專利名稱：在花瓣中發(fā)揮功能的來(lái)自紫蘇的啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型啟動(dòng)子。更加詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明涉及來(lái)自紫蘇的花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶(3AT)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域及其利用。
背景技術(shù)：
通過(guò)利用基因重組技術(shù)，使有用的基因在目的植物中表達(dá)，可將新的性狀賦予該植物。如此制作的基因重組植物已被大范圍商業(yè)化栽培?；虮磉_(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄階段進(jìn)行控制，所以轉(zhuǎn)錄調(diào)控在調(diào)控基因表達(dá)上最為重要。即為制作產(chǎn)業(yè)上有用的基因重組植物，在適當(dāng)時(shí)期、用適當(dāng)組織、以適當(dāng)強(qiáng)度轉(zhuǎn)錄目的基因非常重要。轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始在很多情況下通過(guò)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的5’側(cè)的DNA序列來(lái)控制，其終止通過(guò)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的3’側(cè)的DNA 序列來(lái)控制。將確定基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，直接調(diào)控其頻率的DNA上的區(qū)域稱為啟動(dòng)子，將確定轉(zhuǎn)錄終止的區(qū)域成為終止子。啟動(dòng)子有時(shí)存在于起始密碼子的5’側(cè)數(shù)十bp處，多含有TATA盒等的序列。其還在5’側(cè)具有結(jié)合各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的順式作用元件，這些順式作用元件的存在控制著轉(zhuǎn)錄的時(shí)期、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的組織、轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子根據(jù)其氨基酸序列的不同分為很多家族。例如，Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、bHLH(堿性/螺旋-環(huán)-螺旋 (basic helix loop helix))型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等是有名的家族。實(shí)際上，很多情況下，轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域與啟動(dòng)子在同樣意義上使用，沒(méi)有嚴(yán)格區(qū)別。作為花的顏色的主要成分的花色素苷為總稱為類黃酮的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一?；ㄉ剀盏念伾蕾囉谄浣Y(jié)構(gòu)。即作為花色素苷的發(fā)色團(tuán)的花色素B環(huán)的羥基數(shù)增加時(shí)顏色變藍(lán)。且還已知修飾花色素苷的芳香族?；?香豆酰基、咖啡酰基等)的數(shù)量增加時(shí)，花色素苷的顏色變藍(lán)(即最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng))，花色素苷的穩(wěn)定性增加(以下參照非專利文獻(xiàn)1)。與花色素苷的生物合成有關(guān)的酶及編碼該酶的基因被廣泛研究(參照相同非專利文獻(xiàn)1)。例如，催化向花色素苷轉(zhuǎn)移芳香族?；姆磻?yīng)的酶基因可從龍膽、薰衣草、矮牽牛等中獲得(以下參照專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2)。與紅紫蘇葉中積累的花色素苷(丙二?；咸K寧、3-0- (6-0- (E) -ρ-香豆?；?β -D-吡喃葡萄糖基)-5-0- (6-0-丙二酰基-β -D-glucopyranosyl)-花青素(3-0- (6-0- (E) -p-coumaroyl- β -D-glucopyranosyl) -5-0-(6-0-malonyl- β -D-glucopyranos yl)-cyanidin))(以下參照非專利文獻(xiàn) 2)的合成有關(guān)的酶基因以羥基肉桂酰輔酶A 花色素苷3葡萄糖苷-芳香族?；D(zhuǎn)移酶(3AT)的基因{以下簡(jiǎn)稱“紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶(3AT)基因”。}為代表已有一部分基因被報(bào)道(參照相同專利文獻(xiàn)1)。而且也獲得了關(guān)于花色素苷的生物合成酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的知識(shí)和見(jiàn)解。