)如⑴ (5)中任意一項記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述的寡核苷酸未與目標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，并且與目標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少或增加。(7)如(6)記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述的寡核苷酸未與目標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，而與目標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少。(8)如⑴ (7)中任意一項記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述探針為用于熔解曲線分析的探針。(9)如(I) (8)中任意一項記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，P5、P5，、P6、P6，、P7和P7’寡核苷酸的堿基長為12 35 ；P1和P1’寡核苷酸的堿基長為16 35 ；P2和P2’寡核苷酸的堿基長為19 35。(IO)NPMl基因的exonl2的多態(tài)性的檢測方法，其特征在于使用⑴ (9)中任意一項記載的探針中的至少一種。(Il)NPMl基因的exonl2多態(tài)性的檢測方法，其特征在于包含下述⑴ (IV)步驟(I)向含有核酸的試樣中，添加⑴ (9)中任意一項記載的探針，使探針與上述核酸進(jìn)行雜交的步驟；(II)改變溫度，使由上述核酸與上述探針組成的雜交體形成體解離，測定基于雜交體形成體解離的信號變動的步驟；(III)分析上述信號的變動，檢測出上述試樣中單鏈核酸的Tm值的步驟；以及(IV)根據(jù)上述Tm值，檢測上述試樣中單鏈核酸中，目標(biāo)多態(tài)性的有無或含有多態(tài)性的單鏈核酸的豐度比的步驟。(12)如(11)記載的方法，還包括在進(jìn)行步驟⑴之前或進(jìn)行步驟⑴的同時，擴(kuò)增 DNA。(13)對急性髓系白血病的易患性，病理狀態(tài)和/或預(yù)后進(jìn)行分析的方法，包括通過(10) (12)中任意一項記載的方法，檢測NPMl基因的eXonl2的多態(tài)性的步驟；以及確定多態(tài)性的有無的步驟。(14)用于檢測NPMl基因的多態(tài)性的試劑盒，其包含(I) (9)中任意一項記載的探針。
(15)如(14)記載的試劑盒，還包括用于擴(kuò)增NPMl基因的序列編號I所示的堿基序列中含有與P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、PU PI’、P2、P2，寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。(16)如(14)或(15)記載的試劑盒，其中，上述引物為選自下述P3和P4以及P3’和P4’的多態(tài)性檢測用引物，(P3)為以第106位堿基T為3’末端，且與序列編號I同源的10 50個堿基的寡核苷酸，和(P4)為以第205位堿基T為3’末端，且與序列編號I的互補(bǔ)鏈具有同源性的10 50個堿基的寡核苷酸，以及(P3’)為以第106位堿基T為3’末端，且具有與序列編號I的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列的10 50個堿基的寡核苷酸，和 (P4’)為以第205位堿基T為3’末端，且具有與序列編號I的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列的10 50個堿基的寡核苷酸。僅通過添加本發(fā)明的探針來進(jìn)行熔解曲線分析(Tm分析)，就能夠檢測出NPMl基因的eXonl2的突變。本發(fā)明的探針特異性高，檢測靈敏度高。通過使用本發(fā)明的方法，即使在進(jìn)行PCR的情況下，也無需提取擴(kuò)增產(chǎn)物，因此幾乎沒有污染的危險性。此外，本發(fā)明的方法，由于操作簡單，因此容易自動化操作。使用本發(fā)明的探針，能夠識別目前報告了的突變中的具有代表性的8種突變類型中的7種突變。而且，對于具有代表性的2個突變型(Type A、E)，即使野生型中包含10%的突變，也能夠檢測出來。


圖I為(A)為示出核酸混合物的熔解曲線的示例以及圖I(B)為示出微分熔解曲線的示例的圖。圖2為示出標(biāo)準(zhǔn)曲線的示例的圖。圖3為本發(fā)明的探針的設(shè)計概略圖。該圖示出實施例中使用的本發(fā)明的探針的位置。并示出比較例中使用的探針的位置。圖4 :在實施例I的WT(互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，以每單位時間的TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)的熒光強(qiáng)度的變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)為縱軸，溫度為橫軸，示出二者的關(guān)系。以下各圖中縱軸和橫軸的關(guān)系與本圖相同。圖5 :在關(guān)于實施例I的mt typeA (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。圖6 :在關(guān)于實施例I的mt typeB (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。圖7 :在關(guān)于實施例I的mt typeD (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。圖8 :在關(guān)于實施例I的mt type7 (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-Rl)。圖9:在關(guān)于實施例I的WT(互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。
