專利名稱：麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶及其用途。更詳細(xì)而言，涉及新型麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法、該酶在食品制備 加工中的使用、產(chǎn)生該酶的微生物等。本申請主張基于 2009年7月1日提出申請的日本專利申請第2009-156569號的優(yōu)先權(quán)，通過參照而援引該專利申請的所有內(nèi)容。
背景技術(shù)：
目前，作為麥芽三糖生成淀粉酶，已知來源于蛾微桿菌(MicrcAacterium imperiale)的酶、來源于灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)的酶、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)的酶、來源于嗜鹽堿球菌(Natronococcus sp.)的酶、來源于波比斯鏈球菌(Streptococcus bovis)的酶(非專利文獻(xiàn)1)。然而，其中對糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行報(bào)道的酶僅為來源于灰色鏈霉菌的酶。而且，該酶只有在高底物濃度條件下(給予體底物和受體底物的總計(jì)為19%、40% (w/v))才催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在低底物濃度(1% (w/v))下只催化水解反應(yīng)，而不催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)2、3)。此外，由于耐熱性也低，所以未被用作食品加工用酶。另一方面，作為在產(chǎn)業(yè)上被利用的糖基轉(zhuǎn)移酶，作為例子可舉出例如在制備異麥芽低聚糖或制備黑曲霉低聚糖中使用的α-葡萄糖苷酶、在制備低聚果糖或制備半乳糖苷蔗糖中使用的呋喃果糖苷酶、在制備低聚半乳糖中使用的半乳糖苷酶、在制備帕拉金糖中使用的α-糖基轉(zhuǎn)移酶、在制備環(huán)糊精或制備偶聯(lián)糖中使用的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、在制備高度支化環(huán)糊精中使用的分支酶。其中，作為作用于包含α-1，4鍵的多糖、低聚糖而催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶可舉出α-葡萄糖苷酶、分支酶。然而，α-葡萄糖苷酶催化單糖的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，分支酶催化4糖以上的低聚糖或多糖的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而并不知曉特異性地使作為3糖類的麥芽三糖進(jìn)行糖基轉(zhuǎn)移的酶。在包含淀粉的加工食品中，淀粉的老化帶來保存性下降等而成為嚴(yán)重的問題。其原因的大部分起因于淀粉中所含直鏈淀粉分子的老化，即直鏈淀粉分子的集聚、由此引起的不溶化(非專利文獻(xiàn)4)。因此，進(jìn)行通過使淀粉低分子化而抑制老化的研究，可在一定程度上抑制老化。然而，因低分子化而產(chǎn)生失去原來淀粉具有的性質(zhì)這樣的問題。進(jìn)而，在這些方法中，分解導(dǎo)致還原力增加，從而當(dāng)與蛋白質(zhì)、氨基酸等混合加熱時，通過與這些物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)而導(dǎo)致淀粉著色，因此其用途受到限制(專利文獻(xiàn)1)。因此，在進(jìn)行不使這些淀粉低分子化地抑制老化的研究。例如，在研究作為將淀粉的α-1，4鍵進(jìn)行分解而利用轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成α-1，6鍵的酶的分支酶，但其存在耐熱性低等問題而尚未被用作食品加工用酶。專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開2001-294601號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 “淀粉科學(xué)事典”，朝倉書店，p. 279-80(2003)非專利文獻(xiàn)2 若生等，淀粉科學(xué)，25 (2)，p. 155—61 (1978)
非專利文獻(xiàn)3 =Usui 等，Carbohydr. Res. 250，57-66 (1993)非專利文獻(xiàn)4 岡田等，淀粉科學(xué)，30 (2)，p. 223-230 (1983)非專利文獻(xiàn) 5 Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72,619-629 (1963)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的糖基轉(zhuǎn)移酶及其用途，其在可用于食品加工等中的條件下催化麥芽三糖單元的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。本發(fā)明人等為了解決上述課題反復(fù)進(jìn)行了深入的研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)屬于土芽胞桿菌(Geobacillus)屬的微生物生產(chǎn)具有所需作用的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，本發(fā)明人等還成功地將該麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行分離、純化，確定其酶化學(xué)性質(zhì)，并對編碼該酶的基因 (以下稱為“本基因”)進(jìn)行克隆。此外，通過將本基因及本基因的片段導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗鞫_立麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法。本發(fā)明是基于上述成果完成的，如下所示[1] 一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其具有作用于具有α-1，4糖苷鍵的多糖類和低聚糖類而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類的活性，在使該酶對作為底物的麥芽四糖進(jìn)行作用時，在底物濃度為0.67% (w/v) 70% (w/v)的整個范圍中，麥芽七糖生成速度與麥芽三糖生成速度之比成為9 1 10 0。[2]如[1]所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶為來源于微生物的酶。[3]如[1]所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶為來源于土芽孢桿菌屬微生物的酶。[4]如[3]所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，土芽孢桿菌屬微生物為土芽孢桿菌 (Geobacillus SP.) APC9669 (保藏號 NITE BP-770)。[5] 一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，具備下述酶化學(xué)性質(zhì)(1)作用作用于具有α -1，4糖苷鍵作為鍵合方式的多糖類及低聚糖類而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類；(2)底物特異性作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、麥芽四糖、麥芽五糖、 麥芽六糖，而不作用于α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精、麥芽三糖、麥芽糖；(3)分子量約 83000 (SDS-PAGE)。[6] 一種酶制劑，以[1] [5]中任一項(xiàng)所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶為有效成分。[7] 一種具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物，是土芽孢桿菌(GecAacillus SP. )APC9669(保藏號NITE BP-770)或其突變體。[8] 一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，由序列號8的氨基酸序列、或顯示麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的片段所構(gòu)成。[9]如[8]所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，由包含序列號6的序列的DNA所編碼。[10] 一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，由選自以下(a) (e)中的任一種DNA所所構(gòu)成(a)編碼序列號7或8的氨基酸序列的DNA ；(b)包含序列號6的序列的DNA ；(c)對于與序列號6的序列互補(bǔ)的序列在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行雜交的DNA ；(d)作為序列號6的序列的DNA序列簡并物的DNA ；