這些基因的位于起始密碼子5’側(cè)的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域中，具有Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、 bHLH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的順式作用元件序列。還已知Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和bHLH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制矮牽牛、玉米、紫蘇等的花色素苷的合成(參照相同非專利文獻(xiàn)1)。在植物中負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(以下稱轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域)中，有無(wú)論在何種組織或發(fā)育階段的何種時(shí)期均發(fā)揮功能的所謂組成型啟動(dòng)子、和僅在特定器官·組織中發(fā)揮功
3能的器官·組織特異性啟動(dòng)子、及僅在發(fā)育階段的特定時(shí)期表達(dá)的時(shí)期特異性啟動(dòng)子。作為用于使有用基因在基因重組植物中表達(dá)的啟動(dòng)子，常用的是組成型啟動(dòng)子。作為代表性的組成型啟動(dòng)子，有花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的啟動(dòng)子(以下參照非專利文獻(xiàn)3)、Macl啟動(dòng)子(以下參照非專利文獻(xiàn)4)等。但是，在植物中，很多基因均為組織 器官特異性或時(shí)期特異性表達(dá)。這說(shuō)明使基因進(jìn)行組織·器官特異性或時(shí)期特異性表達(dá)對(duì)植物來(lái)說(shuō)是必需的。有利用此種組織 器官特異性或時(shí)期特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行植物的基因重組的例子。例如，有使用種子特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域使蛋白質(zhì)在種中積累的例子。但是，植物雖可開(kāi)出多種顏色的花，但由于種所具有的遺傳性限制，所以能開(kāi)出所有顏色的花的種很少。例如，在月季、康乃馨等中，自然界中不存在能開(kāi)藍(lán)色、紫色花的品種。原因是月季、康乃馨不具有用于合成許多開(kāi)藍(lán)色、紫色花的種所合成的稱為花翠素的花色素時(shí)所必需的類黃酮3’，5’-羥化酶基因(以下也簡(jiǎn)稱為F3’5’H)基因。通過(guò)在這些種中導(dǎo)入作為開(kāi)藍(lán)色、紫色花的種的矮牽牛、三色堇等的F3’ 5’ H基因，可使這些種的花色變藍(lán)。此時(shí)，為使來(lái)自不同種的F3’ 5’ H基因轉(zhuǎn)錄，使用來(lái)自金魚(yú)草或矮牽牛的查耳酮合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。例如，作為包含來(lái)自金魚(yú)草或矮牽牛的查耳酮合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的質(zhì)粒，可例舉以下專利文獻(xiàn)3中記載的質(zhì)粒pCGP485、pCGP653，作為包含組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的質(zhì)粒，可例舉質(zhì)粒pCGP628(包含Macl啟動(dòng)子)、以下專利文獻(xiàn)4中記載的質(zhì)粒pSPB130 (包含附加有增強(qiáng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)。但是，很難預(yù)測(cè)這樣的啟動(dòng)子在重組植物中可在何種程度上發(fā)揮強(qiáng)功能，是否可帶來(lái)目的表達(dá)型。且在導(dǎo)入與宿主植物相同或類似的堿基序列或?qū)牖蛟谌旧w上被多復(fù)制或被反復(fù)插入時(shí)，有時(shí)會(huì)引起基因的沉默(以下參照非專利文獻(xiàn)幻。因此，為使復(fù)數(shù)的外源基因表達(dá)而反復(fù)使用相同啟動(dòng)子有時(shí)會(huì)引起基因的沉默，所以應(yīng)避免。綜上所述，雖然一部分啟動(dòng)子被用于改變花的顏色，但仍然進(jìn)一步需要用于改變其他花的顏色而與宿主植物和目的相符合的有用的啟動(dòng)子?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 WO 96/25500公報(bào)專利文獻(xiàn)2 WO 01/72984公報(bào)專利文獻(xiàn)3 WO 94/28140公報(bào)專利文獻(xiàn)4 WO 05/17147公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 Plant J. 54，737-749，2008非專利文獻(xiàn) 2 Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800,1989非專利文獻(xiàn)3 Plant Cell Physiology 1996，37，49-59非專利文獻(xiàn)4 Plant Molecular Biology 1990，15，373-381非專利文獻(xiàn)5 Annals of Botany 1997，79，3-1