圖10 :在關(guān)于實施例I的mt typeQ (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。圖11 :在關(guān)于實施例I的mt typel0(互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。圖12 :在關(guān)于實施例I的mt typeE (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。圖13 :在關(guān)于實施例I的mt type6 (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(5T-NPMl-el2-R2)。圖14:在關(guān)于比較例I的WT(互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖15 :在關(guān)于比較例I的mt typeA (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖16 :在關(guān)于比較例I的mt typeB (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖17 :在關(guān)于比較例I的mt typeD (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖18 :在關(guān)于比較例I的mt type7 (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖19 :在關(guān)于比較例I的mt typeQ (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖20 :在關(guān)于比較例I的mt typelO (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖21 :在關(guān)于比較例I的mt typeE (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖22 :在關(guān)于比較例I的mt type6 (互補(bǔ)鏈寡核苷酸)的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖23 :在關(guān)于實施例2的血液樣品的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPYFL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖24 :在關(guān)于實施例2WT100% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖25 :在關(guān)于實施例2的mt typeA100% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖26 :在關(guān)于實施例2的mt typeA30% ,Wt70% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖27 :在關(guān)于實施例2的mt typeA20% ,Wt80% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖28 :在關(guān)于實施例2的mt typeA10% ,Wt90% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖29 :在關(guān)于實施例2的mt typeE100% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖30 :在關(guān)于實施例2的mt typeE30% ,Wt70% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖31 :在關(guān)于實施例2的mt typeE20% ,Wt80% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖32 :在關(guān)于實施例2的mt typeE10% ,Wt90% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL(3FL-NPMl-el2-Rl)(左圖)和 TAMRA(5T-NPMl_el2-R2)(右圖)。圖33 :在關(guān)于比較例2的血液樣品的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖34 :在關(guān)于比較例2的WT100 % (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用 了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖35 :在關(guān)于比較例2的mt typeA100% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖36 :在關(guān)于比較例2的mt typeA20% ,Wt80% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖37 :在關(guān)于比較例2的mt typeE100% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖38 :在關(guān)于比較例2的mt typeE 20%,Wt 80% (質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(3T-NPMl-el2-R3)。圖39 :在關(guān)于實施例4的mt type A(質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 Pacific Blue (mtA_R4)。圖40 :在關(guān)于實施例4的mt type A(質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 TAMRA(mtB-R5)。圖41 :在關(guān)于實施例4的mt type A(質(zhì)粒)的PCR反應(yīng)后的Tm分析中，探針使用了 BODIPY FL (mtD-R6)。
