專(zhuān)利名稱(chēng)：正痘病毒產(chǎn)生和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒產(chǎn)生和純化領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正痘病毒的方法。
背景技術(shù)：
正痘病毒是復(fù)雜的包膜病毒，具有200nm到300nm的直徑，主要通過(guò)它們不尋常的形態(tài)學(xué)、它們的大DNA基因組和它們復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)部位進(jìn)行區(qū)分。正痘病毒數(shù)個(gè)成員(包括哥本哈根痘苗病毒(VV)菌株(GOEBEL 等，1990，Virol. 179，247-266 和 517-563 ;JOHNSON等，1993，Virol. 196,381-401)和修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)菌株(ANTOINE等，1998，Virol. 244,365-396))的基因組已被作圖和測(cè)序。VV具有約192kb的雙鏈DNA基因組，編碼約200種蛋白，其中大約100種涉及病毒組裝。MVA是高度減毒的痘苗病毒菌株，通過(guò)痘苗病毒的安卡拉株在雞胚胎成纖維細(xì)胞中超過(guò)500次連續(xù)傳代而產(chǎn)生(MAYR等， 1975, Infection 3,6-16)。MVA 病毒以保藏號(hào) N6CI2I_721 保藏于 Collection Nationale deCultures de Microorganismes (CNCM)。MVA基因組完整序列的確定以及與哥本哈根VV基因組的比較允許準(zhǔn)確鑒別存在于病毒基因組中的變化和確定導(dǎo)致片段化ORF (開(kāi)放讀框)的 7 種缺失(I 到 VII)和眾多突變(ANTOINE 等，1998，Virology 244，365-396)。正痘病毒作為載體用于開(kāi)發(fā)重組活疫苗的用途受到安全考慮和規(guī)定的影響。在使用正痘病毒接種前必須純化病毒?，F(xiàn)有的正痘病毒產(chǎn)生方法包括在細(xì)胞系(例如HelaS3)、在含胚卵或在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中復(fù)制病毒。在病毒復(fù)制后，丟棄培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞，通過(guò)鹿糖墊離心(sucrose cushion centrifugation)來(lái)純化從細(xì)胞釋放的正痘病毒(K0TWAL and ABRAHAM ；poxvirus growth, Purification and tittering in VacciniaVirus and Poxvirology, 2004,101-108, Humana Press Inc. , Totowa ;NJ ;USA)。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W007/147528描述了一種產(chǎn)生沒(méi)有靶向感染特異性的野生型MVA、減毒和/或重組MVA的方法，包括制備包裝細(xì)胞(例如CEF ;細(xì)胞系)的培養(yǎng)物，感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物，培養(yǎng)所述感染的細(xì)胞，從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收產(chǎn)生的MVA，以及通過(guò)深度過(guò)濾(depthfiltration)、微量過(guò)濾和滲濾進(jìn)一步純化病毒。WO 07/147528指出當(dāng)進(jìn)行深度過(guò)濾、微量過(guò)濾和滲濾時(shí)，使用核酸酶(更具體地，Benzonase 作為核酸酶的使用)不是必需的。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 08/138533描述了一種純化生物學(xué)活性痘苗病毒的方法，包括將包含在液相培養(yǎng)物中的痘苗病毒加載到附著了配體的固相基質(zhì)，清洗基質(zhì)，和洗脫病毒。盡管描述了用于正痘病毒產(chǎn)生和純化的數(shù)種方法，仍然需求其它方法。本發(fā)明提供這類(lèi)方法。

發(fā)明內(nèi)容
如整個(gè)申請(qǐng)所用，“正痘病毒”是指天花病毒；痘苗病毒(VV)如例如痘苗病毒株Elstree, Western Reserve, Wyeth, NYVAC, NYCBOH,巴黎，哥本哈根；和它們的衍生物如例如修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)，特別是MVA575 (ECACC V00120707)和MVA-BN (ECACCV00083008) ο根據(jù)本發(fā)明，正痘病毒可以無(wú)區(qū)別地是未成熟病毒(IV)，胞內(nèi)成熟病毒(MV)，胞內(nèi)包膜病毒(IEV)，細(xì)胞結(jié)合包膜病毒(CEV)或胞外包膜病毒(EEV) (SMITH等(2002)，J. Gen. Virol.，83，2915-2931)。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“一種”用于以下含義它們表示“至少一種”，“至少第一種”，“一或多種”或“多種”引用的組分或步驟，除非上下文明確另外指出。如整個(gè)申請(qǐng)所用，本文任何地方使用的“和/或”包括以下含義“和”，“或”以及“由所述術(shù)語(yǔ)連接的成分的所有或任意其它組合”。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“包括”旨在表示產(chǎn)品，組合物和方法包括所述的組分或步驟，但不排除其它的。當(dāng)用于限定產(chǎn)物、組合物和方法時(shí)，“基本上由...組成”應(yīng)當(dāng)表示排除任何實(shí)質(zhì)重要的其它組分或步驟。因此，基本上由所述組分組成的組合物不排除痕量染污物和藥學(xué)上可接受的載體。“由...組成”應(yīng)當(dāng)表示排除超過(guò)痕量的其它組分或步驟。 如整個(gè)申請(qǐng)所用，本文使用的“約”或“大約”表示在給定值或范圍的20%以?xún)?nèi)，優(yōu)選10%以?xún)?nèi)，和更優(yōu)選5%以?xún)?nèi)。本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正痘病毒的方法(即方法A)，包括以下步驟a)制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物；b)用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物；c)培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒；d)在一或多種核酸酶存在下溫育；e)從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒；f)在合適條件下將一價(jià)鹽添加到步驟e)回收的正痘病毒中以抑制核酸酶活性并避免所述正痘病毒吸附到步驟g)的陰離子交換吸附劑上；g)在合適條件下將步驟f)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以捕獲核酸；h)在合適條件下將步驟g)獲得的混合物凈化以去除細(xì)胞碎片；i)在合適條件下用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑以回收流過(guò)物(flowthrough)中剩余的正痘病毒；j)濃縮步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物；k)將步驟j)獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法不含動(dòng)物產(chǎn)物(除了包裝細(xì)胞)。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“動(dòng)物產(chǎn)物”是指在活生物體的動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的或由活生物體的動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的任意化合物或化合物集合。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法適合于無(wú)菌工業(yè)化規(guī)模制備過(guò)程以確保完全符合涉及疫苗無(wú)菌性的管理要求。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“減毒正痘病毒”是指已經(jīng)被修飾使其在預(yù)期對(duì)象中的致病性實(shí)質(zhì)降低的任意正痘病毒。優(yōu)選正痘病毒被減毒使其從臨床觀點(diǎn)來(lái)看是不致病的，即暴露于所述正痘病毒的對(duì)象相對(duì)于對(duì)照對(duì)象不顯示統(tǒng)計(jì)上顯著的病理學(xué)水平增加。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，減毒正痘病毒是減毒的VV或減毒的MVA。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“重組正痘病毒”是指包括插入其基因組的外源序列的正痘病毒。如本文所用，外源序列是指不是天然存在于親代病毒中的核酸。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“包裝細(xì)胞”是指可以被待產(chǎn)生的正痘病毒感染的細(xì)胞。包裝細(xì)胞可以是原代細(xì)胞，重組細(xì)胞和/或細(xì)胞系。例如，可以使用包含重組病毒載體缺少的、產(chǎn)生重組病毒所需的元件的重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，包裝細(xì)胞是永生化細(xì)胞系。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“永生化細(xì)胞系”是指培養(yǎng)時(shí)增殖不受Hayflick限制的細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明，永生化細(xì)胞系優(yōu)選獲自屬于鴨科或雉科的禽類(lèi)細(xì)胞。在鴨科中，尤其優(yōu)選屬于棲鴨屬(Cai rina)或鴨屬(Anas)的細(xì)胞。甚至更優(yōu)選永生化禽類(lèi)細(xì)胞系屬于番鴨(Cairina moschata)或綠頭鴨(Anas platyrhynchos)種。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，包裝細(xì)胞是獲自屬于鴨科的禽類(lèi)細(xì)胞、優(yōu)選獲自番鴨種的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系是包括被專(zhuān)利申請(qǐng)W02007/077256涵蓋的編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。尤其優(yōu)選的是下列永生化禽類(lèi)細(xì)胞系-以登錄號(hào)08060502保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)(見(jiàn)圖2、3和4)的T3-17490或其衍生物；-以登錄號(hào)08060501保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)(參見(jiàn)圖5、6和7)的T6-17490或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系是包括ElA核酸序列和被專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2009/004016涵蓋的編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞
系O如整個(gè)申請(qǐng)所用，保藏的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系的“衍生物”是指包括編碼“感興趣物質(zhì)”的核酸序列的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。如本文所用，“感興趣物質(zhì)”可以包括但不限于藥學(xué)上有活性的蛋白例如生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物，抗體，抗原，它們可用于免疫或接種等的衍生物，白介素，胰島素，紅細(xì)胞生成素，G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF，干擾素(干擾素-alpha，干擾素-beta,干擾素-gamma),凝血因子(例如因子VIII,因子IX ；tPA)或其組合。可用于本發(fā)明方法的其它永生化細(xì)胞系是-專(zhuān)利US5，879，924涵蓋的DFl細(xì)胞系，其是得自10天齡East LansingLine (ELL-O)卵的自發(fā)永生化雞細(xì)胞系；-專(zhuān)利申請(qǐng)WO2005/007840涵蓋的Ebx雞細(xì)胞系，其通過(guò)從生長(zhǎng)因子和飼養(yǎng)層的漸進(jìn)分離而衍生自胚胎干細(xì)胞；-DEC 99 細(xì)胞系(Ivanov 等，Experimental Pathology and Parasitology,4/2000Bulgarian Academy of Sciences),其是鴨胚胎永久細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，包裝細(xì)胞是原代細(xì)胞。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“原代細(xì)胞”是指從動(dòng)物或人組織，器官或生物體新鮮分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞不能連續(xù)和無(wú)限復(fù)制和分裂。通常，原代細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)分裂少于100次，經(jīng)常少于50次，經(jīng)常少于25次。因此原代細(xì)胞不經(jīng)歷永生化事件。原代細(xì)胞包括但不限于動(dòng)物成纖維細(xì)胞或臍帶血淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，包裝細(xì)胞是原代或繼代(secondary)禽類(lèi)細(xì)胞，優(yōu)選雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)。根據(jù)本發(fā)明，用于制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基(即步驟a)期間)，用于正痘病毒感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基(即步驟b)期間)和用于培養(yǎng)所述感染的包裝細(xì)胞的培養(yǎng)基(即步驟C)期間)可以是相同或不同的。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基不含動(dòng)物產(chǎn)物。已經(jīng)描述了許多不含動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基，其中一些是可商購(gòu)獲得的。在本發(fā)明的方法中可以例如使用以下作為細(xì)胞培養(yǎng)基293SFM II ；293-F Cells, SFM Adapted ;293_H Cells, SFMAdapted ;293fectin 轉(zhuǎn)染試劑；CD 293AGT ；CD 293 培養(yǎng)基；FreeStyle 293 表達(dá)系統(tǒng)；FreeStyle 293 培養(yǎng)基；FreeStyle 293-F Cells, SFM Adapted ;用于 PER. C6 細(xì)胞的腺病毒表達(dá)培養(yǎng)基(AEM)生長(zhǎng)培養(yǎng)基；⑶293AGT ;⑶293培養(yǎng)基；C0S-7L Cells,SFM Adapted ;EPISERF 培養(yǎng)基；OptiPro SFM ;VP_SFM ;VP_SFM AGT 。(均可得自Invitrogen)。根據(jù)本發(fā)明使用的不含動(dòng)物產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基也可以是自制培養(yǎng)基。制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟a)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。 當(dāng)包裝細(xì)胞是永生化細(xì)胞系時(shí)，所述永生化細(xì)胞系在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述方法可包括粘附到表面生長(zhǎng)，在存在或不存在(微)載體下懸浮生長(zhǎng)，或其組合?？梢岳缭谄矫?，滾瓶或生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，使用分批、補(bǔ)料分批、連續(xù)系統(tǒng)、空心纖維等等進(jìn)行。