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明欲解決的課題在于提供用于改變植物花色的有用的新型啟動(dòng)子。
為使外源基因在重組植物中、優(yōu)選在特定的器官、組織中、更優(yōu)選在積累花色素苷的器官、花瓣中表達(dá)時(shí)，期望選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，終止子。本發(fā)明欲解決的課題還在于得到此種序列。本申請(qǐng)發(fā)明人為解決上述課題銳意研究，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果作為用于改變植物花色的有用的新型啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)了來(lái)自紫蘇的花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶(3AT)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，并確認(rèn)了其有用性，從而完成了本申請(qǐng)發(fā)明。即本發(fā)明如下。[1] 一種核酸，其特征在于，選自以下(1) ⑷中的核酸(1)核酸，其含有序列號(hào)1所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且含有通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1所示的堿基序列進(jìn)行修飾的堿基序列，(3)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)1中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，及(4)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。[2] 一種表達(dá)載體或表達(dá)盒，其特征在于，包含所述[1]中所述的核酸。[3]根據(jù)所述[2]中所述的表達(dá)載體或表達(dá)盒，其特征在于，包含序列號(hào)2中所示的堿基序列。[4] 一種除菊花以外的非人類宿主，其特征在于，通過(guò)所述[2]或[3]中所述的表達(dá)載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化。[5] 一種除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，導(dǎo)入了所述[1]中所述的核酸。[6]根據(jù)所述[5]中所述的除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，其為切花。[7] 一種切花加工品，其特征在于，使用所述[6]中所述的切花。已知認(rèn)為在紅紫蘇的葉中控制酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域、即紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域可在作為不同種的矮牽牛和月季的花瓣中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能。因此，利用紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，可在花等花色素苷積累的組織內(nèi)特異性地啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。作為進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的外源基因，有與花色、香味有關(guān)的基因，但不限于這些。


圖1表示pSFL205的示意圖。圖2表示紫蘇3AT基因?qū)胗秒p元載體pSPB3311的示意圖。
具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，例如可例舉由序列號(hào)1所示的堿基序列組成的核酸。但是，由序列號(hào)1所示的堿基序列組成的核酸中數(shù)個(gè)(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)) 堿基發(fā)生附加、缺失及/或取代而進(jìn)行修飾的堿基序列所組成的啟動(dòng)子，認(rèn)為其也維持與原有啟動(dòng)子同樣的活性。本發(fā)明還涉及如下核酸，只要在花瓣中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，也可為由通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1中所示的堿基序列進(jìn)行修飾的堿基序列組成的核酸。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及如下核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與序列號(hào)1所示的堿基序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，或可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。