(e)由以序列號6的序列為基準(zhǔn)而包含1個或多個堿基的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列所構(gòu)成的、編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。[11] 一種重組載體，包含[10]所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因。[12]如[11]所述的重組載體，其中，所述重組載體是表達(dá)載體。[13] 一種轉(zhuǎn)化體，導(dǎo)入有[10]所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因。[14] 一種轉(zhuǎn)化體，導(dǎo)入有[11]或[12]所述的重組載體。[15]如[1 或[14]所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。[16] 一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，包括以下步驟(1)和( 、或步驟(i)和 (ii)(1)培養(yǎng)具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的土芽孢桿菌屬微生物的步驟，(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和/或菌體回收麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的步驟；(i)將[13] [15]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在產(chǎn)生上述麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，(ii)回收所產(chǎn)生的上述蛋白質(zhì)的步驟。[17]如[16]所述的制備方法，其中，土芽孢桿菌屬微生物為土芽孢桿菌 (Geobacillus SP.)APC9669。[18] [1] [5]中任一項(xiàng)所述的酶或[6]所述的酶制劑的使用，用于制備、加工包含具有α-1，4糖苷鍵的多糖類或低聚糖類的食品。[19] 一種食品或食品材料，通過使用[1] [5]中任一項(xiàng)所述的酶或[6]所述的酶制劑而功能性得到改善。


圖1是示出來源于土芽孢桿菌(GecAacillus SP. )APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度的圖表。圖2是示出來源于土芽孢桿菌APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH的圖表。圖3是示出來源于土芽孢桿菌APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的溫度穩(wěn)定性的圖表。圖4是示出來源于土芽孢桿菌APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的pH穩(wěn)定性的圖表。圖5是示出麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的SDS-PAGE結(jié)果的圖。泳道1 分子量標(biāo)記，泳道 2 麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。圖6是示出面包柔軟性維持效果的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖7是示出大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞破碎物的離心上清的SDS-PAGE結(jié)果的圖。泳道 M 分子量標(biāo)記，泳道1 大腸桿菌載體轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞破碎物的離心上清，泳道2 麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。
具體實(shí)施例方式(術(shù)語)在本發(fā)明中，所謂“編碼蛋白質(zhì)的DNA”是指在使其表達(dá)時得到該蛋白質(zhì)的DNA，即，是指具有與該蛋白質(zhì)的氨基酸序列對應(yīng)的堿基序列的DNA。因此也考慮密碼子的簡并。在本說明書中，術(shù)語“分離的”可與“純化的”交換使用。在用于本發(fā)明的酶(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶)時，“分離的”是指當(dāng)本發(fā)明的酶是來源于天然材料的情況下，在該天然材料中基本不含該酶以外的成分(尤其是基本不含雜蛋白質(zhì))的狀態(tài)。具體而言，例如在本發(fā)明的分離的酶中，以重量換算，雜蛋白質(zhì)的含有量大約小于整體的20%，優(yōu)選大約小于 10%，更優(yōu)選大約小于5%，進(jìn)一步優(yōu)選大約小于1 %。另一方面，當(dāng)本發(fā)明的酶是通過基因工程學(xué)方法調(diào)制而得的情況下，術(shù)語“分離的”是指，基本不含來源于所使用的宿主細(xì)胞的其它成分、培養(yǎng)液等的狀態(tài)。具體而言，例如本發(fā)明的分離的酶中，以重量換算，雜成分的含有量大約小于整體的20%，優(yōu)選大約小于10%，更優(yōu)選大約小于5 %，進(jìn)一步優(yōu)選大約小于 1%。應(yīng)予說明，只要不是明顯表示與其不同的意思，在本說明書中簡單地記載“麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶”的情況下，其是指“分離狀態(tài)的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶”。對用于代替麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的術(shù)語“本酶”也同樣。在用于DNA時的“分離的”在本來天然存在的DNA的情況下典型地是指從在天然狀態(tài)下共存的其它核酸中分離的狀態(tài)。但是，可以包含在天然狀態(tài)下鄰接的核酸序列(例如啟動子區(qū)域的序列、終止子序列等)等的一部分其它核酸成分。例如在基因組DNA時的“分離的”狀態(tài)下，優(yōu)選基本不含在天然狀態(tài)下共存的其它DNA成分。另一方面，在cDNA分子等通過基因工程學(xué)方法調(diào)制而得的DNA時的“分離的”狀態(tài)下，優(yōu)選基本不含細(xì)胞成分、培養(yǎng)液等。同樣地，通過化學(xué)合成調(diào)制而得的DNA時的“分離的”狀態(tài)下，優(yōu)選基本不含dNTP等前體(原材料)、合成過程中使用的化學(xué)物質(zhì)等。應(yīng)予說明，只要不是明顯表示與其不同的意思，在本說明書中簡單地記載“DNA”的情況下，其是指分離狀態(tài)的DNA。(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶及其生產(chǎn)菌)本發(fā)明的第1方面是提供麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶(以下也稱為“本酶”)及其生產(chǎn)菌。 如后述的實(shí)施例所示，本發(fā)明人等深入研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)土芽孢桿菌(GecAacillus SP.) APC9669產(chǎn)生麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，成功地分離、生成該麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，并且如下所示，成功地確定其酶化學(xué)性質(zhì)。(1)作用本酶是麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，作用于具有α-1，4糖苷鍵作為鍵合方式的多糖類及低聚糖類，而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類。(2)底物特異性本酶對可溶性淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖良好地進(jìn)行作用。