為了實(shí)現(xiàn)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模產(chǎn)生病毒，在本領(lǐng)域優(yōu)選使細(xì)胞能夠在存在或不存在(微)載體下懸浮生長(zhǎng)，并且優(yōu)選使細(xì)胞能夠在不含動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選不含動(dòng)物產(chǎn)物。已經(jīng)描述了許多不含動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基，如先前所述，其中一些可商購(gòu)獲得。當(dāng)包裝細(xì)胞是CEF時(shí)，所述CEF優(yōu)選從無(wú)特定病原(SPF)的卵提取。SPF卵可商購(gòu)獲得，例如來(lái)自 Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA)。所述卵優(yōu)選超過(guò) 9 天齡，更優(yōu)選為10到14天齡，和甚至更優(yōu)選是12天齡。在提取胚胎之前，優(yōu)選將卵消毒。用于卵消毒的許多方法和產(chǎn)品是現(xiàn)有技術(shù)中可獲得的。在甲醛溶液(例如2%甲醛，I分鐘)中溫育然后用70%乙醇清洗是特別優(yōu)選的。然后解離和純化胚胎細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，將胚胎細(xì)胞進(jìn)行酶消化步驟，破壞細(xì)胞間基質(zhì)。為此，能夠消化細(xì)胞間基質(zhì)的酶的使用是尤其有用的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的酶包括但不限于胰蛋白酶，膠原酶，鏈霉蛋白酶，分散酶，透明質(zhì)酸酶和神經(jīng)氨酸酶。根據(jù)本發(fā)明用于制備CEF的酶優(yōu)選是重組來(lái)源的。酶可以單獨(dú)使用或組合使用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分散酶和胰蛋白酶(例如TrypLE，選自Gibco )是組合使用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定允許細(xì)胞有效分離的酶濃度，溫度和溫育時(shí)長(zhǎng)。CEF培養(yǎng)物的制備可以進(jìn)一步包括過(guò)濾步驟和/或離心步驟以便去除污染物。根據(jù)本發(fā)明，獲得的原代CEF可以直接使用或在進(jìn)一步細(xì)胞傳代后作為繼代CEF使用。然后在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)CEF(即原代或繼代)。根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選不含動(dòng)物產(chǎn)物。已經(jīng)描述了許多不含動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基，如先前所述，其中一些可商購(gòu)獲得。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在VP-SFM細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)CEF。在感染之前，CEF優(yōu)選培養(yǎng)I到5天，更優(yōu)選I到2天，和甚至更優(yōu)選2天。CEF優(yōu)選在30°C到36. 5°C之間的溫度下培養(yǎng)。用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物(在步驟a)制備)的步驟b)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如整個(gè)申請(qǐng)所用，“感染”是指將病毒核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，其中病毒核酸被復(fù)制，病毒蛋白被合成，或新的病毒顆粒被組裝。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇用于產(chǎn)生特定病毒的最合適的包裝細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括使用CEF或?qū)＠暾?qǐng)WO 2007/077256或TO 2009/004016涵蓋的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生正痘病毒，以及優(yōu)選MVA或W。在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物(在步驟a)制備)的步驟b)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基可以與制備所述包裝細(xì)胞培養(yǎng)物(即步驟a)期間)使用的細(xì)胞培養(yǎng)基相同或不同。根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選不含動(dòng)物產(chǎn)物。已經(jīng)描述了許多不含動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基，如先前所述，其中一些可商購(gòu)獲得。當(dāng)包裝細(xì)胞是CEF時(shí),在Basal Medium Eagle細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)中進(jìn)行感染CEF培養(yǎng)物的步驟b)。細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選以O(shè). 5到I. 5個(gè)胚胎/每升細(xì)胞培養(yǎng)基接種，更優(yōu)選以I. I到I. 3和甚至更優(yōu)選以約I. 2個(gè)胚胎/每升細(xì)胞培養(yǎng)基接種。在待產(chǎn)生的正痘病毒是MVA的具體實(shí)施方案中，MVA優(yōu)選以O(shè). 001到O. I、更優(yōu)選O. 03到O. 07之間和甚至更優(yōu)選約O. 05的MOI接種細(xì)胞培養(yǎng)管。在待產(chǎn)生的正痘病毒是VV的另一具體實(shí)施方案中，VV優(yōu)選以O(shè). 0001到O. I和更優(yōu)選約O. 0001的MOI接種細(xì)胞培養(yǎng)管。培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞(來(lái)自步驟b))直至產(chǎn)生子代正痘病毒的步驟c)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。當(dāng)包裝細(xì)胞是CEF時(shí)，在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)感染的CEF的步驟c)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基可以與用于制備所述CEF培養(yǎng)物(即步驟a)期間)的細(xì)胞培養(yǎng)基和用正痘病毒感染所述CEF培養(yǎng)物(即步驟b)期間)的細(xì)胞培養(yǎng)基相同或不同。根據(jù)本發(fā)明使用 的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選不含動(dòng)物產(chǎn)物。已經(jīng)描述了許多不含動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基，如先前所述，其中一些可商購(gòu)獲得。根據(jù)本發(fā)明，感染的CEF的培養(yǎng)是在Basal Medium Eagle細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)中進(jìn)行的。感染的CEF優(yōu)選培養(yǎng)I到6天,更優(yōu)選2到4天,和甚至更優(yōu)選3天。感染的CEF優(yōu)選在低于37°C、優(yōu)選30°C到36. 5°C的溫度培養(yǎng)。在一或多種核酸酶(即核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶)存在下進(jìn)行步驟d)的溫育以便降解溶液中存在的核酸(例如DNA;RNA)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用的核酸酶是核酸內(nèi)切酶?；谒鼈兊牡孜锟梢詫⒑怂醿?nèi)切酶如下分類(lèi)脫氧核糖核酸酶(DNase)，其降解DNA ;核糖核酸酶(RNase)，其降解RNA ；和核酸內(nèi)切酶，其降解DNA和RNA。核酸內(nèi)切酶DNase包括但不限于DNase I7DNase II和脫氧核糖核酸內(nèi)切酶IV。核酸內(nèi)切酶RNase包括但不限于RNase I, RNase III，RNAse E，RNAse F和RNAse P。降解DNA和RNA的核酸內(nèi)切酶包括但不限于Benzonase 。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在存在Benzonase 的條件下進(jìn)行溫育步驟c)產(chǎn)生的正痘病毒的步驟d)。Benzonase 通過(guò)水解特定核苷酸之間的內(nèi)部磷酸二酯鍵來(lái)降解核酸(例如DNA ；RNA)。完全消化后,溶液中存在的所有游離核酸(例如DNA ；RNA)被還原為5'-單磷酸為末端的寡核苷酸，長(zhǎng)度為3到8個(gè)堿基。Benzonaze 沒(méi)有蛋白水解活性。本發(fā)明使用的Benzonaze .優(yōu)選是藥學(xué)上可接受的。藥學(xué)上可接受的Benzonaze 可商購(gòu)獲得(例如Eurogentec,索引 ME-0280-10 ；Merck,索引例如 I. 01653. 0001)。根據(jù)本發(fā)明用于核酸酶作用的優(yōu)選條件是(如實(shí)施例I所述)-在7.O到9. O、優(yōu)選7. 5到8. 5和更優(yōu)選8. O的pH ;-選自Mg2+和Mn2+優(yōu)選Mg2+的輔因子的濃度范圍是ImM到2mM，優(yōu)選2mM。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，核酸酶在22°C到28°C的溫度下溫育，優(yōu)選在23°C到270C的溫度、更優(yōu)選在24°C到26°C的溫度和甚至更優(yōu)選在25°C的溫度溫育(如實(shí)施例I所述)。在該實(shí)施方案中，步驟d)的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選I到5小時(shí)，更優(yōu)選為2小時(shí)(如實(shí)施例I所述)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，核酸酶在2°C到8°C的溫度下溫育，優(yōu)選在3°C到7°C的溫度、更優(yōu)選在4°C到6°C的溫度和甚至更優(yōu)選在5°C的溫度溫育。在該實(shí)施方案中，步驟d)的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選10到20小時(shí)之間，更優(yōu)選為18小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，步驟d)使用的核酸酶濃度范圍是5U/ml到100U/ml，優(yōu)選范圍是5U/ml到50U/ml,和更優(yōu)選是10U/ml。如圖I所不，與使用50U/ml Benzonase 相比，在相同條件下使用10U/ml Benzonase 出人意料地導(dǎo)致處理2小時(shí)后(25°C的溫度；2mM Mg2+ ；pH8) DNA濃度同等降低。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟d)進(jìn)一步包括添加一或多種去污劑。去污劑包括但不限于Tween，Triton X-100 (九乙二醇辛基苯酚醚)，皂苷，SDS, Brij 96，聚多卡醇，N-辛基β-D-批喃葡萄糖苷和碳酸鈉。步驟d)使用的優(yōu)選去污劑是Tween。Tween包括但不限于Tween 20 (聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯)，Tween 80 (聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)和Tween 85 (聚氧乙烯失水山梨糖醇三油酸酯)。步驟d)使用的優(yōu)選Tween是Tween 80。根據(jù)本發(fā)明，步驟d)使用的去污劑濃度范圍是10 μ g/L到100 μ g/L，優(yōu)選范圍是 10 μ g/L 到 55μ g/L。
然后從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收產(chǎn)生的并且之前用核酸酶處理過(guò)的正痘病毒。當(dāng)從包裝細(xì)胞回收正痘病毒(即只從包裝細(xì)胞，或從包裝細(xì)胞和上清液)時(shí)，步驟e)之前可以是破壞包裝細(xì)胞膜的步驟。該步驟導(dǎo)致從包裝細(xì)胞釋放正痘病毒。包裝細(xì)胞膜的破壞可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)誘導(dǎo)。這些技術(shù)包括但不限于冷凍/解凍，低滲裂解，超聲處理(通過(guò)使用超聲發(fā)生器)和微流化(通過(guò)使用微流化器)。超聲發(fā)生器可商購(gòu)得自例如Heraeus PSP, Biologies, Misonix或GlenMills。本發(fā)明使用的優(yōu)選超聲發(fā)生器是S0NITUBE 20kHz型SM 20-120-3，SONITUBE 36kHz型SM35/3WU 和 S0NITUBE 35kHz 型 SM 35-400-3 (Heraeus PSP)。微流化器可商購(gòu)得自例如Microfluidics Corporation。還可以通過(guò)使用SLM Aminco French破碎儀破壞包裝細(xì)胞膜。還可以使用高速勻漿器破壞包裝細(xì)胞膜。高速勻漿器可商購(gòu)得自例如SilversonMachines 或 Ika-Labotechnik。本發(fā)明使用的優(yōu)選高速勻衆(zhòng)器是 SILVERSON L4R (SiIversonMachines) 0破壞包裝細(xì)胞膜后獲得的混合物可以在攪拌條件下進(jìn)一步溫育至少I(mǎi)小時(shí)以允許先前添加(在步驟d))的核酸酶降解從包裝細(xì)胞釋放的核酸(例如DNA)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，因此步驟e)之前是I.允許破壞包裝細(xì)胞膜的步驟，優(yōu)選通過(guò)使用高速勻漿器或通過(guò)超聲處理；和2.將步驟I)獲得的混合物溫育至少I(mǎi)小時(shí)的步驟，以允許在步驟d)添加的核酸酶降解從包裝細(xì)胞釋放的核酸(例如DNA)。根據(jù)本發(fā)明，步驟2)的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選在I到5小時(shí)之間，更優(yōu)選是2小時(shí)(如實(shí)施例I所述)。根據(jù)本發(fā)明，在步驟2)期間核酸酶(先前添加的(在步驟d))在22°C到28°C之間的溫度下溫育，優(yōu)選在23°C到27°C之間的溫度、更優(yōu)選在24°C到26°C之間的溫度和甚至更優(yōu)選在25°C的溫度溫育(如實(shí)施例I所述)。將一價(jià)鹽添加到步驟e)回收的正痘病毒的步驟f)允許在合適條件下-抑制核酸酶活性；和-避免正痘病毒吸附到步驟g)的陰離子交換吸附劑上，即避免超過(guò)10%的正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑上。因此在步驟g)將只有核酸(例如DNA)吸附到陰離子交換吸附劑上?！獌r(jià)鹽包括但不限于NaCl和KCl。步驟f)使用的優(yōu)選一價(jià)鹽是NaCl。根據(jù)本發(fā)明，步驟f)的一價(jià)鹽濃度范圍是200mM到300mM，優(yōu)選250mM或300mM。根據(jù)本發(fā)明，步驟
f)在7. O到9. O之間的pH、優(yōu)選在7. 5到8. 5之間的pH、更優(yōu)選在8. O的pH下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，將一價(jià)鹽添加到步驟e)回收的正痘病毒的步驟f)優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例I描述的條件進(jìn)行，其中使用PH 8. O的NaCl 250mM或更優(yōu)選300mM。將步驟f)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸的步驟g)允許在合適條件下捕獲所述混合物中包含的核酸(例如DNA)。由于在步驟f)進(jìn)行的處理，正痘病毒不被陰離子交換吸附劑所捕獲。根據(jù)本發(fā)明，步驟g)在7. O到9. O之間的pH、優(yōu)選在7. 5到8. 5之間的pH下、更優(yōu)選在8. O的pH下進(jìn)行(如實(shí)施例I所述)。