作為這些核酸，可例舉為可與含有序列號(hào)1中所示的堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、由與序列號(hào)ι中所示的堿基序列優(yōu)選有約70%以上、更優(yōu)選有約80%、81%、 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、最優(yōu)選有約99%的堿基序列同一性的堿基序列所組成的核酸。在此，嚴(yán)謹(jǐn)條件是指由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定的雜交條件，通常依賴探針長(zhǎng)度、洗滌溫度及鹽濃度并可憑經(jīng)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。通常，探針越長(zhǎng)，用于適合退火的溫度越高，探針越短退火溫度越低。雜交通常依賴于互補(bǔ)鏈存在于接近但低于其熔點(diǎn)的環(huán)境中時(shí)變性DNA 的再退火能力。具體地說(shuō)，例如作為低嚴(yán)謹(jǐn)條件，可例舉在雜交后的篩選的洗滌階段中，在 37°C 42°C的溫度條件下，在5XSSC、0. 1% SDS溶液中洗滌等。此外，作為高嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如可例舉在洗滌階段，在65°C、0. IX SSC及0. SDS中洗滌等。通過(guò)將嚴(yán)謹(jǐn)條件提高到更高，可得到同源性高的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的表達(dá)載體或表達(dá)盒及由該表達(dá)載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的非人類宿主。本說(shuō)明書(shū)中，“表達(dá)盒”指在任意核酸上連接啟動(dòng)子和終止子的DNA片段。進(jìn)而，本發(fā)明涉及將紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與有用的外源基因連接，導(dǎo)入該基因而得到的具有改變顏色等有用性狀的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，特別是花瓣、切花。作為可轉(zhuǎn)化的植物的例子，可例舉月季、菊花、康乃馨、金魚(yú)草、仙客來(lái)、蘭花、洋桔梗、小蒼蘭、非洲菊、唐菖蒲、霞草、長(zhǎng)壽花、百合、天竺葵、老鸛草、矮牽牛、藍(lán)豬耳、郁金香、稻子、大麥、小麥、菜籽、馬鈴薯、西紅柿、白楊、香蕉、藍(lán)桉、番薯、黃豆、苜蓿、羽扇豆、玉米等，但不限于這些。本發(fā)明涉及使用上述切花的加工品(切花加工品)。在此，作為切花加工品，包括使用該切花的押花、保鮮花、干花、樹(shù)脂密封品等，但不限于這些。本說(shuō)明書(shū)中，用語(yǔ)“菊花植物(也簡(jiǎn)稱為“菊花”)”指菊科(Asteraceae)菊屬 (Chrysanthemum)的植物,作為代表種可例舉菊花(Chrysanthemum mori folium)。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例，具體說(shuō)明本發(fā)明。在無(wú)特殊要求的情況下，分子生物學(xué)的方法按照Molecular Cloning (Sam brook and Russell, 2001)進(jìn)行。^mm ι : ^ - 3- tmwumykM^m^M.
已知紫蘇中有葉中積累花色素苷的紅色變種和不積累花色素苷的綠色變種。從前者的葉中，將其染色體DNA用所報(bào)道的方法(參照Plant Mol Biol. December 1997 ；35 (6) 915-27)進(jìn)行制備。將該染色體DNA用Sau3AI(TOY0B 0公司制)進(jìn)行部分酶切，通過(guò)蔗糖密度梯度法回收含有10 151Λ的DNA片段的組分。通過(guò)將該片段使用公知的方法插入作為λ噬菌體載體的一種的EMBL3 (Promega公司制)的BamHI位點(diǎn)，制作染色體DNA文庫(kù)。 將所得到的文庫(kù)以來(lái)自紫蘇的作為花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的cDNA的pSAT208 (參照Plant Cell P hysiol. April 2000 ；41 (4) :495-502)為探針使用來(lái)進(jìn)行篩選。文庫(kù)的篩選根據(jù)已報(bào)道的方法(參照Plant Cell Physiol. July 1996 ；37 (5) :711-6)進(jìn)行。將探針和雜交了的噬菌斑純化后進(jìn)行培養(yǎng)，從所得到的噬菌體中制備DNA。實(shí)施例2 紫蘇花餼素苷3-?；D(zhuǎn)移酶染餼體基因的堿基序列確定用)(bal酶切上述得到的DNAlO μ g，用0.7%瓊脂糖凝膠分離后，在High B ond N(Amersham公司制)上轉(zhuǎn)膜。將該膜用如上所述相同的方法雜交時(shí)，可知有約6. Skb的 DNA片段與探針雜交。用^CbaI酶切該DNA 20yg，用0.7%瓊脂糖凝膠分離后，將約6.81Λ 的DNA片段用Gene Clean進(jìn)行精制，與用)(bal酶切的pBluescriptSKII-連接。將所得到的質(zhì)粒作為PSPB513。將該質(zhì)粒中所含有的來(lái)自紫蘇的DNA序列通過(guò)引物步查法確定。