與此相對，對α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精、麥芽三糖、麥芽糖不進(jìn)行作用。(3)分子量本酶的分子量約為83000 (根據(jù)SDS-PAGE)。(4)最適溫度本酶的最適溫度為約50°C。本酶在約45°C 約55°C下顯示高活性。最適溫度是利用后述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定方法(lOmmol/LMES緩沖液(pH6. 5)中)進(jìn)行測定而算出的值。(5)最適 pH本酶的最適pH為約7. 5。本酶在pH為約6. 5 約8. 0下顯示高活性。最適pH例如是基于在通用緩沖液中測定的結(jié)果進(jìn)行判斷的。(6)溫度穩(wěn)定性本酶在65°C以下的條件下顯示穩(wěn)定的活性。即使在lOmmol/LMES緩沖液(pH6. 5) 中、65°C的條件下進(jìn)行30分鐘處理后，本酶也維持90%以上的活性。(7)pH 穩(wěn)定性本酶在pH5.0 10.0這樣寬的pH域中顯示穩(wěn)定的活性。即，只要供以處理的酶溶液的PH在該范圍內(nèi)，則在40°C、30分鐘的處理后也維持85%以上的活性。(8)等電點(diǎn)本酶的等電點(diǎn)為約4. 5(根據(jù)含兩性電解質(zhì)的電泳法)。應(yīng)予說明，如后述實(shí)施例所示，可知土芽孢桿菌(GecAacillus SP. )APC9669所產(chǎn)生的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶在使之對作為底物的麥芽四糖進(jìn)行作用時，在底物濃度為0. 67% (w/v) 70% (w/v)的整個范圍中，作為糖基轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的麥芽七糖的生成速度和作為分解產(chǎn)物的麥芽三糖的生成速度之比為9 1 10 0。換言之，在廣泛的底物濃度范圍中糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的速度壓倒性地大，若將麥芽七糖生成速度和麥芽三糖生成速度的總計(jì)設(shè)為 100%，則前者成為90%以上。應(yīng)予說明，以產(chǎn)物的摩爾比為基準(zhǔn)，對速度進(jìn)行比較。如上所述，明確了成功取得的本酶的性狀的詳細(xì)情況。其結(jié)果可知本酶的耐熱性優(yōu)異、底物特異性優(yōu)異。因此，本酶適于食品加工用途。本酶優(yōu)選為來源于土芽孢桿菌APC9669 (Geobacillus sp. APC9669)的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。在此的“來源于土芽孢桿菌APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶”是指土芽孢桿菌APC9669(野生株和突變體均可)所生產(chǎn)的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶、或利用土芽孢桿菌 APC9669(野生株和突變體均可)的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因而通過基因工程學(xué)方法得到的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。因此，利用將從土芽孢桿菌APC9669取得的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因(或?qū)⒃摶蜻M(jìn)行改變而得的基因)進(jìn)行導(dǎo)入而得的宿主微生物所生產(chǎn)的重組體也符合“來源于土芽孢桿菌APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶”。為了方便說明，將作為來源于本酶的土芽孢桿菌APC9669稱為本酶的生產(chǎn)菌。如下所述，APC9669株保藏于規(guī)定的保藏機(jī)構(gòu)，可容易地取得。保藏機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人制品評價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)(NITE)專利微生物保藏中心(〒 292-0818,日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)保藏日(受理日)2009年6月2日保藏號NITEBP-770本發(fā)明的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶在一個方式中包含序列號8的氨基酸序列。該氨基酸序列是從序列號7的氨基酸序列去除信號肽部分而成的。應(yīng)予說明，序列號7的氨基酸序列是對從土芽孢桿菌APC9669克隆而得的基因的堿基序列(序列號6)進(jìn)行推定而得的氨基酸序列。在此，通常存在對某蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分實(shí)施改變時，改變后的蛋白質(zhì)與改變前的蛋白質(zhì)具有同等功能的情況。即，存在氨基酸序列的改變對蛋白質(zhì)的功能沒有給與實(shí)質(zhì)性影響，蛋白質(zhì)的功能在改變前后得以維持的情況。因此，本發(fā)明作為其它方式提供由與序列號8所示的氨基酸序列等效的氨基酸序列所構(gòu)成的、具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)(以下也稱為“等效蛋白質(zhì)”)。在此的“等效氨基酸序列”是指與序列號8所示氨基酸序列一部分不同，但該不同對蛋白質(zhì)的功能(在此為麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性)沒有給與實(shí)質(zhì)性影響的氨基酸序列?！熬哂宣溠咳腔D(zhuǎn)移酶活性”是指作用于具有α-1，4糖苷鍵作為鍵合方式的多糖類及低聚糖類而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類的活性，其活性程度只要是能夠發(fā)揮作為麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的功能就沒有受到特別限定。但優(yōu)選與由序列號8 所示氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相同程度或比其還高?！鞍被嵝蛄械囊徊糠植煌钡湫偷厥侵咐脴?gòu)成氨基酸序列的1個 數(shù)個(上限例如為3個、5個、7個、10個)氨基酸的缺失、取代，或1個 數(shù)個(上限例如為3個、5 個、7個、10個)的氨基酸的添加、插入或其組合而使氨基酸序列產(chǎn)生突變(變化)的情況。 在此的氨基酸序列的不同只要是保持麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的活性就被允許(活性多少可以有變動)。只要滿足此條件，氨基酸序列不同的位置就沒有受到特別限定，此外還可以在多個位置上產(chǎn)生不同。在此的多個例如是指相當(dāng)于約小于總氨基酸的30%的數(shù)目，優(yōu)選為相當(dāng)于約小于20%的數(shù)目，更優(yōu)選為相當(dāng)于約小于10%的數(shù)目，進(jìn)一步優(yōu)選為相當(dāng)于約小于 5%的數(shù)目，最優(yōu)選為相當(dāng)于約小于1 %的數(shù)目。即，等效蛋白質(zhì)與序列號8的氨基酸序列例如具有約70%以上、優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選約90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選約95%以上、最優(yōu)選約99%以上的同源性。優(yōu)選通過使保守性氨基酸取代產(chǎn)生在對麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性不是必需的氨基酸殘基中而獲得等效蛋白。在此的“保守性氨基酸取代”是指將某氨基酸殘基取代為具有同樣性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈被分為堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天門冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)這幾種類別。保守性氨基酸取代優(yōu)選為同一類別內(nèi)的氨基酸殘基間的取代?！暗刃У鞍踪|(zhì)”可以具有附加的性質(zhì)。作為所述性質(zhì)，例如可舉出與由序列號8所示氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)相比穩(wěn)定性優(yōu)異這樣的性質(zhì)、只有在低溫和/或高溫時才發(fā)揮不同功能這樣的性質(zhì)、最適PH不同這樣的性質(zhì)等。