根據(jù)本發(fā)明，步驟g)的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選在I到3小時(shí)之間，更優(yōu)選是I小時(shí)(如實(shí)施例I所述)。根據(jù)本發(fā)明，步驟g)使用的陰離子交換吸附劑的官能團(tuán)是伯氨基，仲氨基，叔氨基和季氨基，如例如二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)，三乙基氨乙基(TEAE)，基團(tuán)-R-CH (OH) -CH2-N+- (CH3) 3 (也稱(chēng)為Q基；參見(jiàn)Streamline 樹(shù)脂，Pharmacia)和其它基團(tuán)如例如聚乙烯亞胺(PEI)，其在7. O到9. O的PH范圍內(nèi)已經(jīng)具有或?qū)⒕哂姓降恼姾?。步驟g)使用的優(yōu)選的陰離子交換吸附劑的官能團(tuán)選自二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)和三乙基氨基乙基(TEAE)，更優(yōu)選三甲基氨基乙基(TMAE)。步驟g)使用的陰離子交換吸附劑可以包括例如珠形式基質(zhì)或膜。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟g)使用的陰離子交換吸附劑包括珠形式基質(zhì)?；|(zhì)可以是例如瓊脂糖，親水聚合物，纖維素，葡聚糖或硅石。鏈(例如葡聚糖鏈)與基質(zhì)偶聯(lián)。先前描述的官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)穩(wěn)定鍵(例如醚鍵)與鏈連接。珠形式基質(zhì)的優(yōu)選官能團(tuán)是三甲基氨基乙基(TMAE)。根據(jù)本發(fā)明，珠形式基質(zhì)的珠具有比用于凈化步驟h)的濾器孔徑更大的直徑。因此珠形式基質(zhì)的珠優(yōu)選具有大于8 μ m的直徑，更優(yōu)選50 μ m到150 μ m的直徑，更優(yōu)選90 μ m到120 μ m的直徑，和甚至更優(yōu)選為120 μ m的直徑?；诒景l(fā)明的現(xiàn)有特征，正痘病毒(具有200-300nm的直徑)在凈化步驟h)期間將通過(guò)濾器的孔徑(即正痘病毒將在流過(guò)物中回收)。包括本發(fā)明所用珠形式基質(zhì)中的陰離子交換吸附劑優(yōu)選是可高壓消毒的。包括珠形式基質(zhì)的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑已被描述，其中一些可商購(gòu)獲得，如例如UNOsphere Q (BioRad)，UNOsphere S (BioRad)，STREAMLINE Q Sepharose XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE SP Sepharose XL (AmershamBiosciences) 或BioSepra Q hyperZ(Pall Corporation)。包括本發(fā)明珠形式基質(zhì)的優(yōu)選可高壓消毒的陰離子交換吸附劑是UNOsphere Q (BioRad)。UNOsphere Q(BioRad)包括親水球形聚合珠，具有120 μ m的直徑，并帶有三甲基氨基乙基(TMAE)官能團(tuán)。將步驟f)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑(其中所述交換吸附劑包括珠形式基質(zhì))接觸的步驟g)優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例I描述的條件進(jìn)行，其中使用UNOsphere Q(BioRad)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟g)使用的陰離子交換吸附劑包括膜。膜的官能團(tuán)可以如先前描述。膜的優(yōu)選官能團(tuán)是三甲基氨基乙基(TMAE)。根據(jù)本發(fā)明，膜具有大于正痘病毒直徑(即200nm)的孔徑。因此將在流過(guò)物中回收正痘病毒。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的膜具有I μ m到5 μ m的孔徑，優(yōu)選孔徑為3 μ m。包括本發(fā)明所用膜的陰離子交換吸附劑優(yōu)選是可高壓消毒的。包括膜的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑已被描述，其中一些可商購(gòu)獲得，如例如Sartobind 75Q (Sartorius), CUNO PolyNet Filters (例如 PolyNet PB P010, P020, P030, P050)或 CUNO Betapure Filters (例如 Betapure Z13-020, Z13-030, Z13-050)。包括本發(fā)明膜的優(yōu)選的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑是Sartobind 75Q (Sartorius)。當(dāng)利用膜形式的陰離子交換吸附劑進(jìn)行步驟g)時(shí)，不需要下列凈化步驟h)(允許去除細(xì)胞碎片)。細(xì)胞碎片被膜(具有Iym到5μπ ι的孔徑，優(yōu)選孔徑為3μπι)截留。在合適條件下將步驟g)獲得的混合物凈化的步驟h)允許去除細(xì)胞碎片。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選通過(guò)深度過(guò)濾進(jìn)行步驟h)的凈化。深度過(guò)濾包括但不限于使用一或多種商購(gòu)可獲得的產(chǎn)品，如來(lái)自Sartorius的Sartopure 濾器(例如Sartopure PP2)，CUNOIncorporated AP系列深度濾器(例如APOI), CUNO Incorporated CP系列深度濾器(例如CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90)，CUNO Incorporated HP 系列深度濾器(例如 HP10，HP30, HP50, HP60, HP70, HP90)，CUNO Incorporated Calif.系列深度濾器(例如 CA10，CA30, CA50, CA60, CA70, CA90)，CUNO Incorporated SP 系列深度濾器(例如 SP10, SP30,SP50，SP60，SP70，SP90)，CUNO Delipid and Delipid Plus 濾器，Millipore CorporationCE 系列深度濾器(例如 CE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75)，Millipore Corporation DE 系列深度濾器(例如 DE25，DE30，DE35，DE40，DE45，DE50，DE55，DE560, DE65, DE70, DE75)，Millipore Corporation HC 濾器(例如 A 1HC, B1HC, C0HC)，CUNO PolyNet Filters (例如 PolyNet PB P050, P100, P200, P300, P400, P500, P700)，Millipore Clarigard and Polygard 濾器，CUNO Life Assure 濾器，ManCel Associates深度濾器(例如 PR 12UP，PR12，PR 5UP);和 PALL 或 SeitzSchenk Incorporated 濾器。為了提高可用深度過(guò)濾裝置的凈化能力，將兩個(gè)或更多個(gè)孔徑減小的單元偶聯(lián)是有用的。在這種實(shí)施方案中，待凈化混合物通過(guò)第一深度過(guò)濾單元(其中最大的污染物被截留)，隨后通過(guò)第二深度過(guò)濾單元。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟h)的凈化通過(guò)深度過(guò)濾進(jìn)行，優(yōu)選在孔徑為8μπι的濾器(與孔徑為5μπι的濾器偶聯(lián))上進(jìn)行。本發(fā)明使用的具有孔徑為8 μ m和5 μ m的優(yōu)選濾器是由Sartorius商品化供應(yīng)的Sartopure 濾器(Sartopure PP2)。深度過(guò)濾可以按照至少I(mǎi)L/分鐘的流速進(jìn)行，優(yōu)選流速為IL/分鐘。根據(jù)本發(fā)明，步驟h)在7. O到9. O的pH、優(yōu)選在7. 5到8. 5的pH、更優(yōu)選在8. O的pH下進(jìn)行。將步驟g)獲得的混合物凈化的步驟h)優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例I描述的條件進(jìn)行，其中所述凈化通過(guò)在具有8 μ m孔徑的濾器(與具有5 μ m孔徑的濾器偶聯(lián))上深度過(guò)濾進(jìn)行，流速為IL/分鐘。在凈化步驟h)期間正痘病毒(直徑為200_300nm)穿過(guò)濾器的孔徑。因此將在流過(guò)物中回收正痘病毒。用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑的步驟i)允許在合適條件下回收流過(guò)物中剩余的正痘病毒。使用的一價(jià)鹽包括但不限于NaCl和KCl。步驟i)使用的優(yōu)選一價(jià)鹽是NaCl。根據(jù)本發(fā)明，步驟i)使用的一價(jià)鹽濃度范圍是200mM到300mM，優(yōu)選250mM或300mM。根據(jù)本發(fā)明，步驟i)在7. O到9. O的pH、優(yōu)選在7. 5到8. 5的pH、更優(yōu)選在8. O的pH下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟i)中包括一價(jià)鹽的溶液是藥學(xué)上可接受的溶液，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸鈉和50mM NaCl, pH 8.0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg)(即S08緩沖液)。根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟i)中包括一價(jià)鹽的溶液是藥學(xué)上可接受的溶液，包括例如Tris緩沖液,三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液。用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑的步驟i)優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例I描述的條件進(jìn)行，其中利用S08藥學(xué)上可接受的緩沖液(包括NaCl 250mM，或更優(yōu)選300mM)進(jìn)行清洗。濃縮步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物的步驟j)允許清除所述流過(guò)物級(jí)分中存在的蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮步驟j)通過(guò)微量過(guò)濾進(jìn)行。微量過(guò)濾是壓力驅(qū)動(dòng)的膜方法，其濃縮和純化大分子。更具體地，溶液穿過(guò)濾器，其孔徑已被選擇以拒絕保留物中的正痘病毒并允許小分子(例如蛋白)穿過(guò)濾器進(jìn)入滲透物中。微量過(guò)濾降低提取液的體積。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，因此使用具有以下孔徑的濾器進(jìn)行微量過(guò)濾孔徑小于O. 2 μ m，優(yōu)選孔徑在O. 09 μ m到O. 15 μ m之間,和更優(yōu)選孔徑為O. I μ m。本發(fā)明使用的濾器優(yōu)選是可高 壓消毒的。步驟j)使用的可高壓消毒的濾器可商購(gòu)獲得，例如Prostak MicrofiltrationModules (Millipore),其中優(yōu)選 Prostak Microfiltration Module PSVVAG021, PSVVAG041和SK2P12E1。濃縮步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物的步驟j)優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例I描述的條件進(jìn)行，其中通過(guò)在孔徑為O. I μ m的濾器上微量過(guò)濾進(jìn)行濃縮。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮步驟j)通過(guò)超濾進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，超濾優(yōu)選是交叉流過(guò)濾。交叉流過(guò)濾的原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見(jiàn)例如Richards, G. P. and Goldmintz,D. , J. Virol. Methods (1982),4 (3), pages 147-153. " Evaluation of a cross-flowfltration technique for extraction of polioviruses from inoculated oystertissue homogenates")。將步驟j)獲得的包括正痘病毒的級(jí)分(例如當(dāng)已經(jīng)通過(guò)微量過(guò)濾或超濾進(jìn)行濃縮步驟k)時(shí)的保留物)進(jìn)行滲濾的步驟k)是微量過(guò)濾的改進(jìn)，涉及用溶液稀釋包括正痘病毒的所述級(jí)分以降低所述級(jí)分中雜質(zhì)的濃度。包括正痘病毒的級(jí)分的稀釋允許從所述級(jí)分清洗掉更多雜質(zhì)。應(yīng)理解滲濾可以采用批量方式，半連續(xù)方式，或連續(xù)方式進(jìn)行。滲濾步驟k)可有利地用于改變其中包括正痘病毒的緩沖液。例如，它可用于利用藥學(xué)上可接受的緩沖液來(lái)替換純化過(guò)程使用的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，使用具有以下孔徑的濾器來(lái)進(jìn)行微量過(guò)濾孔徑小于O. 2 μ m，優(yōu)選孔徑在O. 09 μ m到O. 15 μ m之間，和更優(yōu)選孔徑為O. I μ m。本發(fā)明使用的濾器優(yōu)選是可高壓消毒的。步驟k)使用的可高壓消毒的濾器可商購(gòu)獲得，例如 Prostak Microfiltration Modules (Millipore),其中優(yōu)選 Prostak MicrofiltrationModule PSVVAG021，PSVVAG041和SK2P12E1。將步驟j)獲得的包括正痘病毒的級(jí)分滲濾的步驟k)優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例I描述的條件進(jìn)行，其中在孔徑為O. I μ m的濾器上進(jìn)行滲濾。濃縮步驟j)和滲濾步驟k)可以有利地利用相同類(lèi)型的濾器完成。本發(fā)明的當(dāng)前方法A還可以包括I.凝膠過(guò)濾步驟(即步驟I));和2.滲濾步驟(即步驟m))。凝膠過(guò)濾步驟(即步驟I):根據(jù)本發(fā)明，步驟k)獲得的樣品在包括珠的固相支持物上進(jìn)行處理，所述珠的直徑在3 μ m到160 μ m之間，有利地在80 μ m到160 μ m之間，優(yōu)選在40 μ m到105 μ m之間，更優(yōu)選在25 μ m到75 μ m之間，更優(yōu)選在20 μ m到80 μ m之間，和甚至更優(yōu)選在20 μ m到60 μ m之間。根據(jù)本發(fā)明，所述支持物具有接近于正痘病毒直徑的孔隙(即200nm-300nm)以便后者不滲入珠。另一方面，大小更小的分子滲入珠，其遷移被減慢。用于步驟I)凝膠過(guò)濾的支持物可以基于例如瓊脂糖，葡聚糖，丙烯酰胺，硅石，乙二醇/甲基丙烯酸共聚物，或其混合物，如例如瓊脂糖和葡聚糖的混合物。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用不含官能團(tuán)的支持物。凝膠過(guò)濾層析支持物可商購(gòu)獲得，如例如■乙二醇/甲基丙烯酸凝膠過(guò)濾層析支持物(例如Toyopearl HW 55,Toyopearl HW 65 和 Toyopearl HW 75,具有在 20 μ m 到 60 μ m 之間的珠直徑，Tosohaas)；■烯丙基葡聚糖/亞甲基雙丙烯酰胺凝膠過(guò)濾層析支持物(例如S印hacryl S300HR，具有在25μπι到75 μ m之間的珠直徑；Sephacry I S400HR，具有在25 μ m到75 μ m 之間的珠直徑；SephacryI S500HR,具有在25 μ m至Ij 75 μ m之間的珠直徑；SephacryI S1000SF，具有在40μπι至Ij 105 μ m之間的珠直徑，全部購(gòu)自Pharmacia)；■ N-丙烯酰胺輕基丙二醇凝膠過(guò)濾層析支持物(例如Trisacryl,具有在80 μ m到160 μ m之間的珠直徑，Biosepra)；■瓊脂糖凝膠過(guò)濾層析支持物(例如Macro-Prep SE,具有在20 μ m到80 μ m之間的珠直徑，Bio-Rad)。乙二醇/甲基丙烯酸凝膠過(guò)濾層析支持物(例如Toyopearl HW 55，Toyopearl HW 65和Toyopearl 服75，具有在20 μ m到60 μ m之間的珠直徑，Tosohaas)是優(yōu)選的。本發(fā)明用于凝膠過(guò)濾步驟I)的優(yōu)選條件是-一價(jià)鹽，選自NaCl和KCl，優(yōu)選NaCl，濃度范圍是200mM到2M，優(yōu)選范圍是200mM到1M，和更優(yōu)選為500mM ；-在7.O到9. O之間的pH，優(yōu)選在7. 5到8. 5之間，和更優(yōu)選8. O的pH。滲濾步驟m)按照先前在滲濾步驟k)中描述的方式和條件進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，先前描述的方法A的步驟f)到步驟I)中的每個(gè)步驟之前可以是在存在一或多種穩(wěn)定劑下溫育包括正痘病毒的樣品的步驟。如本文所用，“穩(wěn)定劑”是指允許保存正痘病毒的物質(zhì)。穩(wěn)定劑包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水蘇糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤蘚醇，蘇糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；賴(lài)氨酸；精氨酸；天冬氨酸；纈氨酸；谷氨酸)，去污劑(例如Triton X-100 ;Tween如例如Tween