具體實施例方式<1>本發(fā)明的探針以及本發(fā)明的檢測方法本發(fā)明所用探針為用于檢測NPMl基因的eXonl2的突變的探針，其特征在于該探針為選自由下述的(P5)、(P5’ )、(P6)、(P6，) (P7)、(P7’ )、(PI)、(P2)、(P1，)、(P2，)中的至少一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸組成的多態(tài)性檢測用探針。(P5)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P5’)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，并且與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P6)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P6’)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號第145位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P7)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P7’)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (Pl)寡核苷酸具有與序列編號I所不的堿基序列中的、含有編號135 150的堿基的16 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第135位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸具有與序列編號I所不的堿基序列中的、含有編號135 150的堿基的16 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第135位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號164 182位的堿基的19 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；以及(P2’)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號164 182的堿基的19 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。本發(fā)明的探針具有序列編號2所示的堿基序列(具有NPMl基因的eXonl2的突變typeA的堿基的序列)中由上述(P5)、(P5，)、(P6)、(P6，)、(P7)、(P7，)確定的序列，對于(P6)、(P6’)而言，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，對于(P7)、(P7’)而言，與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，除此之外與專利文獻(xiàn)1、2中記載的淬滅探針同樣地制作。另外，本發(fā)明的探針含有序列編號I所示的堿基序列(含有NPMl基因的eXonl2為野生型的堿基的序列)中上述的(Pl)、(PI’)、(P2)和(P2’)所確定的序列之外，可以與特開2001-286300號公報、特開2002-119291號公報記載的淬滅探針同樣地制作。而且，本發(fā)明的序列編號I所示的序列為GeneBank登錄號NG 016018的第27689 28278號。另夕卜，序列編號2所示的序列與序列編號I所示的序列僅在添加了編號第153 157位的堿基這4個堿基這一點(diǎn)不同。作為本發(fā)明的探針長度，P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’例如為12 50堿基長、12 35堿基長、或12 30堿基長。PU P1’為16 50堿基長，16 35堿基長或16 30堿基長。P2、P2’為19 50堿基長，19 35堿基長或19 30堿基長。本發(fā)明的探針中，P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’例如為以與序列編號2所示的堿基序列中的編號160 163的堿基中任何堿基對應(yīng)的堿基為5’末端的探針，例如，以堿基編號162的堿基為5’末端，以堿基編號145的堿基為3’末端。本發(fā)明所用的探針，例如為與序列編號I所示堿基序列中的編號153 156的堿基(下述表I中的gcag)中任意堿基的對應(yīng)的堿基為末端的探針。PU P1’以編號153 156的堿基(下述表I中的gcag)中任意堿基為5’末端，P2、P2’以第153 156堿基中任意堿基為3’末端。本發(fā)明的探針中，例如在如圖I所示的堿基序列中，P1、P1’以編號155的堿基為5’末端，P2、P2’以第156位堿基為3’末端。本發(fā)明中的“同源性”意指在特定的堿基序列中，例如與堿基序列的互補(bǔ)鏈具有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性的序列的堿基序列。在本申請中，也可以具有100%的同一性。本申請中的雜交可以根據(jù)公知的方法或者以其為標(biāo)準(zhǔn)的方法，例如MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等進(jìn)行。該文獻(xiàn)經(jīng)此引用并入本申請說明書。
本申請所謂“嚴(yán)謹(jǐn)條件”意指形成特異的雜交體，而不形成非特異的雜交體的條件。典型的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”例如可以為，鉀離子濃度為約25mM 約50mM以及鎂離子的濃度為約I. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。本發(fā)明的條件的一個示例可以為Tris-HCl (pH8. 6)、25mM KCl以及I. 5mM MgCl2中進(jìn)行雜交的條件。但是，本發(fā)明不限于此。此外，嚴(yán)謹(jǐn)條件記載在 Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press,2001)中。此文獻(xiàn)經(jīng)此引用并入本申請的說明書。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等，容易對于這些條件做出選擇。另外，本發(fā)明的所述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、PI、PI’、P2、P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸中包含在所述？545’、？6、？6’、？7、？7’、？1、？1’、？2、？2’熒光標(biāo)記寡核苷酸中分別插入、缺