在此，兩個氨基酸序列的同源性(％ )可例如通過如下順序來確定。首先，以可進(jìn)行最適比較的方式將兩個序列進(jìn)行排列(例如，可以向第一序列導(dǎo)入空位而使與第二序列的序列的比對達(dá)到最造化)。當(dāng)?shù)谝恍蛄械奶囟ㄎ恢玫姆肿?氨基酸殘基)與第二序列中對應(yīng)位置的分子相同時可以說該位置的分子相同。序列同源性是該兩個序列中共同的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，同源性(％)=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)X100)，優(yōu)選將在比對的最適化中所需要的空位的數(shù)目及尺寸也納入考慮。兩個序列的比較及同源性的確定可使用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。作為在序列比較中可利用的數(shù)學(xué)算法的具體例，有Karlin及 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68 中記載的、在 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-77中進(jìn)行了改變的算法，但并不限定于此。這種算法已被編入Altschul等在(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10中記載的NBLAST程序及 XBLAST程序(版本2. 0)。例如，如果在XBLAST程序中以score = 50、wordlength = 3進(jìn)行BLAST多肽檢索，則可以得到同源性高的氨基酸序列。為了獲得用于比較的空位比對，可以利用在 Altschul 等(1997) Amino Acids Research 25(17) :3389-3402 中記載的 Gapped BLAST。在利用BLAST及Gapped BLAST時，可以使用對應(yīng)程序(例如XBLAST及NBLAST)的缺省參數(shù)。詳細(xì)而言例如請參考NCBI的網(wǎng)頁。作為可用于序列比較中的其它數(shù)學(xué)算法的示例，有Myers及Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4 :11-17中記載的算法。這種算法例如已被編入可在GENESTREAM網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(IGH Montpellier，法國)或ISREC服務(wù)器中利用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比較中使用ALIGN程序時，例如可使用PAM120殘基質(zhì)量表，使空位長罰分=12、空位罰分=4。兩個氨基酸序列的同源性可如下確定用GCG軟件包的GAP程序，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，使空位加權(quán)=12、10、8、6或4，使空位長加權(quán)=2、3或4。本酶可以是更大的蛋白質(zhì)(例如融合蛋白質(zhì))的一部分。作為在融合蛋白質(zhì)中所添加的序列，例如可舉出多重組氨酸殘基之類的對純化有用的序列、確保重組生產(chǎn)時的穩(wěn)定性的附加序列等。具有上述氨基酸序列的本酶可通過基因工程學(xué)方法容易地進(jìn)行調(diào)制。例如，可用編碼本酶的DNA將適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如大腸桿菌)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，回收在轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而進(jìn)行調(diào)制。對回收的蛋白質(zhì)可根據(jù)目的而進(jìn)行適當(dāng)調(diào)制。如果由此得到本酶作為重組蛋白質(zhì)，則可進(jìn)行各種修飾。例如，如果將編碼本酶的DNA和其它適當(dāng)?shù)腄NA插入同一載體而使用該載體進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，則能得到由連接有任意的肽乃至蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)所構(gòu)成的本酶。此外，可以實(shí)施產(chǎn)生糖鏈和/或脂質(zhì)的添加、或N末端或C末端加工之類的修飾。通過如上修飾可提取重組蛋白質(zhì)、使純化簡化、或添加生物學(xué)功能等。(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因)本發(fā)明的第2方面涉及麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因。在一個方式中，本發(fā)明的基因包含編碼序列號7或8的氨基酸序列的DNA。該方式的具體例是由序列號6的堿基序列所構(gòu)成的DNA。但是，通常存在對編碼某蛋白質(zhì)的DNA的一部分實(shí)施改變時，改變后的DNA編碼的蛋白質(zhì)與改變前的DNA編碼的蛋白質(zhì)具有同等功能的情況。S卩，DNA序列的改變對所編碼的蛋白質(zhì)的功能沒有給與實(shí)質(zhì)性的影響，所編碼的蛋白質(zhì)的功能在改變前后得以維持的情況。因此，本發(fā)明作為其它方式提供具有與序列號6的堿基序列等效的堿基序列的、編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(以下，也稱為“等效DNA”)。在此的“等效堿基序列”是指雖然與序列號6所示的核酸一部分不同，但不會因該不同而使其編碼的蛋白質(zhì)的功能(在此為麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性)受到實(shí)質(zhì)性影響的堿基序列。等效DNA的具體例是對與序列號6的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行雜交的DNA。在此的“嚴(yán)謹(jǐn)性條件”是指形成所謂特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。這種嚴(yán)謹(jǐn)型條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如可參考Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al. , 1987)進(jìn)行設(shè)定。作為嚴(yán)謹(jǐn)性條件，例如可舉出使用雜交液(50%甲酰胺，10 XSSC (0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH 7. 0)、5 XDenhardt溶液、SDS、10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的改性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(PH7. 5))在約42°C 約50°C下進(jìn)行孵育，其后使用0. 1XSSC.0. 1% SDS在約 65°C 約70°C下進(jìn)行清洗的條件。作為更優(yōu)選的嚴(yán)謹(jǐn)性條件，例如可舉出作為雜交液使用 50% 甲酰胺、5XSSC(0. 15M NaCl, 15mM 檸檬酸鈉，ρΗ7· 0)、1 XDenhardt 溶液、SDSUO% 硫酸葡聚糖、IOy g/ml的改性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5)的條件。