其堿基序列如序列號(hào)4中所示。該序列中有與作為花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶cDNA的pSAT208 顯示高同源性的區(qū)域，該區(qū)域編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號(hào)6)與PSAT208的編碼氨基酸序列相比，發(fā)現(xiàn)有19個(gè)氨基酸殘基的取代和2個(gè)氨基酸的缺失，未觀察到內(nèi)含子。另外，包含與上述PSAT208顯示高同源性的區(qū)域的序列，包含在認(rèn)為是其起始密碼子ATG上游的3438bp的序列和在認(rèn)為是其終止密碼子TAA下游的2052bp的序列。在上述3438bp的序列中，存在不是花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的其他開(kāi)放閱讀框(0RF，序列號(hào)幻。除了該部分以外，為擴(kuò)增紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。^mm 3 :代直苷 3-以 Ing 的 pSPB513 為模板，使用 2 種引物(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’ ( 序列號(hào)7，下線部為HindIII的識(shí)別序列)、5，-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’ (序列號(hào)8， 下線部為BamHI的識(shí)別序列)進(jìn)行PCR(95°C保持1分鐘后，25個(gè)循環(huán)的52°C 1分鐘、72°C 2 分鐘、95°C 1分鐘的反應(yīng))。用Hind III和BamHI酶切所擴(kuò)增的約1. Ikb的DNA片段。用I^acI酶切專利文獻(xiàn)4中所記載的質(zhì)粒pSPB567 (在附加有增強(qiáng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的3’側(cè)連接來(lái)自三色堇的F3’ 5’ H基因，進(jìn)而在其3’側(cè)連接胭脂堿合成酶的終止子)，將包含來(lái)自三色堇的F3’ 5’ H基因的DNA片段克隆到pBin+(參照Transgenic Research 4，288-290，1995)的I^acI位點(diǎn)。將在所得到的質(zhì)粒中附加有增強(qiáng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子在pBin+的AscI位點(diǎn)附近存在時(shí)的質(zhì)粒作為pSPB575。用HindIII和 BamHI酶切該質(zhì)粒，向其中插入用HindIII和BamHI酶切包含所述紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的約1. Ikb DNA片段后的DNA片段。將所得到的質(zhì)粒作為pSFL205 (參照?qǐng)D1)。用HindIII和Mel酶切pSFL205，回收約IOObp的DNA片段。將該DNA片段、與用 SacI和XbaI酶切pSPB513而得到的約4kb的DNA片段、和用HindIII和XbaI酶切的質(zhì)粒 PBin+連接，得到質(zhì)粒pSPB3311 (參照?qǐng)D2)。該質(zhì)粒pSPB3311成為包含序列號(hào)2中所示的堿基序列的雙元載體，包含紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域和該基因的翻譯區(qū)域及其3’側(cè)的非翻譯區(qū)域。實(shí)施例4 紫蘇花餼素苷3-?；D(zhuǎn)移酶染餼體基因在矮牽牛中的表汰將實(shí)施例3中得到的質(zhì)粒pSPB3311 (雙元載體)用使用葉盤法的土壤桿菌法轉(zhuǎn)化到矮牽牛品種Baccara Red(Sakata ked公司制)中，得到約20個(gè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化按照公知的方法(Plant J. 1994, 5,p. 81)進(jìn)行。此外，同樣用專利文獻(xiàn)1中所記載pBELAll (用于使薰衣草花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因在植物中表達(dá)的雙元載體，在反復(fù)使用增強(qiáng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和來(lái)自胭脂堿合成酶的終止子之間插入薰衣草的花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶cDNA)轉(zhuǎn)化矮牽牛品種Baccara Red(Sakata ked)，得到約20個(gè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化個(gè)體。使用包含上述2種雙元載體(pSPB3311或pBELAll)的土壤桿菌轉(zhuǎn)化的矮牽牛的花色與轉(zhuǎn)化前的Baccara Red相比，呈相對(duì)較淺的紅色。將各個(gè)代表性的重組矮牽牛分別作為Ρ ^66-7，Ρ ^67-1。將這些矮牽?；ò曛械幕ㄉ剀沼脤＠墨I(xiàn)4中所記載的方法進(jìn)行分析。在重組矮牽牛的花瓣中，與宿主相比高效液相色譜法中保留時(shí)間長(zhǎng)的花色素苷量增加，這些吸收光譜在310nm附近觀察到有肩峰。