20,Tween 80或Tween 85)和鹽(例如NaCl ;KC1)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用于該溫育步驟的穩(wěn)定劑是糖，更優(yōu)選是蔗糖。根據(jù)本發(fā)明，用于該溫育步驟的蔗糖濃度范圍是25g/L到100g/L，優(yōu)選50g/L。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在包含藥學(xué)上可接受的溶液的溶液中，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸鈉和50mM NaCl，pH 8.0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg)(即S08緩沖液)。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括例如Tris緩沖液，三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在條件下的該溫育步驟是在以下PH進(jìn)行的7. O到9. O之間，優(yōu)選7. 5到8. 5之間，和更優(yōu)選為8. O的pH。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在條件下該溫育步驟的持續(xù)時(shí)間是I小時(shí)到20小時(shí)之間，更優(yōu)選為18小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在條件下的該溫育步驟是在2到8 °C之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在3°C到7 °C之間的溫度、更優(yōu)選在4°C到6°C之間的溫度和甚至更優(yōu)選為5°C的溫度下進(jìn)行。在穩(wěn)定劑存在條件下的該溫育步驟優(yōu)選如實(shí)施例I所述，在5°C的溫度、存在50g/L蔗糖的條件下進(jìn)行18小時(shí)。根據(jù)如先前描述的本發(fā)明方法A的另一個(gè)實(shí)施方案，在從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e)之后進(jìn)行凈化步驟(步驟h))。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，不進(jìn)行在合適條件下向步驟e)回收的正痘病毒中添加一價(jià)鹽以抑制核酸酶活性并避免步驟g)中所述正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑的步驟f)。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，因此本發(fā)明還涉及一種用于產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正 痘病毒的方法(即方法B)，包括下列步驟)制備包裝細(xì)胞的培養(yǎng)物；b/ )用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物；c,)培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒；(T)在一或多種核酸酶存在下溫育；e')從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒；f,)在存在以下試劑的條件下溫育步驟e')回收的正痘病毒I. 一或多種能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)，和任選存在的2. 一或多種穩(wěn)定劑。g')在合適條件下將步驟f')獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以捕獲正痘病毒和核酸；h')在合適條件下將步驟g')獲得的混合物凈化以去除細(xì)胞碎片；)用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒；j')濃縮步驟i')獲得的混合物；k')將步驟j')獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾。制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟a')是指先前描述的制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟a)。用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟b')是指先前描述的用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟b)。培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒的步驟c')是指先前描述的培養(yǎng)感染細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒的步驟c)。在一或多種核酸酶存在下的溫育步驟cT )是指先前描述的在一或多種核酸酶存在下的溫育步驟d)。從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e')是指先前描述的從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e)。然后步驟e')中回收的正痘病毒在存在以下的條件下溫育(步驟f’ ))I. 一或多種能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)，和任選存在的2. 一或多種穩(wěn)定劑。
能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)包括但不限于螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA) ;二亞乙基三胺五乙酸(DTPA);次氨基三乙酸(NTA))，一價(jià)鹽(例如NaCl或KC1)，蛋白酶，磷酸鹽，一價(jià)陽(yáng)離子(例如Na+ ；Li+ ；K+ ；Ag+)，鹽酸胍和硫酸銨。螯合劑如例如EDTA，DTPA或NTA除去金屬離子(例如Mg2+ ;Mn2+)，如前所述，所述金屬離子構(gòu)成核酸酶活性的必需輔因子。濃度在50mM到150mM之間(優(yōu)選為大約IOOmM)的一價(jià)鹽(例如NaCl或KCl)導(dǎo)致核酸酶滅活。濃度在大約IOOmM或以上的磷酸鹽和/或一價(jià)陽(yáng)離子(例如Na+ ；Li+ ；K+ ；Ag+)導(dǎo)致核酸酶滅活。濃度高于IOOmM的鹽酸胍和硫酸銨導(dǎo)致核酸酶滅活。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟f,)中能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)是螯合劑，更優(yōu)選是乙二胺四乙酸(EDTA)。根據(jù)本發(fā)明，步驟f')中使用的EDTA濃度范圍是5mM到20mM，優(yōu)選是10mM。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟Γ )中能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)是一價(jià)鹽，優(yōu)選NaCl，更優(yōu)選NaCl 100mM。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟f')中能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)是一價(jià)鹽和螯合劑，優(yōu)選NaCl和EDTA，更優(yōu)選NaCl IOOmM和EDTA IOmM (如實(shí)施例4所述)。根據(jù)本發(fā)明，步驟f')在7. O到9. O的pH下進(jìn)行，優(yōu)選在7. 5到8. 5、更優(yōu)選在 8.O的pH進(jìn)行(如實(shí)施例4所述)。根據(jù)本發(fā)明，步驟f')是在2 V到8 V之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在3 V到7 V之間的溫度、更優(yōu)選在4°C到6°C之間的溫度和甚至更優(yōu)選為5°C的溫度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，步驟r )的持續(xù)時(shí)間在5分鐘到20小時(shí)之間。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟P )的持續(xù)時(shí)間在2到20小時(shí)之間，優(yōu)選18小時(shí)。在該實(shí)施方案中，除了能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)外(如先前所述)，還在一或多種穩(wěn)定劑存在的條件下溫育步驟e')中獲得的正痘病毒。步驟f,)中的“穩(wěn)定劑”是指所述步驟f,)用能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)處理期間允許保存正痘病毒的物質(zhì)。穩(wěn)定劑包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水蘇糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤蘚醇，蘇糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；賴(lài)氨酸；精氨酸；天冬氨酸；纈氨酸；谷氨酸)，去污劑(例如Triton X-100 ；Tween,如例如Tween 20, Tween 80或Tween 85)和鹽(例如NaCl ;KC1)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用于步驟Γ )的穩(wěn)定劑是糖，優(yōu)選蔗糖。根據(jù)本發(fā)明，用于步驟Γ )的蔗糖濃度范圍是25g/L到100g/L，優(yōu)選50g/L。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括IOOmMTris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸鈉和50mM NaCl，pH 8.0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg)(即S08緩沖液)。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括例如Tris緩沖液，三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液。將步驟f,)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸的步驟g')允許在合適條件下捕獲所述正痘病毒以及同樣含在所述混合物中的核酸(例如DNA)。根據(jù)本發(fā)明，步驟g')在7. O到9. O之間的pH下進(jìn)行，優(yōu)選在7. 5到8. 5、更優(yōu)選在8. O的pH下進(jìn)行(如實(shí)施例4所述)。根據(jù)本發(fā)明，步驟g')的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選在I到3小時(shí)之間，更優(yōu)選I小時(shí)(如實(shí)施例4所述)。根據(jù)本發(fā)明，步驟g')使用的陰離子交換吸附劑的官能團(tuán)是伯氨基，仲氨基，叔氨基和季氨基，如例如二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)，三乙基氨基乙基(TEAE)，基團(tuán)-R-CH(OH)-CH2-N+-(CH3)3(也稱(chēng)為Q基；參見(jiàn)Streamline 樹(shù)脂，Pharmacia)和其它基團(tuán)如例如聚乙烯亞胺(PEI)，其在7. O到9. O的pH范圍內(nèi)已經(jīng)具有或?qū)⒕哂姓降恼姾?。步驟g,)使用的優(yōu)選的陰離子交換吸附劑的官能團(tuán)選自二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)和三乙基氨基乙基(TEAE)，更優(yōu)選三甲基氨基乙基(TMAE)。步驟g')使用的陰離子交換吸附劑可以包括例如珠形式基質(zhì)或膜。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟g')使用的陰離子交換吸附劑包括珠形式基質(zhì)。基質(zhì)可以是例如瓊脂糖，親水聚合物，纖維素，葡聚糖或硅石。鏈(例如葡聚糖鏈)與基質(zhì)偶聯(lián)。先前描述的官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)穩(wěn)定鍵(例如醚鍵)與鏈連接。珠形式基質(zhì)的優(yōu)選官能團(tuán)是三甲基氨基乙基(TMAE)。根據(jù)本發(fā)明，珠形式基質(zhì)的珠具有比用于凈化步驟h')的濾器孔徑更大的直徑。因此珠形式基質(zhì)的珠優(yōu)選具有大于8 μ m的直徑，更優(yōu)選在50 μ m到150 μ m之間的直徑，更優(yōu)選在90 μ m到120 μ m之間的直徑和甚至更優(yōu)選120 μ m的直徑?；诒景l(fā)明的當(dāng)前特征，在凈化步驟h')期間吸附正痘病毒的珠形式基質(zhì)的珠以及細(xì)胞碎片將被濾器保留。包括本發(fā)明所用珠形式基質(zhì)的陰離子交換吸附劑優(yōu)選是可高壓消毒的。 包括珠形式基質(zhì)的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑已經(jīng)被描述，其中一些可商購(gòu)獲得，如例如UNOsphere Q (BioRad), UNOsphere s (BioRad), STREAMLINE Q Sepharose XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE SP Sepharose XL (Amersham Biosciences)或BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)。包括本發(fā)明珠形式基質(zhì)的優(yōu)選的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑是 UNOsphere Q (BioRad)和 BioSepra Q hyperZ (Pal ICorporation)。 UNOsphere Q(BioRad)包括親水球形聚合珠，具有120 μ m的直徑并帶有三甲基氨基乙基(TMAE)官能團(tuán)。BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)包括非常致密和多孔的二氧化鋯珠，具有約75 μ m的直徑并帶有季胺Q(chēng)官能團(tuán)。將步驟f')獲得的混合物與陰離子交換吸附劑(其中所述交換吸附劑包括珠形式基質(zhì))接觸的步驟g')優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例4描述的條件進(jìn)行,其中使用BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟g')使用的陰離子交換吸附劑包括膜。膜的官能團(tuán)可以如先前描述。膜的優(yōu)選官能團(tuán)是三甲基氨基乙基(TMAE)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用于步驟^ )的膜具有Iym到5μπι的孔徑，優(yōu)選3μπι的孔徑。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，用于步驟g')的膜具有低于正痘病毒大小(即200nm)的孔徑，更具體為O. Ιμπι的孔徑。包括膜的許多陰離子交換吸附劑已經(jīng)被描述，其中一些可商購(gòu)獲得，如例如Sartobind 75Q (Sartorius)。本發(fā)明所用的包括膜的陰離子交換吸附劑優(yōu)選是可高壓消毒的。包括膜的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑已經(jīng)被描述，其中一些可商購(gòu)獲得，如例如Sartobind 75Q(Sart0riUS)。包括本發(fā)明膜的優(yōu)選的可高壓消毒的陰離子交換吸附劑是Sartobind 75Q (Sartorius)。當(dāng)利用陰離子交換膜形式的陰離子交換吸附劑進(jìn)行步驟g')時(shí)，不需要下列凈化步驟h')(允許去除細(xì)胞碎片)。細(xì)胞碎片已經(jīng)被用于步驟f')的陰離子交換膜保留(如先前所述)。將步驟g')獲得的混合物凈化的步驟h')是指先前描述的將步驟g)獲得的混合物凈化的步驟h)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，當(dāng)用珠形式基質(zhì)的陰離子交換吸附劑進(jìn)行步驟g')時(shí)，步驟h')之前可以是允許去除吸附正痘病毒的所述珠形式基質(zhì)的步驟。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，通過(guò)使用例如具有小于珠形式基質(zhì)珠大小的孔徑的濾袋進(jìn)行所述步驟。根據(jù)本發(fā)明，濾袋的孔徑在10 μ m到100 μ m之間，優(yōu)選在25 μ m到100 μ m之間，更優(yōu)選是50 μ m。本發(fā)明使用的濾袋優(yōu)選是可高壓消毒的?？筛邏合镜臑V袋已經(jīng)被描述，其中一些可商購(gòu)獲得，如例如 CUNO Felt Filter Bags (CUNO)，其中聚酯 Felt Filter Bags (例如 NB EES0010,0025，0050，0100)，聚酯 / 聚丙烯 Felt Filter Bags (例如 NB PES 0010，0025，0050，0100)和尼龍單絲 Felt Filter Bags (例如 NB NYS 0025，0050，0100)是優(yōu)選的。用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒的步驟i')允許從陰離子交換吸附劑回收捕獲的正痘病毒。使用的一價(jià)鹽包括但不限于NaCl和KC1。步驟i,)使用的優(yōu)選一價(jià)鹽是NaCl。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)優(yōu)選O到2. 5M、更優(yōu)選O到2M和甚至更優(yōu)選O到I. 5M范圍增加的一價(jià)鹽濃度梯度進(jìn)行洗脫。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)在低于IM(優(yōu)選在300mM到750mM之間，更優(yōu)選為500mM)的一價(jià)鹽濃度下的單步洗脫來(lái)進(jìn)行洗脫。根據(jù)本發(fā)明，步驟P )在7. O到9. O之間的pH下進(jìn)行，優(yōu)選在7. 5到8. 5、更優(yōu)選在8. O 的PH下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟i')中包括一價(jià)鹽的溶液是由藥學(xué)上可接受的溶液，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸鈉和50mM NaCl，pH 8.0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg)(即S08緩沖液)。根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟
)中包括一價(jià)鹽的溶液是藥學(xué)上可接受的溶液，包括例如Tris緩沖液，三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液。用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒的步驟P )優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例4描述的條件進(jìn)行，其中通過(guò)S08緩沖液中增加的NaCl濃度梯度(300mM ；400mM ；500mM)進(jìn)行洗脫。濃縮步驟i,)獲得的混合物的步驟j')允許清除所述流過(guò)物級(jí)分中存在的蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮步驟j')通過(guò)微量過(guò)濾進(jìn)行(如先前步驟j)中描述的)。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮步驟j')通過(guò)超濾進(jìn)行(如先前步驟j)中描述的)。將步驟j')中獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾的步驟k')是指先前描述的將步驟j)中獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾的步驟k)。本發(fā)明的當(dāng)前方法B可以進(jìn)一步包括I.凝膠過(guò)濾步驟(即步驟Γ ));和2.滲濾步驟(即步驟m' )) ο凝膠過(guò)濾步驟I')是指凝膠過(guò)濾步驟I)。滲濾步驟m')是指滲濾步驟m)。根據(jù)本發(fā)明，先前描述的方法B的步驟f')到步驟Γ )中的每個(gè)步驟之前可以是在一或多種穩(wěn)定劑存在下溫育包括正痘病毒的樣品的步驟。如本文所用，“穩(wěn)定劑”是指允許保存正痘病毒的物質(zhì)。穩(wěn)定劑包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水蘇糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤蘚醇，蘇糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；賴(lài)氨酸；精氨酸；天冬氨酸；繳氨酸；谷氨酸)，去污劑(例如Triton X-100 ；Tween,如例如Tween 20, Tween 80或Tween 85)和鹽(例如NaCl ;KC1)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用于該溫育步驟的穩(wěn)定劑是糖，更優(yōu)選是蔗糖。根據(jù)本發(fā)明，用于該溫育步驟的蔗糖濃度范圍是25g/L到100g/L，優(yōu)選是50g/L。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括IOOmM Tris-HCl,鹿糖5% (w/v), IOmM谷氨酸鈉和50mM NaCl,pH
8.O，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg)(即S08緩沖液)。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括例如Tris緩沖液，三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在下的該溫育步驟是在以下PH進(jìn)行在7.0到9.0之間，優(yōu)選在7. 5到8. 5之間，和更優(yōu)選為8. O的pH。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在下該溫育步驟的持續(xù)時(shí)間在I小時(shí)到20小時(shí)之間，更優(yōu)選為18小時(shí)。根 據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在下的該溫育步驟是在2°C到8°C之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在3°C到7°C之間的溫度、更優(yōu)選在4°C到6V之間的溫度和甚至更優(yōu)選在5°C的溫度下進(jìn)行。在穩(wěn)定劑存在下的該溫育步驟優(yōu)選在5°C的溫度、存在50g/L蔗糖的條件下進(jìn)行18小時(shí)。根據(jù)如先前描述的本發(fā)明方法B的另一個(gè)實(shí)施方案，在從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e')之后進(jìn)行凈化步驟(步驟h'))。本發(fā)明還涉及組合了先前描述的方法A的步驟和方法B的步驟的方法。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明更具體涉及一種用于產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正痘病毒的方法(即方法C)，包括下列步驟a")制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物；b")用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物；c")培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒；d")在一或多種核酸酶存在下溫育；e")從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒； ")在存在以下物質(zhì)的條件下溫育步驟e")回收的正痘病毒I. 一或多種能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)，和任選存在的2. 一或多種穩(wěn)定劑；g")在合適條件下將步驟f")獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以允許捕獲所述正痘病毒和核酸；h")在合適條件下將步驟g")獲得的混合物凈化以允許去除細(xì)胞碎片；i")用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒；j")向步驟i")洗脫的正痘病毒中添加一價(jià)鹽以避免步驟k")中所述正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑上；k")在合適條件下將步驟j")獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以允許捕獲核酸；I")在合適條件下用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑以回收流過(guò)物中剩余的正痘病毒；m")濃縮步驟I")獲得的流過(guò)物；η")將步驟m")獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾。制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟a")是指先前描述的制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟a)。
用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟b")是指先前描述的用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟b)。培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒的步驟c ")是指先前描述的培養(yǎng)感染細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒的步驟c)。在一或多種核酸酶存在下的溫育步驟d")是指先前描述的在一或多種核酸酶存在下的溫育步驟d)。從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e")是指先前描述的從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e)。在存在(I) 一或多種能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)和任選存在的(2) —或多種穩(wěn)定劑的條件下將步驟e")回收的正痘病毒溫育的步驟f")是指先前描述的在存在(I) 一或多種能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)和任選存在的(2) —或多種穩(wěn)定劑的條件下將步驟e')回收的正痘病毒溫育的步驟Γ )。
在合適條件下將步驟f")獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以允許捕獲所述正痘病毒和核酸的步驟g")是指先前描述的在合適條件下將步驟f,)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以允許捕獲所述正痘病毒和核酸的步驟g')。將步驟g")獲得的混合物凈化的步驟h")是指先前描述的將步驟g)獲得的混合物凈化的步驟h)。用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒的步驟i")是指先前描述的用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒的步驟P )。向先前在步驟i")中洗脫的正痘病毒中添加一價(jià)鹽的步驟j")允許在合適條件下避免步驟k")中所述正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑(即避免超過(guò)10%的正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑)。因此在步驟k")只有核酸(例如DNA)將吸附到陰離子交換吸附劑上。一價(jià)鹽包括但不限于NaCl和KCl。步驟j")使用的優(yōu)選一價(jià)鹽是NaCl。根據(jù)本發(fā)明，步驟j")的一價(jià)鹽濃度范圍是200mM到300mM，優(yōu)選是250mM或300mM。根據(jù)本發(fā)明，步驟j ")在7. O到9. O之間的pH下進(jìn)行，優(yōu)選在7. 5到8. 5、更優(yōu)選在8. O的pH下進(jìn)行。在合適條件下將步驟j")獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以允許捕獲核酸的步驟k")是指先前描述的在合適條件下將步驟f)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以允許捕獲核酸的步驟g)。在合適條件下用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑以回收流過(guò)物中剩余的正痘病毒的步驟I")是指先前描述的在合適條件下用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑以回收流過(guò)物中剩余的正痘病毒的步驟i)。將步驟I")獲得的流過(guò)物濃縮的步驟m")允許清除所述流過(guò)物級(jí)分中存在的蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮步驟m")通過(guò)微量過(guò)濾進(jìn)行(如先前步驟j)中描述的)。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮步驟m")通過(guò)超濾進(jìn)行(如先前步驟j)中描述的)。將步驟m")中獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾的步驟η")是指先前描述的將步驟j)中獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾的步驟k)。本發(fā)明的當(dāng)前方法C可以進(jìn)一步包括I.凝膠過(guò)濾步驟(即步驟O"));和
2.滲濾步驟(即步驟P"))。凝膠過(guò)濾步驟O ")是指凝膠過(guò)濾步驟I)。滲濾步驟P ")是指滲濾步驟m)。根據(jù)本發(fā)明，先前描述的方法C的從步驟f")到步驟P")的每一步(優(yōu)選從步驟k")到步驟P")的每一步)之前可以是在一或多種穩(wěn)定劑存在下溫育包括正痘病毒的樣品的步驟。如本文所用，“穩(wěn)定劑”是指允許保存正痘病毒的物質(zhì)。穩(wěn)定劑包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水蘇糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤蘚醇，蘇糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；賴(lài)氨酸；精氨酸；天冬氨酸；纈氨酸；谷氨酸)，去污劑(例如 Triton X-100 ;Tween,如例如 Tween20, Tween 80 或 Tween 85)和鹽(例如NaCl ;KC1)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用于該溫育步驟的穩(wěn)定劑是糖，更優(yōu)選是蔗糖。根據(jù)本發(fā)明，用于該溫育步驟的蔗糖濃度范圍是25g/L到100g/L，優(yōu)選是50g/L。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM 谷氨酸鈉和 50mM NaCl, pH 8. 0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg)(即 S08緩沖液)。根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定劑可以包括在由藥學(xué)上可接受的溶液組成的溶液中，包括例如Tris緩沖液，三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在下的該溫育步驟是在以下pH進(jìn)行的7. O到9. O之間，優(yōu)選7. 5到8. 5之間，更優(yōu)選為8. O的pH。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在下該溫育步驟的持續(xù)時(shí)間是I小時(shí)到20小時(shí)之間，更優(yōu)選為18小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，在穩(wěn)定劑存在下的該溫育步驟是在2°C到8°C之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在3°C到7°C之間的溫度、更優(yōu)選在4°C到6°C之間的溫度和甚至更優(yōu)選在5°C的溫度下進(jìn)行。在穩(wěn)定劑存在下的該溫育步驟優(yōu)選在5°C的溫度、存在50g/L蔗糖的條件下進(jìn)行18小時(shí)。根據(jù)如先前描述的本發(fā)明方法C的另一個(gè)實(shí)施方案，在從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒的步驟e")之后進(jìn)行凈化步驟(步驟h"))。根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的冷凍來(lái)保存本發(fā)明方法每一步驟后獲得的包括正痘病毒的樣品。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的方法是在以下pH進(jìn)行的7. O到9. O之間，優(yōu)選7. 5到8. 5之間，更優(yōu)選為8. O的pH。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，正痘病毒是痘苗病毒(VV)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的VV是例如專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/EP2008/009720 (W02009/065546,描述包括缺陷型I4L和/或F4L基因的VV)或 PCT/EP2008/009721 (W02009/065547,描述包括缺陷型 F2L 基因的 VV)所述的 W。