失或取代了堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸。該插入、缺失或取代了堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸只要顯示與所述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、P1、P1’、P2、P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了堿基的情況下，其插入、缺失或取代的位置無特別限定。插入、缺失或取代的堿基的數(shù)量可以為I個堿基或2個堿基以上，插入、缺失或取代的堿基的數(shù)量根據(jù)熒光標(biāo)記寡核苷酸總體的長度而不同，例如可以為I個堿基 10個堿基或I個堿基 5個堿基。在插入、缺失或取代中，作為本發(fā)明的所述P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、PU PI’、P2、P2，熒光標(biāo)記寡核苷酸，可以舉出分別取代了所述P5、P5，、P6、P6，、P7、P7’、PU P1，、P2、P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸。取代的位置無特別限定。例如從檢測靈敏度的觀點(diǎn)來說，可以為序列編號2所示的序列中的第152位 第166位的堿基以外位置、或者序列編號I所示的序列中的第152位 第162位的堿基以外的位置的堿基被取代。作為被取代的堿基的數(shù)量，可以舉出I個堿基或2個堿基以上。被取代的堿基的數(shù)量根據(jù)熒光標(biāo)記寡核苷酸總體的長度而不同，例如可以為I個堿基 5個堿基、或I個堿基 3個喊基。作為所述熒光標(biāo)記寡核苷酸中的寡核苷酸，除了寡核苷酸之外，還包括經(jīng)修飾的寡核苷酸。所述寡核苷酸的構(gòu)成單位例如可以為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、人工核酸等。所述人工核酸例如可以為DNA、RNA、作為RNA類似物的LNA(鎖核酸)；作為肽核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid);作為交聯(lián)核酸的BNA(橋聯(lián)核酸)等。所述寡核苷酸可以由所述構(gòu)成單位中的一種構(gòu)成，也可以由多種構(gòu)成。本發(fā)明中使用的用于檢測NPMl基因exonl2突變的的探針的堿基序列的不例，可以為P5 :5’ -cactgcCAGAcagagatc-3’(序列編號56), P6 5’ -cactgcCATGcagagatc-3’(序列編號 57), P7 :5’ _cactgcCAGGcagagatc_3’(序列編號58) ,Pl :5’ -tgccagagatcttgaatagcc-3 (序列編號 4) ,P2 :5’ -ctattttcttaaagagacttcctccac-3’(序列編號5)。熒光染料可以使用特開2001-286300號公報、特開2002-119291號公報記載的熒光染料。具體示例可以為Pacific Blue (商標(biāo))、FAM(商標(biāo))、TAMRA(商標(biāo))、B0DIPY FL(商標(biāo))等。將熒光染料結(jié)合至寡核苷酸的方法，可以按照常用的方法，例如特開2001-286000號公報、特開2002-119291號公報中記載的方法進(jìn)行。本發(fā)明可以通過使用(P5)、(P5，)，(P6)，(P6，)、(P7)、(P7，)、(Pl)、(PI，)、(P2) 或(P2’)中的任意一種寡核苷酸，例如通過使用(P5)、(P6)、(P7)或(P5’)、(P6’)、(P7’)這三種寡核苷酸，例如通過使用(PD和(P2)或(P1’ )和(P2’ )這2種寡核苷酸，通過使用本實施例3、4所示的序列編號56-58所示的探針,或者通過如實施例1、2所示的序列編號4、5所示的探針，對NPMl基因exon 12突變進(jìn)行檢測(圖3)。本發(fā)明的探針優(yōu)選為，未與目標(biāo)序列雜交時熒光染料發(fā)出熒光，與目標(biāo)序列雜交時，熒光染料的熒光減少或增加。本發(fā)明的探針也可以為未雜交時熒光染料發(fā)出熒光，與目標(biāo)序列雜交時，熒光染料的熒光淬滅的淬滅探針。此外，本發(fā)明的探針優(yōu)選為從5’或3’末端起數(shù)第I 3位的堿基用熒光染料標(biāo)記。更優(yōu)選為，3’末端用熒光染料標(biāo)記。此外，本說明書中稱為“從5’末端起數(shù)第I 3位”的情況，為以5’末端為第I位開始計數(shù)，“從3’末端起數(shù)第I 3位”的情況，為以3’末端為第I位開始計數(shù)。此外，本發(fā)明探針中被熒光染料標(biāo)記的堿基，P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’中為序列編號2的第145位的堿基，P1、P1’中為序列編號I所示的第135位堿基，在P2、P2’中為如序列編號I的第182位堿基。使用本發(fā)明的寡核苷酸能夠檢測的NPMl基因exonl2的突變，例如記載在表I中。倉泛夠檢測由 typeA、typeB、typeD、typeC、typeE、typeGm、typeKm、typeNm、typeOm、typeQm、type3>type4>type6>type7>typel3>typelO、typeG+、typeH+、typel+、typej+、和 typel 組成的組中的選擇的至少一種以上的突變。表I■ZPM1 琳lasexonl2s 凇>#。齡賊
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在表I中的堿基序列中，例如突變型A的④的部分插入了“tctg”。另外，突變TypeE的⑨的部分插入了 “ctcttgccc”,⑩的“ggagg”缺失。實施例中研究了檢測的突變所在的行中記載了 ☆號。在使用(P5)、(P5’)、(P6)、(P6’)、(P7)、(P7’)寡核苷酸的情況下，能夠檢測出typeA、typeB、typeD、typeC、typeGm、typeKm、typeNm、typeOm、typeQm、type3、type4、type13、typeG+、typeH+、typel+、typej+ 和 typel 等。使用序列編號I所示的堿基序列中位于第153-156位堿基的區(qū)域的5’端的序列的探針、使用例如(PD、(Pr )寡核苷酸時，能夠檢測出typeA、typeB、typeD以及type7等。使用序列編號I所示的堿基序列中位于第153-156位堿基的區(qū)域的3’端的序列的探針，例如使用(P2)、(P2，)寡核苷酸時，能夠檢測出typelO、typeE以及type6等。此外，通過使用本發(fā)明的(P5)、(P5，)、(P6)、(P6，)、(P7)、(P7，)中任何一種寡 核苷酸、或者(Pl)或(Pr )和(P2)或(P2’ )寡核苷酸，能夠檢測NPMl基因ex0nl2有無突變，使得能夠診斷急性髓系白血病的易患性、病理狀態(tài)和/或預(yù)后。通過使用本發(fā)明實施例所示的序列編號56、57、58、4、5的探針，能夠檢測NPMl基因exonl2的突變。序列編號56 58、4所示的探針中，3’末端用熒光染料標(biāo)記；序列編號5所示的探針,5’末端用突光染料標(biāo)記。本發(fā)明的檢測方法的特征在于使用上文所述的本發(fā)明的探針。