這說(shuō)明，認(rèn)為在重組矮牽牛中與芳香族?；Y(jié)合的花色素苷量增加，導(dǎo)入的紫蘇或薰衣草的花色素苷3?；D(zhuǎn)移酶基因在矮牽牛發(fā)揮了功能。進(jìn)而通過(guò)LC-FT-ICR-MS 的方法(J. Japan. Soc. Hort. Sci. 77 :94-102 (2008)， Plant J. 54 =949-962)分析宿主和重組矮牽牛的花色素苷。使用該方法時(shí)，可測(cè)定花色素苷的精密質(zhì)譜，可通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析得到MS/MS光譜。在Ρ ^66-7、Ρ ^67-1中，檢測(cè)出了顯示宿主中不存在的與花青素(香豆酰)葡萄糖苷〔m/z 595. 143717, MS/MS 287〕、花翠素(香豆酰)葡萄糖苷〔m/z 611. 139648，MS/MS 303. 1〕、甲基花青素(香豆酰)葡萄糖苷〔m/z 609. 161119，MS/MS 303. 1〕一致的分子量和MS/MS光譜的花色素苷(〔〕中表示m/z和MS/ MS 的 m/z)。已知由于與花色素苷合成有關(guān)的酶基因隨矮牽牛花瓣的發(fā)育階段不同，其轉(zhuǎn)錄量也發(fā)生變化。例如，將矮牽?；ò甑纳A段分為5個(gè)階段，在分析各階段花瓣中的類黃酮 3’ 5’ -羥化酶基因表達(dá)量時(shí)，該基因在矮牽?；ò觊_(kāi)始開(kāi)花階段到開(kāi)花不久的階段內(nèi)強(qiáng)表達(dá)，在成熟花瓣中表達(dá)量減少(參照PCT/AU92/00334)。另一方面，組成型啟動(dòng)子所控制的基因在花瓣的任一發(fā)育階段，均具有一定的表達(dá)量。將導(dǎo)入了 pSPB3311的矮牽牛的花瓣同樣分為5個(gè)階段，在分析紫蘇的花色素苷3 ?；D(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)時(shí)，該基因在花瓣開(kāi)始開(kāi)花階段到開(kāi)花不久的階段內(nèi)強(qiáng)表達(dá)，在成熟花瓣中表達(dá)量減少。另外，導(dǎo)入了 pBELAll的矮牽牛在任一生育階段均顯示一定的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量。從以上結(jié)果可知，來(lái)自紫蘇的花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域可在與紫蘇不同種的矮牽牛中轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因，且顯示出其轉(zhuǎn)錄與花色素苷生物合成酶的基因同時(shí)進(jìn)行，證實(shí)為使花色發(fā)生變化，此種轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域很有用。換句話說(shuō)，在本實(shí)施例中，表明來(lái)自紫蘇的花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶染色體基因的啟動(dòng)子區(qū)域和終止子區(qū)域在花瓣或花色素苷積累的器官中、在用于改變花色素苷的結(jié)構(gòu)即用于改變花色上，在必需水平上發(fā)揮了功能， 說(shuō)明其在用于人為表達(dá)異種基因時(shí)有用。^mm 5 :代直苷 3- m^ummmm^M^.nm^^.將如圖1所示的PSFL205導(dǎo)入月季品種Lavande中，得到27個(gè)系統(tǒng)的重組月季植物體。有關(guān)月季的轉(zhuǎn)化，已報(bào)道了許多方法(例如，參照Firoozababy et al. Bio/ Technology 12 :883-888(1994)，美國(guó)專利第 M80789 號(hào)，美國(guó)專利第 57擬927 號(hào)， EP536327A1號(hào)公報(bào)，美國(guó)專利公開(kāi)第20010007157A1號(hào)公報(bào))，可根據(jù)這些方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。胃 # iikAgrobacterium tumefaciens AglO ^ (Lazo et al. Bio/Te chnology 9 :963-967,1991)的菌液中，將由無(wú)菌苗的葉誘導(dǎo)的月季的愈傷組織浸漬5分鐘，用滅菌濾紙拭去多余菌液后，移植到繼代培養(yǎng)基中，在暗處共培養(yǎng)2天。而后，用加入羧芐青霉素400mg/l的MS液體培養(yǎng)基洗滌，移植到在繼代培養(yǎng)基中加入卡那霉素50mg/l和羧芐青霉素200mg/l的篩選·除菌用培養(yǎng)基中。反復(fù)移植和培養(yǎng)在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育未受抑制、正常增殖的部分，篩選卡那霉素抗性愈傷組織。將顯示卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化愈傷組織在添加有卡那霉素50mg/l、羧芐青霉素 200mg/l的再分化用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到卡那霉素抗性不定芽。所得到的不定芽在1/2MS培養(yǎng)基中發(fā)根后進(jìn)行馴化。馴化個(gè)體上盆后，在閉鏈系溫室中栽培開(kāi)花。