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，正痘病毒是修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA) ο 本發(fā)明優(yōu)選的 MVA 是之前保藏于 Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM)保藏號(hào)為 N ° 1-721 的 MVA，MVA 575 (ECACC V00120707)和MVA-BN(ECACC V00083008)。術(shù)語(yǔ)“重組正痘病毒”是指包括插入其基因組的外源序列的正痘病毒。如本文所用，外源序列是指不是天然存在于親代正痘病毒中的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源序列編碼具有直接或間接細(xì)胞毒功能的分子?！爸苯踊蜷g接”細(xì)胞毒，我們是指外源序列編碼的分子本身是毒性的(例如蓖麻毒蛋白，腫瘤壞死因子(TNF)，白介素-2(IL2)，干擾素-ga_a (IFN Y )，核糖核酸酶，脫氧核糖核酸酶，假單胞菌外毒素A)或它可以被代謝形成毒性產(chǎn)物，或它可以作用于其它東西以形成毒性產(chǎn)物。Lamb等(Eur. J. Biochem.，1985，148,265-270)公開(kāi)了蓖麻毒蛋白cDNA的序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外源序列是自殺基因。自殺基因編碼能夠?qū)⑾鄬?duì)無(wú)毒前體藥物轉(zhuǎn)化為毒性藥物的蛋白。例如，胞嘧啶脫氨酶將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89，33);單純皰疹酶胸苷激酶使細(xì)胞對(duì)抗病毒劑更昔洛韋(GCV)或阿昔洛韋的處理敏感(Moolten(1986)Cancer Res. 46,5276 ；Ezzedine et al (1991)New Biol 3,608)?？梢允褂萌我馍矬w(例如大腸桿菌(E. coli)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的胞卩密唳脫氨酶。因此,在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，自殺基因編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白，更優(yōu)選是FCUl蛋白或FCU1-8蛋白，其被援引加入本文的專(zhuān)利申請(qǐng)WO 99/54481，W005/07857, PCT/EP2008/009720和PCT/EP2008/009721 涵蓋。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的優(yōu)選重組正痘病毒是
■ MVA-FCUl (參見(jiàn) TO 99/54481)，也稱(chēng)為 TG4023 ；■ MVA-FCU1-8 (參見(jiàn) W 05/07857);和■ vv-rcui，其中所述VV更具體包括缺陷型I4L和/或F4L基因，以及缺陷型J2R基因(參見(jiàn) PCT/EP2008/009720/W02009/065546 和 PCT/EP2008/009721/W02009/065547)。前體藥物/酶組合的其它實(shí)例包括Bagshawe等公開(kāi)的那些(W088/07378)，即各種燒化劑和假單胞菌屬CPG2酶，以及Epenetos&Rowlinson-Busza公開(kāi)的那些(W091/11201)，即生氰前體藥物(例如扁桃苷)和植物來(lái)源的beta-葡糖苷酶。可用于本發(fā)明這個(gè)實(shí)施方案的酶包括但不限于用于將含磷酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含硫酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)，它們可用于將含肽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物；碳水化合物切割酶，如beta-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶，用于將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；beta_內(nèi)酰胺酶，用于將beta-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于分別將在它們的胺氮用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物?？蛇x地，具有酶活性的抗體(本領(lǐng)域還稱(chēng)為抗體酶)可用于將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離活性藥物(Massey R.等，Nature, 1987, 328,457-458)。類(lèi)似地，前體藥物包括但不限于上文所列的前體藥物，例如含磷酸鹽前體藥物，含硫代磷酸鹽前體藥物，含硫酸鹽前體藥物，含肽前體藥物，D-氨基酸修飾前體藥物，糖基化前體藥物，含beta-內(nèi)酰胺前體藥物，任選地含取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選地含取代的苯乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶和其它可以被轉(zhuǎn)化的5-氟尿苷前體藥物?？梢匝苌鸀橛糜诒景l(fā)明的前體藥物形式的細(xì)胞毒藥物實(shí)例包括但不限于鬼臼亞乙苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，阿霉素，柔紅霉素，洋紅霉素，氨基蝶呤，更生霉素，絲裂霉素，順鉬和順鉬類(lèi)似物，博來(lái)霉素，埃斯波霉素(參見(jiàn)例如US 4，675，187)，5-氟尿嘧啶，苯丙氨酸氮芥和其它相關(guān)氮芥。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，外源基因編碼能夠切割靶RNA或DNA的核酶。待切割的靶RNA或DNA可以是對(duì)細(xì)胞功能必不可少的RNA或DNA，其切割導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或待切割的RNA或DNA可以是編碼不想要的蛋白(例如癌基因產(chǎn)物)的RNA或DNA，該RNA或DNA的切割可以防止細(xì)胞變?yōu)榘┬缘摹Ｔ谌匀贿M(jìn)一步的實(shí)施方案中，外源基因編碼反義RNA?！胺戳xRNA”表示與編碼蛋白的mRNA分子雜交并干擾其表達(dá)的RNA分子，或與細(xì)胞內(nèi)另一 RNA分子如前mRNA或tRNA或rRNA雜交的RNA分子，或與基因雜交并干擾其表達(dá)的RNA分子。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，外源序列取代靶細(xì)胞中缺陷型基因的功能。存在數(shù)千種哺乳動(dòng)物(包括人)的遺傳疾病(inherited genetic diseases),其由缺陷型基因造成。這類(lèi)遺傳疾病的實(shí)例包括囊性纖維化，其中已知存在CFTR基因突變；Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良，其中已知存在肌養(yǎng)蛋白基因突變；鐮刀形細(xì)胞 病，其中已知存在HbA基因突變。許多類(lèi)型的癌癥由缺陷型基因造成，尤其是原癌基因以及經(jīng)歷突變的腫瘤抑制基因。原癌基因的實(shí)例是ras，src, bcl等等；腫瘤抑制基因的實(shí)例是p53和Rb。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，外源序列編碼腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。TAA是指在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)出頻率或密度比相同組織類(lèi)型的非腫瘤細(xì)胞更高的分子。TAA的實(shí)例包括但不限于 CEA、MARTI、MAGEl、MAGE3、GP-100、MUCl (參見(jiàn) WO 92/07000，WO 95/09241 和Rochlitz 等 J Gene Med. 2003Aug ；5(8) :690_9，援引加入本文)、MUC2、點(diǎn)突變的 ras 癌基因、正?；螯c(diǎn)突變的 P53、過(guò)表達(dá)的 p53、CA-125、PSA、C_erb/B2、BRCA I、BRCA II、PSMA、酪氨酸酶、TRPl、TRP2、NY-ES0-1、TAG72、KSA、HER-2/neu、bcr-abl、pax3_fkhr、ews-fli-1、生存素(surviving)和LRP。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，TAA是MUCl。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，外源基因編碼抗原。如本文所用，“抗原”是指可以被抗體結(jié)合的配體；抗原自身無(wú)需是免疫原性的。優(yōu)選抗原來(lái)源于病毒如例如HIV-I (如gp120或gp 160)、貓免疫缺陷病毒、人或動(dòng)物皰疹病毒中的任何一種，如gD或其衍生物或立即早期蛋白如ICP27，來(lái)自HSVl或HSV2，巨細(xì)胞病毒(如gB或其衍生物)，水痘帶狀皰疹病毒(如gpl、II或III)或來(lái)自肝炎病毒如乙肝病毒(HBV)例如乙肝表面抗原或其衍生物，甲肝病毒(HAV)，丙肝病毒(HCV ;參見(jiàn)WO 04/111082 ;優(yōu)選來(lái)自基因型Ib菌株ja的非結(jié)構(gòu)HCV蛋白)，和戊肝病毒(HEV)，或來(lái)自其它病毒病原體，如呼吸道合胞病毒，人乳頭瘤病毒(HPV ;參見(jiàn) TO 90/10459，WO 95/09241，WO 98/04705, WO 99/03885W0 07/121894 和 WO07/121894 ;來(lái)自HPV16株的E6和E7蛋白是優(yōu)選的；還參見(jiàn)Liu等Proc Natl Acad Sci U
SA. 20040ct 5 ；101Suppl 2:14567-71)或流感病毒，或衍生自細(xì)菌病原體如沙門(mén)氏菌、奈瑟氏菌、疏螺旋體(例如OspA或OspB或其衍生物)，或衣原體，或博德特氏菌例如P. 69,PT和FHA，或衍生自寄生蟲(chóng)如瘧原蟲(chóng)或弓形蟲(chóng)。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，抗原選自HCV或HPV。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的優(yōu)選重組正痘病毒是MVA-HCV(參見(jiàn)WO04/111082)，也稱(chēng)為 TG4040。重組正痘病毒可以包括一種以上的外源序列，而每種外源序列可以編碼一種以上的分子。例如，將編碼例如TAA(如前所述)或抗原(如前所述)的外源序列與編碼細(xì)胞因子(例如白介素(IL，例如IL2);腫瘤壞死因子(TNF);干擾素-(IFN);集落刺激因子(CSF))的外源序列連接在相同重組正痘病毒中是有用的。就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的優(yōu)選重組正痘病毒是■ MVA-[MUC1-IL2](參見(jiàn) WO 92/07000 和 WO 95/09241)，也稱(chēng)為 TG4010 ;和■ MVA-[HPV-IL2](參見(jiàn) WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885，WO 07/121894 和 WO 07/121894)，也稱(chēng)為 TG4001。
有利地,重組正痘病毒進(jìn)一步包括表達(dá)外源序列必需的元件。表達(dá)必需的元件包括下組元件允許將核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為RNA和將mRNA翻譯為多肽的元件，特別是在被本發(fā)明重組正痘病毒感染的細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子序列和/或調(diào)節(jié)序列，和任選存在的允許所述多肽在細(xì)胞表面分泌或表達(dá)的序列。這些元件可以是誘導(dǎo)型或組成型的。當(dāng)然，啟動(dòng)子適合于挑選的重組正痘病毒和宿主細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，提及的有痘苗病毒啟動(dòng)子p7. 5KpH5R、pKlL、p28、pll或所述啟動(dòng)子的組合。文獻(xiàn)提供了大量有關(guān)這類(lèi)啟動(dòng)子序列的信息。此外，必需元件可以包括改良外源序列表達(dá)或其在宿主細(xì)胞中維持的額外元件。特別提及的可以是內(nèi)含子序列(W0 94/29471)，分泌信號(hào)序列，核定位序列，用于IRES型翻譯重啟動(dòng)的內(nèi)部位點(diǎn)，用于轉(zhuǎn)錄終止的polyA序列。本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒用做藥物組合物，優(yōu)選用做疫苗。如本文所用，“藥物組合物”是指包括藥學(xué)上可接受載體的組合物。所述藥學(xué)上可接受的載體優(yōu)選是等滲、低滲或弱高滲的，并具有相對(duì)低的離子強(qiáng)度，如例如蔗糖溶液。此夕卜，這類(lèi)載體可以包含任何溶劑，或水性或部分水性的液體如無(wú)熱原無(wú)菌水。此外，調(diào)節(jié)并 緩沖藥物組合物的PH以便滿足體內(nèi)使用的需要。藥物組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑，佐劑或賦形劑，以及增溶劑，穩(wěn)定劑和防腐劑。為了注射施用，水性、非水性或等滲溶液制劑是優(yōu)選的。它可以采用液體或干燥(粉末，凍干物等等)形式以單劑量或多劑量形式提供，所述干燥形式可以在使用時(shí)用合適的稀釋劑重建。本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒用于治療和/或預(yù)防癌癥，傳染病和/或自身免疫病。如本文所用，“癌癥”是指但不限于肺癌(例如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺)，支氣管癌，食管癌，咽癌，頭頸癌(例如喉癌，唇癌，鼻腔和鼻旁竇癌以及咽喉癌)，口腔癌(例如舌癌)，胃癌(gastric cancer)(例如胃癌(stomach cancer)),腸癌，胃腸癌，結(jié)腸癌,直腸癌(rectal cancer),結(jié)腸直腸癌,直腸癌(anal cancer),肝癌,胰腺癌,尿道癌,膀胱癌，甲狀腺癌，腎癌，癌(carcinoma)，腺癌，皮膚癌(例如黑色素瘤)，眼癌(例如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)，腦癌(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤，髓母細(xì)胞瘤和腦星形細(xì)胞瘤)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌，淋巴瘤(例如皮膚B細(xì)胞淋巴瘤，Burkitt’ s淋巴瘤，何杰金氏綜合征和非霍奇金氏淋巴瘤)，骨癌，白血病，乳腺癌，生殖道癌，宮頸癌(例如宮頸上皮瘤)，子宮癌(例如子宮內(nèi)膜癌)，卵巢癌，陰道癌，外陰癌，前列腺癌，睪丸癌。“癌癥”還指病毒誘導(dǎo)的腫瘤，包括但不限于乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的癌，皰疹病毒誘導(dǎo)的腫瘤，EBV誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤，乙肝誘導(dǎo)的腫瘤，HTLV-I-誘導(dǎo)的淋巴瘤和HTLV-2-誘導(dǎo)的淋巴瘤。如本文所用，“傳染病”是指由傳染性生物體引起的任何疾病。傳染性生物體包括但不限于病毒(例如單鏈RNA病毒，單鏈DNA病毒，人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV),甲肝、乙肝和丙肝病毒，單純皰疹病毒(HSV)，巨細(xì)胞病毒(CMV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，EB病毒(EBV)或人乳頭瘤病毒(HPV))，寄生蟲(chóng)(例如原生動(dòng)物和多細(xì)胞動(dòng)物病原體，如瘧原蟲(chóng)屬，利什曼蟲(chóng)屬，血吸蟲(chóng)屬或錐蟲(chóng)屬)，細(xì)菌(例如分枝桿菌(具體來(lái)說(shuō)是結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)),沙門(mén)氏菌,鏈球菌,大腸桿菌或葡萄球菌)，真菌(例如假絲酵母屬或曲霉屬)，卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystis carinii),和朊蛋白。如本文所用，“自身免疫病”是指兩種常規(guī)類(lèi)型‘全身性自身免疫病’(即破壞眾多器官或組織的病癥)和‘局部自身免疫病’(即只破壞單個(gè)器官或組織的病癥)。但是，