即本發(fā)明的檢測方法可以使用一個以上的、含有序列編號2所不的堿基序列中的編號157 160的堿基的區(qū)域(對應(yīng)于序列編號I的編號153 156的堿基)的探針，也可以使用一個以上的上述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’的探針。另外，本發(fā)明的檢測方法，可以使用序列編號I所示的堿基序列中、以第153-156位堿基的區(qū)域為末端的一個以上的探針；也可以使用上述P1、P1’、P2以及P2’中一個以上的探針。本發(fā)明的檢測方法例如特征在于，使用本發(fā)明的探針，并包括以下步驟。(I)向含有核酸的試樣中，添加本發(fā)明的探針，使探針與上述核酸進(jìn)行雜交的步驟；(II)改變溫度，使由上述核酸與上述探針組成的雜交體形成體解離，測定基于雜交體形成體解離的信號的變動的步驟；(III)分析上述信號的變動，檢測上述試樣中的單鏈核酸的Tm值的步驟；以及(IV)根據(jù)上述Tm值，檢測上述試樣中的單鏈核酸中，目標(biāo)多態(tài)性的有無或含有多態(tài)性的單鏈核酸的豐度比的步驟。本發(fā)明的檢測方法，除使用本發(fā)明的探針外，也可以按照常規(guī)的核酸擴(kuò)增以及熔解曲線分析(Tm分析)的方法進(jìn)行。而且，本發(fā)明的檢測方法也可以包括在進(jìn)行上述步驟(I)之前或進(jìn)行步驟(I)的同時，進(jìn)行核酸擴(kuò)增的步驟。核酸的擴(kuò)增方法優(yōu)選為使用聚合酶的方法，例如PCR、ICAN、LAMP等。在使用聚合酶的方法進(jìn)行擴(kuò)增時，優(yōu)選在本發(fā)明的探針存在下進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)所用探針來調(diào)節(jié)擴(kuò)增的反應(yīng)條件等，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是容易的。這樣在核酸擴(kuò)增后，僅對探針的Tm值進(jìn)行分析，因此反應(yīng)結(jié)束后無須處理擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣就不必?fù)?dān)心擴(kuò)增產(chǎn)物帶來的污染。而且，由于可以在與擴(kuò)增所需的儀器相同的儀器內(nèi)進(jìn)行檢測，因此無須搬運(yùn)容器。因此，容易實現(xiàn)自動化。
此外，在步驟(III)確定Tm值時，不僅包括確定Tm的溫度，而且包括確定Tm的峰高，能夠根據(jù)峰高確定具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比。此外，在更加定量地確定具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比時，優(yōu)選制成如下所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)其確定豐度比。關(guān)于定量地確定具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比的方法，下面以確定野生型和特定的突變型的豐度比為例進(jìn)行說明。但是，該方法僅為示例而已，確定具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比的方法不限于此。首先，將野生型核酸Wt和突變型核酸Mt這兩種核酸以各自不同的豐度比配制多個核酸混合物，對與多個核酸混合物的每一個，使用熔解曲線分析裝置等得到熔解曲線。圖I(A)為以某一個核酸混合物的溫度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系表示的熔解曲線；以及圖I(B)為以溫度與熒光強(qiáng)度的微分值的關(guān)系表示的熔解曲線(也稱微分熔解曲線)。通過從微分熔解曲線中檢測峰來檢測核酸Wt的熔解溫度Tmw以及核酸Mt的熔解溫度TmM，并分別設(shè)定含有Tmw和TmM的溫度范圍。對于包含Tmw的溫度范圍A Tw，例如可以設(shè)定為如下 的溫度范圍即以Tmw和TmM之間的熒光強(qiáng)度微分值為最小的溫度為下限，以與熒光強(qiáng)度的峰的底部對應(yīng)的溫度為上限的溫度范圍。此外，對于包含TmM的溫度范圍ATM，可以設(shè)定為如下的溫度范圍即，以Tmw和TmM之間的熒光強(qiáng)度微分值為最小的溫度為上限，以與熒光強(qiáng)度的峰的底部對應(yīng)的溫度為下限的溫度范圍。而且，對于溫度范圍ATw以及溫度范圍ATm可以設(shè)定為相同的幅度(例如10°C )或不同的幅度(例如，溫度范圍ATwS 10°C，溫度范圍ATm為7°C)。此外，可以將溫度范圍A Tw和溫度范圍A Tm分別設(shè)定為各自的熔解溫度Tm減X°C 加X°C的幅度內(nèi)(X可以為15°C以內(nèi)，優(yōu)選為10°C以內(nèi))。然后，分別對溫度范圍A Tw和溫度范圍A TM，計算通過與微分熔解曲線的溫度范圍的下限對應(yīng)的點(diǎn)和與上限對應(yīng)的點(diǎn)的直線與微分熔解曲線所包圍的面積(圖I(B)的斜線部分)。作為面積計算方法的一個示例，具體按照下述方法進(jìn)行計算。以溫度T處的熒光強(qiáng)度微分值為f (T)，溫度T處的基礎(chǔ)值為B(T)，按照下述式(I)進(jìn)行計算。面積S = {f (Ts+1)-B (Ts+1)} + {f(Ts+2))-B (Ts+2)}+... +R(IV1)-B OV1M …(I)其中，Ts為各溫度范圍的下限值，Te為上限值。各溫度T對應(yīng)的基礎(chǔ)值B(T)是按照下述式(2)計算的值，其表示熒光強(qiáng)度檢測信號中包含的背景水平。從熒光強(qiáng)度微分值減去該基礎(chǔ)值，就去除了熒光強(qiáng)度檢測信號中包含的背景的影響。B(T) = aX (T_TS)+f (Ts)... (2)其中，a= {f (Te) -f (Ts)} / (Te-Ts)根據(jù)上述式(I)、式(2)可以求出各核酸混合物中，溫度范圍ATw中的面積SwW及ATm中的面積SM，做出表明面積比與各核酸混合物的豐度比關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為標(biāo)準(zhǔn)曲線的一個示例，其中橫軸為豐度比(核酸Mt相對于核酸混合物的總量的比例)，縱軸為面積比(sM/sw)。此外，面積比也可以設(shè)定為SW/SM。根據(jù)使用實際試樣獲得的熔解曲線和微分熔解曲線計算出面積比，可以基于上述的方法預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來確定實測試樣中含有的具有多態(tài)性的堿基序列的豐度比。