月季花瓣中所含有的花色素量如下測(cè)定。將冷凍干燥花瓣0. 5g在含有細(xì)10. 1% TFA的50%乙腈(CH3CN)中、在超聲波下提取20分鐘，用0. 45 μ m的過(guò)濾器過(guò)濾。將上述濾液0. 2ml在玻璃試管減壓干固，溶解于0. 2ml的6N鹽酸(HCl)中，100°C下水解20分鐘。 分解后的花色素用O.aiil 1-戊醇提取，有機(jī)層用HPLC通過(guò)以下條件分析。色譜柱使用 0DS-A312(6mm<j5xl5cm，YMC 株式會(huì)社)，流動(dòng)相使用 AcOH MeOH H2O = 15 20 65 的溶液，以流速lml/min洗脫。檢測(cè)使用光電二極管陣列檢測(cè)器SPD_M10A(島津制作所)測(cè)定600-400nm的光譜，用最大吸收波長(zhǎng)(Xmax)及保留時(shí)間(R. T.)鑒定，用520nm吸光度的面積定量。在該HPLC條件下，花翠素及花青素的R.T.及λ max分別為4. O分鐘和5. 2 分鐘及534nm和525nm。鑒定和定量使用從funakoshi株式會(huì)社購(gòu)入的花翠素鹽酸鹽及花青素鹽酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品。重組月季花瓣中所含有的花翠素的含有率(總花色素量中花翠素的比例)最高為 51%,平均為20. 5%。該結(jié)果表明紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與可在與紫蘇不同種的植物中轉(zhuǎn)錄目的基因。已知認(rèn)為在紅紫蘇的葉中控制酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域、即紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域可在作為不同種的矮牽牛和月季的花瓣中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能。因此，利用紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，可在花等花色素苷積累的組織內(nèi)特異性地啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。作為進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的外源基因，有與花色、香味有關(guān)的基因，但不限于這些。
權(quán)利要求
1.一種核酸，其特征在于，選自以下(1) 中的核酸(1)核酸，其含有序列號(hào)1所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且含有通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1所示的堿基序列進(jìn)行修飾的堿基序列，(3)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)1中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，及(4)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。
2.一種表達(dá)載體或表達(dá)盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1中所述的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的表達(dá)載體或表達(dá)盒，其特征在于，包含序列號(hào)2中所示的堿基序列。
4.一種除菊花以外的非人類宿主，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求2或3中所述的表達(dá)載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化。
5.一種除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，導(dǎo)入了權(quán)利要求1中所述的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，其為切花。
7.一種切花加工品，其特征在于，使用權(quán)利要求6中所述的切花。
全文摘要
本發(fā)明提供用于改變植物花色的有用的新型啟動(dòng)子，即選自以下(1)～(4)中的核酸(1)核酸，其含有序列號(hào)1所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1所示的堿基序列進(jìn)行修飾的堿基序列，(3)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)1中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，及(4)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90％序列同一性的核酸。
文檔編號(hào)C12N9/10GK102421896SQ201080018269
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者水谷正子, 田中良和 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社