‘局部自身免疫病’的影響可以通過(guò)間接影響其它機(jī)體器官和系統(tǒng)而是全身性的?！硇宰陨砻庖卟　ǖ幌抻陬?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其可影響關(guān)節(jié)，和可能影響肺和皮膚；狼瘡，包括全身性紅斑狼瘡(SLE)，其可影響皮膚，關(guān)節(jié)，腎，心臟，腦，紅細(xì)胞以及其它組織和器官；硬皮病，其可影響皮膚，腸，和肺；Sjogren’ s綜合征，其可影響唾液腺，淚腺，和關(guān)節(jié)；Goodpasture' s綜合征,其可影響肺和腎；Wegener' s肉芽腫,其可影響竇，肺,和腎；風(fēng)濕性多肌痛，其可影響大的肌群，以及顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎，其可影響頭部和頸部的動(dòng)脈?！植孔陨砻庖卟　ǖ幌抻贗型糖尿病，其影響胰島！Hashimoto' s甲狀腺炎和Grave’ s病，其影響甲狀腺；乳糜灣，Crohn’ s病，和潰瘍性結(jié)腸炎，其影響胃腸道；多發(fā)性硬化(MS)和Guillain-Barre綜合征,其影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)；Addison’ s病,其影響腎上腺；原發(fā)性膽管纖維硬化，硬化性膽管炎，和自身免疫性肝炎，其影響肝臟；和Raynaud’s現(xiàn)象，其可影響手指，腳趾，鼻，耳。本發(fā)明還涉及ー種藥物組合物，優(yōu)選疫苗，包括通過(guò)本發(fā)明方法獲得的純化的野 生型、減毒和/或重組正痘病毒。根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物g在治療和/或預(yù)防癌癥，傳染病和/或自身免疫病。本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥、傳染病和/或自身免疫病的藥物組合物、優(yōu)選疫苗中的用途。可以按照常規(guī)來(lái)制備藥物組合物和特別是疫苗以用于通過(guò)局部、腸胃外或消化途徑施用。施用途徑可以是例如胃內(nèi)，皮下，心內(nèi)，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，腫瘤內(nèi)，鼻內(nèi)，肺內(nèi)或氣管內(nèi)途徑。對(duì)于后3種實(shí)施方案，通過(guò)氣霧劑或滴注施用是有利的?？梢圆捎脝未蝿┝炕蛟谀畅`時(shí)間間隔后重復(fù)一次或數(shù)次來(lái)完成施用。施用的合適途徑和劑量作為例如個(gè)體、待治 療疾病或待轉(zhuǎn)移的感興趣基因的各種參數(shù)的函數(shù)而變化。根據(jù)第一種可能性，可以直接在體內(nèi)施用藥物組合物，特別是疫苗(例如通過(guò)靜脈內(nèi)注射施用入可及的腫瘤或在其周?chē)┯?，皮下用于治療性或預(yù)防性接種)。還可以采用離體(ex vivo)方法，其包括從患者收集細(xì)胞(骨髄干細(xì)胞，外周血淋巴細(xì)胞，肌細(xì)胞等等)，在體外根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)轉(zhuǎn)染或感染它們，并將它們重新施用給患者。此外還可以預(yù)見(jiàn)，在合適的和不離開(kāi)本發(fā)明范圍的情況下，可以通過(guò)不同途徑同時(shí)或連續(xù)施用包含在藥物組合物、特別是疫苗中的各種組分。本發(fā)明還涉及獲自屬于鴨科的禽類(lèi)細(xì)胞的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系用于根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。在鴨科中，屬于棲鴨屬或鴨屬的細(xì)胞是尤其優(yōu)選的。甚至更優(yōu)選地，永生化禽類(lèi)細(xì)胞系屬于番鴨或綠頭鴨種。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系是包括被專(zhuān)利申請(qǐng)WO2007/077256涵蓋的編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。尤其優(yōu)選下列永生化禽類(lèi)細(xì)胞系-以登錄號(hào)08060502保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)(參見(jiàn)圖2，3和4)的T3-17490或其衍生物；-以登錄號(hào)08060501保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)(參見(jiàn)圖5，6和7)的T6-17490或其衍生物；就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明還涉及■包括編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系用于根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。■以登錄號(hào)08060502保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的T3-17490番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系(描述于實(shí)施例2)或其衍生物用于根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途?！鲆缘卿浱?hào)08060501保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的T6-17490番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系(描述于實(shí)施例3)或其衍生物用于根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。根據(jù)本發(fā)明另ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系是包括ElA核酸序列和被專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2009/004016涵蓋的編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。
就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明還涉及包括ElA核酸序列和編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系用于根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。如整個(gè)申請(qǐng)所用，保藏的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系的“衍生物”是指包括編碼“感興趣物質(zhì)”的核酸序列的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。如本文所用，“感興趣物質(zhì)”可以包括但不限于藥學(xué)上有活性的蛋白例如生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物，抗體，抗原，它們可用于免疫或接種等等的衍生物，白介素，胰島素，紅細(xì)胞生成素，G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF，干擾素(干擾素-alpha,干擾素-beta,干擾素-gamma),凝血因子(例如因子VIII,因子IX ;tPA)或其組
ム
ロ ο附圖
簡(jiǎn)述圖I :顯示不同Benzonase 濃度(即IOmM ；50mM)對(duì)Benzonase 核酸內(nèi)切酶活
性(溫度 25°C ；Mg2+2mM ；pH 8)的影響。圖2 :顯示T3-17490(ECACC 08060502)番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系(第39代)的光
學(xué)顯微鏡圖像。圖3 :顯示T3_17490(ECACC 08060502)番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線(第7代到第75代)。圖4 :顯示T2-17490 (ECACC 08060502)番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系群體倍增時(shí)間進(jìn)展(第7代到第75代)。圖5 :顯示T6-17490 (ECACC 08060501)(第45代)的光學(xué)顯微鏡圖像。圖6 :顯示T6_17490(ECACC 08060501)番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線(從第15代到第51代)。圖7 T6-17490(ECACC 08060501)番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系群體倍增時(shí)間進(jìn)展(從第16代到第51代)。為了說(shuō)明本發(fā)明，提供下列實(shí)施例。所述實(shí)施例不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例I :方法A.步驟a)制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物。
將66只SPF卵在2%甲醛溶液中溫育60秒。在用70 %こ醇清洗后，打開(kāi)卵，提取胚胎并解剖。然后通過(guò)分散酶(Ul/ml)和triple select (Ul/ml)將所獲組織在36. 5°C消化120分鐘。將混合物過(guò)濾以除去未消化的組織，并通過(guò)離心(2300rpm，15分鐘)收集CEF。將 CEF 在 55L VP-SFM(Invitrogen)中于 36. 5°C溫育 2 天。步驟b):用IH痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物。然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，將MVA-[MUC1-IL2]也稱(chēng)為T(mén)G4010 (O. 05M0I) (MVA之前保藏于 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),保藏號(hào)為N。1-721)添加于 55L Basal Medium Eagle (Invitrogen)。步驟c):培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞肓至產(chǎn)生子代IH痘病毒。然后將感染的CEF在36. 5°C溫育3天。 步驟d):在一或多種核酸_存在下溫育。然后在下列條件下，在存在Benzonase ου/ml 或 50U/ml (Merck !ReferenceI. 01653. 0001)時(shí)溫育包括MVA子代的感染的CEF -在25°C的溫度下攪拌2小吋；-Mg2+2mM ；-8. O 的 pH。步驟e):從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收IH痘病毒。收集細(xì)胞培養(yǎng)基和CEF。然后利用Silverson L4R高速勻衆(zhòng)器(Silverson)將混合物在 llml/min 勻漿 15 分鐘，或利用 SONITUBE 36kHz 型 SM35/3WU (Heraeus PSP)將混合物在1500ml/min勻漿75分鐘。然后在25°C和pH 8. O攪拌條件下將獲得的混合物溫育2小吋。步驟f):在合適條件下向步驟e)回收的正痘病毒中添加一價(jià)鹽以抑制核酸酶活性并避免步驟K)中所述正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑。然后在存在NaCl 250mM和pH 8. O的條件下溫育獲得的混合物。步驟0:在合適條件下將步驟f)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以捕獲核酸。然后將獲得的混合物添加到UNOsphere Q (BioRad)。首先用無(wú)菌水清洗UNOsphere Q(BioRad)珠形式基質(zhì)，然后在Tris IOmM緩沖液(pH 8.0)中高壓消毒，隨后用NaCl 250mM或300mM緩沖液(pH 8. O)平衡。然后使用Watson-Marlow 螺動(dòng)泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow)將UNOsphere Q(BioRad)珠形式基質(zhì)添加到步驟f)獲得的包含在Flexboy 袋(Reference FFB 101961 ；Sartorius Stedim biotech)的混合物中。在室溫(20°c到22°C )緩慢攪拌條件下將UNOsphere Q(BioRad)珠形式基質(zhì)與步驟f)獲得的混合物保持接觸I小吋。步驟h):在合適條件下將步驟0獲得的混合物凈化以去除細(xì)胞碎片。然后將所獲混合物在與Sartopure PP2 5 μ m(Sartorius) 連接的Sartopure PP2 8 μ m(Sartorius)上以IL/分鐘流速通過(guò)深度過(guò)濾凈化。步驟i)在合適條件下用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑以回收流過(guò)物中剩余的正痘病毒。
通過(guò)使用Watson-Marlow螺動(dòng)泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow)利用溶于 S08 緩沖液(IOmM Tris-HCL ;蔗糖 5% (w/v) ;10mM 谷氨酸鈉；50mM NaCl ；pH 8.0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg))的 NaCl 250mM 或 300mM 來(lái)清洗(v/v) UNOsphere Q (BioRad)。然后在存在蔗糖50g/L終濃度的條件下在5°C將步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物溫育過(guò)夜(即18小時(shí))。步驟i):濃縮步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物。然后通過(guò)O. I μ m Prostak Microfiltration Module (Reference PSVVAG021,Millipore)將步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物濃縮18倍。步驟k):將步驟i)獲得的包括IH痘病毒的級(jí)分滲濾。
然后在相同組件即O. I μ m Prostak Microfiltration Module (ReferencePSVVAG021,Millipore)上將滲余物滲濾。使用Quant_iT Picogreen dsDNA分析試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)P7589, Invitrogen)進(jìn)行DNA的定量。結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)到殘余DNA。實(shí)施例2 T3-17490永?；喖?xì)朐系(保藏于ECACC,登錄號(hào)08060502)用于根
據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生ιΗ痘病毒。Τ3-17490細(xì)胞(第39代)具有同質(zhì)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖2)。靜止單層直至100%融合都是穩(wěn)定的并受到接觸抑制。經(jīng)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)干支原體污染以及微生物污染都是陰性。Τ3-17490細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線(第7代到第75代)(圖3)顯示從第19代到第75代的連續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)期。聚焦于群體倍增時(shí)間(TOT)的進(jìn)展，觀察到逐漸穩(wěn)定和減少，具體來(lái)說(shuō)注意到在最近10代期間在48小時(shí)標(biāo)記下TOT是穩(wěn)定的(圖4)。通過(guò)累積2個(gè)指數(shù)生長(zhǎng)期計(jì)算群體倍増的對(duì)應(yīng)數(shù)目(群體倍増水平，PDL):在75次傳代期間細(xì)胞經(jīng)歷至少147次群體倍増(PD)。原代細(xì)胞在進(jìn)入老化前經(jīng)歷的群體倍増數(shù)目是組織和種屬依賴(lài)性的。通常認(rèn)為上限位于50到60Η)之間。因此T3-17490細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)Hayflick限制，所以被稱(chēng)作永生化細(xì)胞系。N. B.■群體倍増水平(TOL)是指細(xì)胞代數(shù)(生物量2倍増加)。PDL計(jì)算PDL = Ln (最終細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù))/Ln (2)；■群體倍增時(shí)間(I3DT)，也稱(chēng)作傳代時(shí)間，是ー個(gè)群體倍增所需時(shí)間。PDT計(jì)算PDT = Δ t*Ln (2) /Ln (最終細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù))。實(shí)施例3 T6-17490永牛化番鴨細(xì)胞系(保藏于ECACC,登錄號(hào)08060501)用于根