作為等效DNA的其它具體例，可舉出由以序列號6所示的堿基序列為基準(zhǔn)而包含 1個或多個(優(yōu)選1個 數(shù)個)堿基的取代、缺失、插入、添加或倒位的堿基序列所構(gòu)成的、 編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的取代、缺失等可以發(fā)生在多個部位。在此的“多個”因該DNA編碼的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置、種類的不同而異，但例如為2 40個堿基、優(yōu)選為2 20個堿基、更優(yōu)選為2 10個堿基。如上所述的等效DNA例如可通過以下得到利用限制性內(nèi)切酶處理、基于核酸外切酶或DNA連接酶等的處理、基于定位突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13，C old Spring Harbor Lab oratory Press, New York)或隨機(jī)突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)的突變導(dǎo)入等，以包含堿基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的方式改變具有序列號6所示的堿基序列的DNA，從而得到。并且，也可以利用紫外泳道照射等其它方法得到等效DNA。作為等效DNA的進(jìn)一步的其它示例，可舉出由于SNP (單堿基多型態(tài))所代表的多型態(tài)而可確認(rèn)如上堿基的不同的DNA。本發(fā)明的基因可通過參考本說明書或所附序列表公開的序列信息，使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、生化學(xué)方法等調(diào)制成分離的狀態(tài)。具體而言，可適當(dāng)?shù)乩每蓪Ρ景l(fā)明的基因特異性雜交的低聚核苷酸探針·引物，從土芽孢桿菌APC9669的基因組DNA文庫或cDNA文庫、或從土芽孢桿菌APC9669的菌體內(nèi)提取液進(jìn)行調(diào)制。可使用市售的自動化DNA合成裝置等容易地合成低聚核苷酸探針 引物。應(yīng)予說明，對用于調(diào)制本發(fā)明的基因的文庫的制作方法，例如可參考Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。例如，如果為具有序列號6的堿基序列的基因，則可利用以該堿基序列或其互補(bǔ)序列的整體或一部分為探針的雜交法進(jìn)行分離。此外，可利用核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR) 進(jìn)行擴(kuò)增及分離，該核酸擴(kuò)增反應(yīng)使用以對該堿基序列的一部分進(jìn)行特異性雜交的方式設(shè)計(jì)而成的合成低聚核苷酸引物。此外，也可以以序列號7所示的氨基酸序列、序列號6的堿基序列的信息為基礎(chǔ)，通過化學(xué)合成而獲得作為目標(biāo)的基因(參考文獻(xiàn)Gene，60(l)， 115-127(1987))。下面示出本發(fā)明的基因的取得方法的具體例。首先，從土芽孢桿菌APC9669分離、 純化本酶(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶)，得到與其部分氨基酸序列相關(guān)的信息。作為確定部分氨基酸序列的方法，例如將純化的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶直接按照常規(guī)方法供以利用Edman降解法 〔The Journal of biological chemistry，第 256 卷，第 7990 7997 頁(1981)〕進(jìn)行氨基酸序列分析〔Protein S eq uencer 476A,Applied Biosystems公司制等〕。使蛋白質(zhì)水解酶作用而進(jìn)行限制性水解，將所得的肽片段進(jìn)行分離純化，對所得的純化肽片段進(jìn)行氨基酸序列分析，這是有效的。以如此得到的部分氨基酸序列信息為基礎(chǔ)，將麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行克隆。 例如可利用雜交法或PCR進(jìn)行克隆。利用雜交法時，例如可使用Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)中記載的方法。利用PCR法時，可使用以下方法。首先，以產(chǎn)生麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物的基因組DNA為模板，使用以部分氨基酸序列的信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的合成低聚核苷酸引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)，獲得目標(biāo)基因片段。PCR法是以PCR技術(shù)〔PCR Technology, Erlich HA編集，Stocktonpress社，1989年發(fā)行〕中記載的方法為基準(zhǔn)進(jìn)行的。進(jìn)而，若對該擴(kuò)增DNA片段使用通常所用的方法，例如雙脫氧鏈終止法來確定堿基序列，則在經(jīng)確定的序列中除了合成低聚核苷酸引物的序列以外還發(fā)現(xiàn)與麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的部分氨基酸序列對應(yīng)的序列， 而可獲得目標(biāo)麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因的一部分。以所得的基因片段為探針進(jìn)一步進(jìn)行雜交法等，從而能夠克隆編碼麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶全長的基因。在后述的實(shí)施例中，利用PCR法確定了編碼土芽孢桿菌APC9669生產(chǎn)的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的序列。將編碼來源于土芽孢桿菌APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的全堿基序列表示為序列號6。此外，確定了該堿基序列編碼的氨基酸序列(序列號7)。應(yīng)予說明，與序列號7所示的氨基酸序列對應(yīng)的堿基序列除了序列號6所記載的以外還存在多個。通過使用全堿基序列得到明確的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因(序列號6)的整體或一部分作為雜交用探針，從而可從其它產(chǎn)生麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物的基因組DNA文庫或 cDNA文庫中篩選與序列號6的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因同源性高的DNA。同樣可以設(shè)計(jì)PCR用的引物。通過使用該引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，能夠檢測出與上述麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因同源性高的基因片段，進(jìn)而也可得到該基因整體。通過制備所得基因的蛋白質(zhì)，測定其麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性，從而可確認(rèn)是否為編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因。此外，通過將所得基因的堿基序列(或其編碼的氨基酸序列)與上述麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因的堿基序列(或其編碼的氨基酸序列)進(jìn)行比較，從而也可核查基因結(jié)構(gòu)、同源性，判定是否編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。由于一級結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu)得到明確，所以可以通過導(dǎo)入隨機(jī)突變或部位特異性突變而得到改變型麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶(實(shí)施有1個或多個氨基酸殘基的缺失、添加、插入或取代中的至少一個的基因)。由此，可得到編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性而最適溫度、穩(wěn)定溫度、最適PH、穩(wěn)定pH、底物特異性等性質(zhì)不同的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的基因。此外，可以基因工程學(xué)地制備改變型麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。在此，導(dǎo)入突變時的計(jì)劃可例如參考基因序列上的特征性序列進(jìn)行。特征性序列的參考例如可通過考慮其蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測、與已知蛋白質(zhì)的同源性而進(jìn)行。若例示導(dǎo)入隨機(jī)突變的方法，則作為化學(xué)處理DNA的方法，為使亞硫酸氫鈉作用而引發(fā)將胞嘧啶堿基變換為尿嘧啶堿基的轉(zhuǎn)換突變的方法〔Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第 79 卷，第 1408 1412 頁(1982)〕，作為生化學(xué)方法， 為在存在〔α -S〕dNTP的情況下合成雙鏈的過程中引發(fā)堿基取代的方法〔Gene，第64卷，第 313 319頁(1988)〕，作為使用PCR的方法，為向反應(yīng)系加入錳進(jìn)行PCR而降低核苷酸獲取的正確性的方法(Analytical Biochemistry，第2 卷，第347 353頁(1995)〕等。