本發(fā)明中，試樣中的DNA可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA。上述DNA為雙鏈DNA時，例如優(yōu)選為，包括在進(jìn)行雜交步驟之前，通過加熱，使上述試樣中的雙鏈DNA解離的步驟。通過將雙鏈DNA解離為單鏈DNA，在接下來的雜交步驟中，能與檢測用探針發(fā)生雜交。本發(fā)明中，本發(fā)明的探針相對于上述試樣DNA的添加比例(摩爾比)，無特別限制，但是為充分確保檢測信號，優(yōu)選為相對于上述試樣DNA為I倍以下，更優(yōu)選為0. I倍以下。此時，試樣中的DNA，例如可以為，產(chǎn)生了檢測目標(biāo)多態(tài)性的檢測對象DNA和未產(chǎn)生上述多態(tài)性的非檢測對象DNA的合計，也可以為含有產(chǎn)生了檢測目標(biāo)多態(tài)性的檢測對象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和含有未產(chǎn)生上述多態(tài)性的非檢測對象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的組合。此外，試樣DNA中上述檢測對象DNA的比例，一般是未知的。但是，結(jié)果表明，上述探針添加比例(摩爾比)，相對于檢測對象DNA(含有檢測對象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物)，可以為10倍以下，5倍以下，或3倍以下。此外，對于其下限無特別限制，例如可以為0.001倍以上，0.01倍以上，或0. I倍以上。本發(fā)明的探針相對于上述DNA的添加比例，可以為相對于雙鏈DNA的摩爾比，也可以為相對于單鏈DNA的摩爾比。對Tm值進(jìn)行說明。對含有雙鏈DNA的溶液進(jìn)行加熱時，260nm處的吸光度會升高。這是由于，加熱使雙鏈DNA兩鏈之間的氫鍵發(fā)生斷裂，解離為單鏈DNA(DNA的熔解)的緣故。根據(jù)這一現(xiàn)象，熔解溫度Tm值一般定義為吸光度達(dá)到最大值吸光度50%時的溫度。 在本發(fā)明中，所述P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、PI、PI’、P2、P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸與具有互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交時的Tm值和與非互補(bǔ)的DNA雜交時的Tm值之差，例如可以為5°C以上。通過所述Tm值之差為5°C以上，能夠以更高的靈敏度檢測上述突變。另外，所述Tm值之差可以為5°C以上、或7°C以上等。增大所述Tm值之差的方法有使探針序列中含有與其雜交的堿基序列錯配的堿基的方法、以及例如NatureBiotech(1997) vol 15p. 331-335中記載的方法等。本發(fā)明中，用于確定Tm值的、對伴隨溫度變化信號的信號變動的測定，可以基于如前面所述的原理測定260nm的吸光度來進(jìn)行，但是優(yōu)選測定如下信號所述信號為以向本發(fā)明的探針上添加的標(biāo)記的信號為基礎(chǔ)、并根據(jù)DNA與探針的雜交體形成的狀態(tài)而變動的信號。因此，本發(fā)明所用的探針優(yōu)選使用上述的標(biāo)記化探針。上述標(biāo)記化探針例如可以為與目標(biāo)序列未發(fā)生雜交時發(fā)出熒光，并且與目標(biāo)序列發(fā)生雜交時，熒光強(qiáng)度減少(淬滅)的熒光標(biāo)記寡核苷酸；或與目標(biāo)序列未發(fā)生雜交時發(fā)出熒光，并且與目標(biāo)序列發(fā)生雜交時，熒光強(qiáng)度增加的熒光標(biāo)記寡核苷酸。若是前者所述探針，則與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時，不顯示信號或信號弱，而通過加熱探針游離時即顯示信號，或信號增加。若是后者所述探針，則與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時，顯示信號，而通過加熱探針游離時即出現(xiàn)檢測信號減少(消失)。因此，通過在信號特有的條件(吸光度等)下檢測出基于這種標(biāo)記的信號變化，能夠與前述進(jìn)行260nm的吸光度測定一樣，確定熔解的發(fā)生和確定Tm值。標(biāo)記化探針的標(biāo)記物質(zhì)，可以為如前所述，但優(yōu)選為熒光染料標(biāo)記探針。作為核酸擴(kuò)增時作為模板的核酸，含有核酸即可，無特別限制，其可以為，血液、口腔粘膜混懸液、指甲或毛發(fā)等體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、乳汁、腹水液、石蠟包埋的組織、胃液、胃洗液、腹膜液、羊水、細(xì)胞培養(yǎng)等任意生物來源或或可由生物來源的材料。作為模板的核酸，可以從該來源獲得后直接使用，或為對該試樣特性進(jìn)行改變而在預(yù)處理后使用。下面對于以進(jìn)行PCR的情況為例進(jìn)一步進(jìn)行說明。PCR所用的引物對除了擴(kuò)增本發(fā)明探針能夠雜交的區(qū)域以外，還可以與常規(guī)的PCR引物對的設(shè)計方法同樣地對引物對進(jìn)行設(shè)定。引物的長度以及Tm值一般為12mer 40mer、40 70°C,或16mer 30mer、55 60°C。引物對中各引物的長度可以不相同，但是，優(yōu)選為，兩個引物的Tm值基本相同(一般的相差在2°C內(nèi))。而且,Tm值可以為通過最鄰近堿基對法(Nearest Neighbor)計算得出的值。作為引物對的一個示例，可以為由含有序列編號16、17所示的堿基序列的引物組成。PCR優(yōu)選為在本發(fā)明所用的探針的存在下進(jìn)行。這樣，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，無須精制擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行Tm分析。根據(jù)所用的探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易對引物的Tm值、PCR的反應(yīng)條件做出調(diào)整。根據(jù)Tm值分析的結(jié)果對NPMl基因exonl2突變的檢測可以根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行，本發(fā)明中的檢測包括突變有無的檢測和含有多態(tài)性的核酸的豐度比的確定。而且，通過本發(fā)明的探針以及多態(tài)性檢測方法，能夠檢測出NPMl基因的eXonl2突變，并能夠根據(jù)檢測出的突變的有無，診斷急性髓系白血病的患病容易性、病理狀態(tài)和/或預(yù)后。 〈2>本發(fā)明試劑盒本發(fā)明試劑盒為用于本發(fā)明的檢測方法的試劑盒。該試劑盒的特征在于含有本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針。而且，本發(fā)明的試劑盒也可以用于診斷急性髓系白血病的患病容易性、病理狀態(tài)和/或預(yù)后。至于探針，關(guān)于本發(fā)明的探針，如上所述。本發(fā)明的檢測試劑盒，除包含探針外，還可以包含本發(fā)明檢測方法中進(jìn)行核酸擴(kuò)增所必需的試劑，特別是，用于使用DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增的上述引物。本發(fā)明檢測試劑盒中的探針、引物以及其他試劑，可以分別進(jìn)行收納，也可以這些物質(zhì)的一部分制成混合物。在本發(fā)明中，作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測用探針或引物的各個序列，以它們相互互補(bǔ)的關(guān)系為基礎(chǔ)的記載事項，只要不特別指出，可以適用于每一序列以及與各個序列互補(bǔ)的序列。在將本發(fā)明的事項適用于相對于各序列互補(bǔ)的該序列時，由該互補(bǔ)的序列識別的序列，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識的范圍內(nèi)，視為將說明書整體替換為與對應(yīng)的本說明書中記載的序列互補(bǔ)的序列。下面，依據(jù)實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。但是，這些實施例為本發(fā)明的示例，本發(fā)明不限于此。實施例實施例I (檢測對象為互補(bǔ)鏈寡核苷酸、使用P1、P2探針的情況)以NPMl基因exonl2的喊基序列(序列編號1(野生型))為基礎(chǔ)，如表2所不，設(shè)計出末端部含有C的探針。表2中，探針的位置表不序列編號I所不喊基序列中的喊基編號。3’末端的P意指發(fā)生磷酸化。通過TAMRA進(jìn)行標(biāo)記，按照常規(guī)方法進(jìn)行。此外，作為檢測對象使用的互補(bǔ)鏈寡核苷酸的序列如表2所示。表2中，寡核苷酸的位置表示序列編號I所示的堿基序列中的堿基編號。表權(quán)利要求
1.多態(tài)性檢測用探針，其為用于檢測NPMl基因的ex0nl2突變的探針，其特征在于，所述探針為由選自下述的P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、P1、ΡΓ、P2和P2，中的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸構(gòu)成， (P5)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50喊基長的喊基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與編號145的喊基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P5’)寡核苷酸具有與序列編號2所示的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，并且與編號145的堿基對應(yīng) 的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P6)寡核苷酸具有與序列編號2所不的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P6’)寡核苷酸具有與序列編號2所示的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號第145位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P7)寡核苷酸具有與序列編號2所示的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤，與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P7’)寡核苷酸具有與序列編號2所示的堿基序列中的、含有編號145 156的堿基的12 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第153位的堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤、與編號第154位的堿基對應(yīng)的堿基為胸腺嘧啶，與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記 (PD寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號135 150的堿基的16 50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號第135位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (ΡΓ)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號135 150的堿基的16 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號第135位的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記； (P2)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號164 182位的堿基的19 50喊基長的喊基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，與編號182的喊基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；以及 (P2’)寡核苷酸具有與序列編號I所示的堿基序列中的、含有編號164 182的堿基的19 50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求I記載的多態(tài)性檢測用探針，其中， P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸在3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號145的喊基對應(yīng)的喊基， Pl以及Pr寡核苷酸在3’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號.135的堿基對應(yīng)的堿基， P2以及P2’寡核苷酸在5’末端起數(shù)第I 3位的位置具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號.182的喊基對應(yīng)的喊基。