若例示導(dǎo)入部位特異性突變的方法，則為利用琥珀突變的方法〔缺口雙鏈(gapped duplex)法，Nucleic Acids Research,第 12 卷，第 24 號，第 9441 9456 頁(1984)〕、利用限制性內(nèi)切酶的識別部位的方法(Analytical Biochemistry，第200卷，第81 88頁 (1992)，Gene、第 102 卷，第 67 70 頁(1991)〕、利用 dut (dUTPase)和 ung(尿嘧啶 DNA 糖苷酶)突變的方法〔Kunkel 法，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,第82卷，第488 492頁(1985)〕、利用使用了 DNA聚合酶和DNA連接酶的琥珀突變的方法〔Oligonucleotide-directed Dual Amber :0DA 法，Gene，第 152 卷，第 271 275 頁(1995)，日本特開平7489262號公報(bào)〕、利用誘導(dǎo)了 DNA的修復(fù)系統(tǒng)的宿主的方法(日本特開平8-70874號公報(bào))、利用催化DNA鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)的方法(日本特開平8-140685 號公報(bào))、基于使用添加了限制性內(nèi)切酶的識別部位的2種突變導(dǎo)入用引物的PCR的方法 (美國專利第5，512，463號)、基于使用具有非活化耐藥性基因的雙鏈DNA載體和2種引物的PCR的方法〔Gene，第103卷，第73 77頁(1991)〕、利用琥珀突變的PCR的方法〔國際公開W098/02535號公報(bào)〕等。通過使用市售的試劑盒，也能將部位特異性突變?nèi)菀椎貙?dǎo)入。作為市售的試劑盒，例如可使用以下試劑盒使用缺口雙鏈法的Mutan (注冊商標(biāo))-G(寶酒造公司制)、 使用Kunke 1法的Mutan (注冊商標(biāo))-K (寶酒造公司制)、使用ODA法的Mutan (注冊商標(biāo))-EXpreSSKm(寶酒造公司制)、使用突變導(dǎo)入用引物和來源于強(qiáng)烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的 DNA 聚合酶的 QuikChangeTM 定點(diǎn)突變試劑盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)〔STRATAGENE公司制〕等，此外，作為利用PCR法的試劑盒，可使用TaKaRa LA聚合酶鏈反應(yīng)在體外突變試劑盒(PCR in vitro Mutagenesis Kit)(寶酒造公司制)、Mutan(注冊商標(biāo))-Super Express Km(寶酒造公司制)等。如此地，通過本發(fā)明提供了麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的一級結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu)，從而可廉價(jià)且高純度地進(jìn)行具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因工程學(xué)制備。(重組載體)本發(fā)明的另一方面涉及含有本發(fā)明的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體。本說明書中的術(shù)語“載體”是指能將插入該載體的核酸分子輸送至細(xì)胞等靶內(nèi)的核酸分子，對其種類、形態(tài)沒有特別限定。因此，本發(fā)明的載體可以采用質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、病毒載體(腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體等)的形態(tài)。根據(jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達(dá))，還考慮宿主細(xì)胞的種類，而選擇適當(dāng)?shù)妮d體。若舉出載體的具體例，則有以大腸桿菌為宿主的載體(M13噬菌體或其變異體、λ噬菌體或其變異體、PBR322或其變異體(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母為宿主的載體 (pYepSecUpMFa, pYES2等)、以昆蟲細(xì)胞為宿主的載體(pAc、pVL等)、以哺乳類細(xì)胞為宿主的載體(pCDM8、pMT2PC等)等。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選為表達(dá)載體。所謂“表達(dá)載體”是指能將插入該表達(dá)載體的核酸導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)，且能在該細(xì)胞內(nèi)使之表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常包含所插入核酸的表達(dá)所需的啟動子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。也可以使用包含選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。在使用所述表達(dá)載體時，可利用選擇標(biāo)記確認(rèn)有無表達(dá)載體的導(dǎo)入(及其程度)。本發(fā)明的基因的向載體的插入、選擇標(biāo)記基因的插入(需要的情況下)、啟動子的插入(需要的情況下)等可使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(例如可參考Molecular Cloning, Third Edition, 1. 84, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,是使用限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶的公知方法)進(jìn)行。(轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明還涉及導(dǎo)入有本發(fā)明的基因的宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，本發(fā)明的基因會作為外源性分子存在。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選通過使用上述本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)染乃至轉(zhuǎn)化而調(diào)制。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化可通過磷酸鈣共沉降法、電穿孔(Potter，H. et al., Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α. 81,7161-7165(1984))、脂質(zhì)體(Feigner, P. L. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 7413-7417 (1984))、顯微注射(Graessmann, Μ. &Graessmann, Α.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 73，366-370 (1976))、Hanahan 的方法(Hanahan, D.， J. Mol. Biol. 166,557-580(1983))、乙酸鋰法(Schiestl, R. H. et al.，Curr. Genet. 16， 339-346(1989))、原生質(zhì)體-聚乙二醇法(Yelton, M. M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等實(shí)施。宿主細(xì)胞只要是能表達(dá)本發(fā)明的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶就沒有受到特別限定，例如可從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus likemiformis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)等芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌；乳球菌(Lactococcus)、 乳桿菌(Lactobacillus)、鏈球菌(Str印tococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)等乳酸菌；大腸桿菌(Escherichia)、鏈霉菌(Streptomyces)等其它細(xì)菌；酵母菌(Saccharomyces)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、念珠菌(Candida)、 圓酵母菌(Torula)、球擬酵母屬(Torulopsis)等酵母；米曲霉(Aspergillus oryzae)、 黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)屬，青霉(Penicillium)屬，木霉 (Trichoderma)屬，鐮刀菌(Fusarium)屬等絲狀菌(真菌)等中進(jìn)行選擇。