3.如權(quán)利要求I記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號145的堿基對應(yīng)的堿基， Pl和ΡΓ寡核苷酸在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與編號135的堿基對應(yīng)的堿基， P2和P2’寡核苷酸在5’末端具有用熒光染料標(biāo)記的、與編號182的堿基對應(yīng)的堿基。
4.如權(quán)利要求I記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，Pl和ΡΓ寡核苷酸以與編號153 156的堿基中的任意堿基對應(yīng)的堿基為5’末端，并且熒光染料標(biāo)記的與編號135的堿基對應(yīng)的喊基位于3’末端； P2和P2’寡核苷酸以與編號153 156的堿基中的任意堿基對應(yīng)堿基為3’末端，以熒光染料標(biāo)記的與編號182的堿基對應(yīng)的堿基為5’末端。
5.如權(quán)利要求I記載的多態(tài)性檢測用探針，其中， P5、P5’、P6、P6’、P7和P7’寡核苷酸以編號162的堿基為5’末端，在3’末端具有用熒光染料標(biāo)記的與編號145的堿基對應(yīng)的堿基， Pl和ΡΓ寡核苷酸以編號155的堿基為5’末端，在3’末端具有熒光染料標(biāo)記的與編號135的堿基對應(yīng)的堿基， P2和P2’寡核苷酸以編號156的堿基為3’末端，在5’末端具有熒光染料標(biāo)記的與編號182的喊基對應(yīng)的喊基。
6.如權(quán)利要求I 5中任意一項記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述的寡核苷酸未與目標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，并且與目標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少或增加。
7.如權(quán)利要求6記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述的寡核苷酸未與目標(biāo)序列雜交時發(fā)出熒光，而與目標(biāo)序列雜交時熒光強(qiáng)度減少。
8.如權(quán)利要求I 7中任意一項記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述探針為用于熔解曲線分析的探針。
9.如權(quán)利要求1 8中任意一項記載的多態(tài)性檢測用探針，其中，？5、？5’、？6、？6’、卩7和P7’寡核苷酸的堿基長為12 35 ；P1和ΡΓ寡核苷酸的堿基長為16 35 ；P2和P2’寡核苷酸的堿基長為19 35。
10.NPMl基因的exonl2的多態(tài)性的檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求I 9中任意一項記載的探針中的至少一種。
11.NPMl基因的exonl2多態(tài)性的檢測方法，其特征在于包含下述(I) (IV)步驟 (I)向含有核酸的試樣中，添加權(quán)利要求I 9中任意一項記載的探針，使探針與上述核酸進(jìn)行雜交的步驟； (II)改變溫度，使由上述核酸與上述探針組成的雜交體形成體解離，測定基于雜交體形成體解離的信號變動的步驟； (III)分析上述信號的變動，檢測出上述試樣中單鏈核酸的Tm值的步驟；以及 (IV)根據(jù)上述Tm值，檢測上述試樣中單鏈核酸中，目標(biāo)多態(tài)性的有無或含有多態(tài)性的單鏈核酸的豐度比的步驟。
12.如權(quán)利要求11記載的方法，還包括在進(jìn)行步驟(I)之前或進(jìn)行步驟(I)的同時，擴(kuò)增 DNA。
13.對急性髓系白血病的易患性，病理狀態(tài)和/或預(yù)后進(jìn)行分析的方法，包括通過權(quán)利要求10 12中任意一項記載的方法，檢測NPMl基因的exonl2的多態(tài)性的步驟；以及確定多態(tài)性的有無的步驟。
14.用于檢測NPMl基因的多態(tài)性的試劑盒，其包含權(quán)利要求I 9中任意一項記載的探針。
15.如權(quán)利要求14記載的試劑盒，還包括用于擴(kuò)增NPMl基因的序列編號I所示的堿基序列中含有與P5、P5，、P6、P6’、P7、P7’、P1、ΡΓ、P2、P2，寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物。
16.如權(quán)利要求14或15記載的試劑盒，其中，上述引物為選自下述P3和P4以及P3’和P4’的多態(tài)性檢測用引物， (P3)為以第106位堿基T為3’末端，且與序列編號I同源的10 50個堿基的寡核苷酸，和 (P4)為以第205位堿基T為3’末端，且與序列編號I的互補(bǔ)鏈具有同源性的10 50個堿基的寡核苷酸，以及 (P3’)為以第106位堿基T為3’末端，且具有與序列編號I的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列的10 50個堿基的寡核苷酸，和 (P4’)為以第205位堿基T為3’末端，且具有與序列編號I的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列的10 50個堿基的寡核苷酸。
全文摘要
NPM1基因的exon12突變檢測用探針，其特征在于該探針為由選自下述的P5和P5’中的至少一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)成的多態(tài)性檢測用探針。(P5)寡核苷酸具有與序列編號2所示的堿基序列中的、含有編號145～156的堿基的12～50堿基長的堿基序列互補(bǔ)的序列或者與其同源的序列，并且與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記；以及(P5’)寡核苷酸具有與序列編號2所示的堿基序列中的、含有編號145～156的堿基的12～50堿基長的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列，并且與編號145的堿基對應(yīng)的堿基為胞嘧啶并用熒光染料標(biāo)記。
文檔編號G01N21/64GK102758007SQ20121013686
公開日2012年10月31日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者細(xì)見敏也 申請人:愛科來株式會社