(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法)本發(fā)明的另一方面提供麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法。本發(fā)明的制備方法的一個方式中，進(jìn)行培養(yǎng)具有生產(chǎn)本酶(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶)的能力的土芽孢桿菌屬的微生物的步驟(步驟(1))、及從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和/或菌體回收麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的步驟(步驟 0))。步驟(1)中的土芽孢桿菌屬微生物只要具有生產(chǎn)本酶的能力就沒有受到特別的限定。例如，可以使用上述土芽孢桿菌APC9669。培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件只要是能夠生產(chǎn)目標(biāo)酶就沒有受到特別限定。即，以生產(chǎn)本酶為條件，可適當(dāng)設(shè)定適于培養(yǎng)所用微生物的方法、 培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)方法，可為液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)中的任一種，但優(yōu)選利用液體培養(yǎng)。以液體培養(yǎng)為例對其培養(yǎng)條件進(jìn)行說明。作為培養(yǎng)基，只要是所用微生物可生長的培養(yǎng)基就可任意使用。例如，可使用添加有葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有機(jī)酸等碳源，進(jìn)而添加有硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、乙酸銨的培養(yǎng)基；或者使用添加有蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、麥糠、肉分離物等氮源，進(jìn)而添加有鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機(jī)鹽的培養(yǎng)基。為了促進(jìn)所用微生物的生長，可以向培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸等。培養(yǎng)基的PH例如調(diào)整為約3 10、優(yōu)選為約7 8左右，培養(yǎng)溫度通常為約10 80°C、優(yōu)選為約30 65°C左右，在需氧條件下培養(yǎng)1 7天、優(yōu)選2 4天左右。作為培養(yǎng)方法，例如可利用振蕩培養(yǎng)方法，利用發(fā)酵罐的需氧深層培養(yǎng)方法。在以上條件下進(jìn)行培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液或菌體回收麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶(步驟(2))。 從培養(yǎng)液回收時，例如可通過將培養(yǎng)上清進(jìn)行過濾、離心處理等而去除不溶物，然后通過適當(dāng)組合利用超濾膜的濃縮、硫酸銨沉淀等鹽析、透析、離子交換樹脂等各種層析等來進(jìn)行分離、純化，從而得到本酶。另一方面，從菌體內(nèi)回收時，例如可將菌體通過加壓處理、超聲波處理等進(jìn)行破碎后，與上述同樣地進(jìn)行分離、純化，從而得到本酶。應(yīng)予說明，也可以利用過濾、離心處理等預(yù)先從培養(yǎng)液回收菌體，然后進(jìn)行上述一系列工序(菌體的破碎、分離、純化)。應(yīng)予說明，對表達(dá)的確認(rèn)、表達(dá)產(chǎn)物的確認(rèn)，使用針對麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的抗體進(jìn)行是簡便的，但也可以通過測定麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性而進(jìn)行表達(dá)的確認(rèn)。本發(fā)明的其它方式中，使用上述轉(zhuǎn)化體制備麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶。在該方式的制備方法中，首先，在產(chǎn)生被導(dǎo)入該轉(zhuǎn)化體的基因所編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體 (步驟(i))。對于各種載體宿主系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)定適合的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)步驟之后，回收所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)(即，麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶) (步驟(ii))。關(guān)于回收及其后的純化，與上述方式的情況同樣地進(jìn)行即可。對本酶的純化度沒有受到特別限定。此外，最終形態(tài)可以是液體也可以是固體 (包括粉體)。(酶制劑)本發(fā)明的酶例如以酶制劑的方式被提供。酶制劑除了有效成分(本發(fā)明的酶)之外還可以含有賦型劑、緩沖劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等。作為賦型劑， 可以使用淀粉、糊精、麥芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。 作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用乙醇、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。(麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的用途)本發(fā)明的另一方面是提供食品的制備、加工方法作為麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶(本酶) 的用途。本發(fā)明的制備、加工方法中，使本酶作用于含具有^-1，4糖苷鍵的多糖類和/或低聚糖類的食品或食品原料，而改善該食品的功能性。作為食品的例子可舉出面包、米飯、 餅。作為食品原料的例子可舉出各種含淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、麥芽低聚糖的原料。對原料的純度沒有特別限定，也可以使本酶作用于與其它物質(zhì)混雜狀態(tài)下的原料。此外，也可以使本酶同時作用于兩種以上的原料。
實(shí)施例 <麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定方法>麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的活性是如下測定的。即，向含麥芽四糖(林原生物化學(xué)研究所制)的lOmmol/L MES緩沖液(pH6. 5) 2mL中添加酶溶液0. 5mL,在40°C下放置60分鐘。放置后，在沸騰水浴中加熱5分鐘，然后在流水中冷卻。將所生成的葡萄糖利用Glucose CII-Test Wako (和光純藥制)進(jìn)行定量。將在本條件下1分鐘內(nèi)在2. 5mL反應(yīng)液中生成 1 μ mol葡萄糖的酶量設(shè)為1個單位。<麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性確認(rèn)方法>麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的活性是與上述 < 麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定方法 > 一起如下進(jìn)行確認(rèn)的。即，向含10.3mmol/L麥芽四糖(林原生物化學(xué)研究所制)的5mmol/L乙酸緩沖液(pH6. 0)985 μ L添加1. Ou/mL酶溶液15 μ L，50°C下放置1、2、3小時。放置后，在沸騰水浴中加熱5分鐘，然后在流水中冷卻。將冷卻的反應(yīng)液使用陽離子樹脂、陰離子樹脂適當(dāng)脫鹽，以HPLC進(jìn)行反應(yīng)液的分析。HPLC裝置為島津制作所制“ftOminence UFLC”，柱為三菱化學(xué)制“MCI GEL CK04S”，洗脫液為水，流速0. 4mL/分鐘，利用差示折射計(jì)檢測，進(jìn)行分析。將所得底物和產(chǎn)物的面積％換算成摩爾量，計(jì)算消耗速度和生成速度。在純化的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，例如，生成速度比成為7糖3糖=約92 約8。1.來源于土芽孢桿菌株APC9669的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)和純化使用表1所示組成的液體培養(yǎng)基，將土芽孢桿菌株APC9669進(jìn)行45°C、2天的振蕩培養(yǎng)。將所得的培養(yǎng)上清液用UF膜(AIP-1013D，旭化成制)濃縮5倍后，以成為50%飽和濃度的方式添加硫酸銨。將沉淀部分再次溶解于含5mmol/L氯化鈣的20mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(PH8. 0)，接著以最終濃度成為0. 5mol/L的方式添加硫酸銨。將所生成的沉淀用離心分離去除后，供于用含0. 5mol/L硫酸銨和5mmol/L氯化鈣的20mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(ρΗ8· 0)進(jìn)行了平衡化的 HiLoac^6/10Phenyl Sepharose HP 柱(GE Healthcare 制)， 利用0. 5mol/L到Omol/L的硫酸銨泳道性濃度梯度，使吸附的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫。[表1]麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，具有作用于具有α-1，4糖苷鍵的多糖類和低聚糖類而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類的活性，在使該酶對作為底物的麥芽四糖進(jìn)行作用時，在底物濃度為0.67% (w/v) 70% (w/v)的整個范圍中，麥芽七糖生成速度與麥芽三糖生成速度之比成為9 1 10 0。
2.如權(quán)利要求1所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶為來源于微生物的酶。
3.如權(quán)利要求1所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶為來源于土芽胞桿菌屬微生物的酶。
4.如權(quán)利要求3所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，土芽胞桿菌屬微生物為土芽胞桿菌 (Geobacillus SP.) APC9669，保藏號為 NITEBP-770。
5.一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，具備下述的酶化學(xué)性質(zhì)(1)作用作用于具有α-1，4糖苷鍵作為鍵合方式的多糖類和低聚糖類而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類；(2)底物特異性作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖，而不作用于α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精、麥芽三糖、麥芽糖；(3)分子量約83000，SDS-PAGE 法。
6.一種酶制劑，以權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶為有效成分。
7.一種具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物，是土芽胞桿菌(GecAacillus SP.) APC9669或其突變菌，土芽胞桿菌APC9669的保藏號為NITE BP-770。
8.一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，由序列號8的氨基酸序列、或顯示麥芽三糖基轉(zhuǎn)移活性的片段所構(gòu)成。
9.如權(quán)利要求8所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，由包含序列號6的序列的DNA所編碼。
10.一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，由選自以下(a) (e)中的任一種DNA所構(gòu)成(a)編碼序列號7或8的氨基酸序列的DNA；(b)包含序列號6的序列的DNA；(c)對于與序列號6的序列互補(bǔ)的序列在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行雜交的DNA；(d)作為序列號6的序列的DNA序列簡并物的DNA；(e)由以序列號6的序列為基準(zhǔn)而包含1個或多個堿基的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列所構(gòu)成的、編碼具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
11.一種重組載體，包含權(quán)利要求10所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
12.如權(quán)利要求11所述的重組載體，其中，所述重組載體是表達(dá)載體。
13.一種轉(zhuǎn)化體，導(dǎo)入有權(quán)利要求10所述的麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
14.一種轉(zhuǎn)化體，導(dǎo)入有權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的重組載體。
15.如權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
16.一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，包括以下步驟(1)和O)、或步驟(i)和(ii)(1)培養(yǎng)具有麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的土芽胞桿菌屬微生物的步驟，(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和/或菌體回收麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶的步驟；(i)將權(quán)利要求13 15中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在產(chǎn)生所述麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，( )回收所產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的步驟。
17.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其中，土芽孢桿菌屬微生物為土芽孢桿菌 (Geobacillus SP.)APC9669。
18.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的酶或權(quán)利要求6所述的酶制劑的使用，用于制備、 加工包含具有α-1，4糖苷鍵的多糖類或低聚糖類的食品。
19.一種食品或食品材料，通過使用權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的酶或權(quán)利要求6所述的酶制劑而功能性得到改善。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的糖基轉(zhuǎn)移酶及其用途，其在可用于食品加工等中的條件下催化麥芽三糖單元的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。本發(fā)明提供一種麥芽三糖基轉(zhuǎn)移酶，其具有作用于具有α-1，4糖苷鍵的多糖類和低聚糖類而使麥芽三糖單元轉(zhuǎn)移至糖類的活性，在使之對作為底物的麥芽四糖進(jìn)行作用時，在底物濃度為0.67％(w/v)～70％(w/v)的整個范圍中，麥芽七糖生成速度與麥芽三糖生成速度之比成為9∶1～10∶0。
文檔編號C12N5/10GK102510900SQ20108002933
公開日2012年6月20日 申請日期2010年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月1日
發(fā)明者岡田正通, 山口莊太郎, 長屋美穗 申請人:天野酶株式會社