據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生正痘病毒。Τ6-17490細(xì)胞(第45代)具有同質(zhì)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖5)。靜止單層直至100%融合都是穩(wěn)定的并受到接觸抑制。經(jīng)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)干支原體污染以及微生物污染都是陰性。Τ6-17490細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線(第15代到第51代)(圖6)顯示從第19代開(kāi)始的連續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)期。在此期間測(cè)量的群體倍增時(shí)間(PDT)逐漸降低。平均PDT從94小時(shí)(第20到35代)變?yōu)?2小時(shí)(第36到51代)(圖7)。根據(jù)第51代計(jì)算的群體倍増(I3DL)數(shù)是至少71次群體倍増。因此Τ6-17490細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)Hayflick限制，所以被稱(chēng)作永生化細(xì)胞糸ON. B.■群體倍増水平(TOL)是指細(xì)胞代數(shù)(生物量2倍増加)。PDL計(jì)算PDL = Ln (最終細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù))/Ln (2)；■群體倍增時(shí)間(TOT)，也稱(chēng)作傳代時(shí)間，是ー個(gè)群體倍增所需時(shí)間。PDT計(jì)算PDT = Δ t*Ln (2) /Ln (最終細(xì)胞數(shù)/初始細(xì)胞數(shù))。實(shí)施例4 :方法B。步驟a'_):制備包裝細(xì)胞士音養(yǎng)物。將66只SPF卵在2%甲醛溶液中溫育60秒。在用70 %こ醇清洗后，打開(kāi)卵，提 取胚胎并解剖。然后通過(guò)分散酶(Ul/ml)和triple select (Ul/ml)將所獲組織在36. 5°C消化120分鐘。將混合物過(guò)濾以除去未消化的組織，并通過(guò)離心(2300rpm，15分鐘)收集CEF。將 CEF 在 55L VP-SFM(Invitrogen)中于 36. 5°C溫育 2 天。步驟b'):用IH痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物。然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，將MVA-[MUC1-IL2]也稱(chēng)為T(mén)G4010(0. 05M0I) (MVA之前保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),保藏號(hào)為 N。1-721)添カロ于 55L Basal Medium Eagle (Invitrogen) 步驟ど)培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞肓至產(chǎn)生子代lH痘病毒。然后將感染的CEF在36. 5°C溫育3天。步驟d'):在一或多種核酸_存在下溫育。然后在下列條件下，在存在Benzonase 10U/ml (Merck ;Referencel. 01653. 0001)時(shí)溫育包括MVA子代的感染的CEF -在25°C的溫度下攪拌2小時(shí)；-Mg2+2mM ；-8. O 的 pH。步驟e'):從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒。收集細(xì)胞培養(yǎng)基和CEF。然后利用Silverson L4R高速勻漿器(Silverson)將混合物在 llml/min 勻漿 15 分鐘，或利用 SONITUBE 36kHz 型 SM35/3WU(Heraeus PSP)將混合物在1500ml/min勻漿75分鐘。步驟f'):在一或多種能夠抑制核酸酶活件的物質(zhì)存在下溫育步驟e')回收的IH痘病毒。然后在存在NaCl IOOmM和EDTA IOmM, pH 8. O的條件下溫育獲得的混合物。步驟W):在合適條件下將步驟f')獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以捕獲所述正痘病毒和核酸。然后將獲得的混合物添加到BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)。首先用無(wú)菌水清洗BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)珠形式基質(zhì),然后用NaOH O. 5N消毒，Tris IOmM緩沖液(pH 8.0)清洗，然后用Tris IOmM NaCllOmM蔗糖5%緩沖液(pH8. O)進(jìn)行平衡。然后使用Watson-Marlow 螺動(dòng)泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow)將 BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)珠形式基質(zhì)添加到包含于 Flexboy 袋(Reference FFB 101961 ；Sartorius Stedim biotech)的步驟 f')獲得的混合物中。在室溫(20 V到22 V )緩慢攪拌條件下將BioSepra Q hyperZ(PallCorporation)珠形式基質(zhì)與步驟f')獲得的混合物保持接觸I小時(shí)。步驟h'):在合適條件下將步驟V )獲得的混合物凈化以去除細(xì)胞碎片。然后在與Sartopure PP25 Um(Sartorius)連接的 Sartopure PP28 u m(Sartorius)上以IL/分鐘流速通過(guò)深度過(guò)濾凈化所獲混合物。步驟i'):用包括一價(jià)鹽.的溶液洗脫IH痘病毒。通過(guò)使用Watson-Marlow 螺動(dòng)泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow), 利用 S08 緩沖液(IOmM Tris-HCL;蔗糖 5% (w/v) ;10mM 谷氨酸鈉；50mM NaCl ；pH 8.0，具有生理學(xué)滲透性(290m0sm/kg))中增加的NaCl濃度梯度(300mM ；400mM ；500mM)來(lái)洗脫正
痘病毒。步驟i'):濃縮步驟i')獲得的混合物。然后通過(guò)0. I U m Prostak Microfiltration Module (Reference PSVVAG021,Millipore)將步驟i')獲得的洗脫物濃縮18倍。步驟k'):將步驟i')獲得的包括IH痘病毒的級(jí)分滲濾。然后將滲余物在相同組件即0. I U m Prostak Microfiltration Module(Reference PSVVAG021, Millipore)上滲濾。使用Quant-iT Picogreen dsDNA分析試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)P7589, Invitrogen)進(jìn)行DNA的定量。結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)到殘余DNA。上述說(shuō)明書(shū)中引用的所有文獻(xiàn)(專(zhuān)利，專(zhuān)利申請(qǐng)，出版物)在此援引加入本文。本發(fā)明的各種改變和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，并不脫離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明針對(duì)特別優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解所請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度限于這類(lèi)特定的實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種改變意圖在下列權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正痘病毒的方法，包括下列步驟 a)制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物； b)用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物； c)培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒； d)在一或多種核酸酶存在下溫育； e)從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒； f)在合適條件下將一價(jià)鹽添加到步驟e)回收的正痘病毒中以抑制核酸酶活性并避免步驟g)中所述正痘病毒吸附到陰離子交換吸附劑上； g)在合適條件下將步驟f)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以捕獲核酸； h)在合適條件下將步驟g)獲得的混合物凈化以去除細(xì)胞碎片； i)在合適條件下用包括一價(jià)鹽的溶液清洗陰離子交換吸附劑以回收流過(guò)物中剩余的正痘病毒; j)濃縮步驟h)獲得的流過(guò)物和步驟i)獲得的流過(guò)物； k)將步驟j)獲得的包括正痘病毒的級(jí)分滲濾。
2.一種產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正痘病毒的方法，包括下列步驟)制備包裝細(xì)胞培養(yǎng)物； )用正痘病毒感染包裝細(xì)胞培養(yǎng)物； Ci )培養(yǎng)感染的包裝細(xì)胞直至產(chǎn)生子代正痘病毒； cT )在一或多種核酸酶存在下溫育； e,)從培養(yǎng)上清液和/或包裝細(xì)胞回收正痘病毒； f,)在存在以下物質(zhì)的條件下溫育步驟e,)回收的正痘病毒 1.一或多種能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)，和任選存在的
2.—或多種穩(wěn)定劑 g,)在合適條件下將步驟f,)獲得的混合物與陰離子交換吸附劑接觸以捕獲所述正痘病毒和核酸； h')在合適條件下將步驟g')獲得的混合物凈化以去除細(xì)胞碎片； )用包括一價(jià)鹽的溶液洗脫正痘病毒；)濃縮步驟P )獲得的混合物； k')將步驟j')獲得的包括正痘病毒的級(jí)分進(jìn)行滲濾。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述包裝細(xì)胞是永生化細(xì)胞系，并且優(yōu)選是永生化禽類(lèi)細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述永生化禽類(lèi)細(xì)胞系獲自屬于鴨科的禽類(lèi)細(xì)胞，優(yōu)選獲自番鴨種。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述永生化禽類(lèi)細(xì)胞系包括編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述永生化禽類(lèi)細(xì)胞系是以登錄號(hào)08060502保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的T3-17490或其衍生物。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述永生化禽類(lèi)細(xì)胞系是以登錄號(hào)08060501保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的T6-17490或其衍生物。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述永生化禽類(lèi)細(xì)胞系包括ElA核酸序列和編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列。
9.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述包裝細(xì)胞是原代或繼代禽類(lèi)細(xì)胞，優(yōu)選是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。
10.權(quán)利要求I或2的方法，其中pH在7.O到9. O之間，優(yōu)選在7. 5到8. 5之間，和更優(yōu)選是8. O。
11.權(quán)利要求I或2的方法,其中所述核酸酶是核酸內(nèi)切酶,優(yōu)選是Benzonase 。
12.權(quán)利要求I或2的方法，其中核酸酶的濃度范圍是5U/ml到100U/ml，優(yōu)選范圍是 5U/ml 到 50U/ml，和更優(yōu)選是 10U/ml。
13.權(quán)利要求I或2的方法，其中回收正痘病毒的步驟之前是 1)破壞包裝細(xì)胞膜的步驟，優(yōu)選通過(guò)使用高速勻漿器或通過(guò)超聲處理；和 2)將步驟I)獲得的混合物溫育至少I(mǎi)小時(shí)的步驟，以允許先前添加的核酸酶降解從包裝細(xì)胞釋放的核酸。
14.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述陰離子交換吸附劑包括珠形式基質(zhì)，所述珠形式基質(zhì)具有大于用于凈化步驟的濾器孔徑的直徑，優(yōu)選直徑大于8 μ m，更優(yōu)選直徑在50 μ m到150 μ m之間，更優(yōu)選直徑在90μπι到120 μ m之間，和甚至更優(yōu)選直徑為120 μ m。
15.權(quán)利要求I或2的方法，其中陰離子交換吸附劑的官能團(tuán)選自二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)和三乙基氨基乙基(TEAE)，優(yōu)選是三甲基氨基乙基(TMAE)。
16.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述凈化步驟通過(guò)深度過(guò)濾進(jìn)行，優(yōu)選在與具有5μ m孔徑的濾器連接的具有8 μ m孔徑的濾器上進(jìn)行。
17.權(quán)利要求I或2的方法，其中濃縮步驟通過(guò)在具有O.09μπι到O. 15 μ m之間孔徑的濾器上、優(yōu)選在具有O. I μ m孔徑的濾器上的微量過(guò)濾進(jìn)行。
18.權(quán)利要求I或2的方法，其中滲濾步驟在具有O.09 μ m到O. 15 μ m之間孔徑的濾器上、優(yōu)選在具有O. I μ m孔徑的濾器上進(jìn)行。
19.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括 1)凝膠過(guò)濾步驟；和 2)滲濾步驟。
20.權(quán)利要求I的方法，其中用于步驟f)的一價(jià)鹽是NaCl。
21.權(quán)利要求I的方法，其中用于步驟f)的一價(jià)鹽濃度范圍是50mM到150mM，優(yōu)選是IOOmM0
22.權(quán)利要求2的方法，其中步驟f’)中能夠抑制核酸酶活性的物質(zhì)是螯合劑，優(yōu)選是乙二胺四乙酸(EDTA)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中EDTA的濃度范圍是5mM到20mM，優(yōu)選是10mM。
24.權(quán)利要求2的方法，其中用于步驟i')的一價(jià)鹽是NaCl。
25.權(quán)利要求2的方法，其中步驟i')通過(guò)范圍從O到2.5M、優(yōu)選范圍從O到2M和更優(yōu)選范圍從O到I. 5M的增加的一價(jià)鹽濃度梯度進(jìn)行。
26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述正痘病毒是痘苗病毒。
27.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述正痘病毒是修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
28.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組正痘病毒包括外源序列，其是編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白優(yōu)選是FCUl蛋白FCU1-8蛋白的自殺基因。
29.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組正痘病毒包括外源序列，其編碼腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，優(yōu)選MUCI。
30.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組正痘病毒包括外源序列，其編碼抗原，優(yōu)選HCV或HPV。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其中所述重組正痘病毒進(jìn)一步包括外源序列，其編碼細(xì)胞因子，優(yōu)選IL2。
32.權(quán)利要求28到31中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組正痘病毒進(jìn)一步包括表達(dá)外源序列必需的元件。
33.通過(guò)前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒，用做藥物組合物，優(yōu)選用做疫苗。
34.通過(guò)前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒，用于治療和/或預(yù)防癌癥、傳染病和/或自身免疫病。
35.一種藥物組合物，優(yōu)選疫苗，包括根據(jù)前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒。
36.權(quán)利要求35的藥物組合物，用于治療和/或預(yù)防癌癥、傳染病和/或自身免疫病。
37.通過(guò)前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥、傳染病和/或自身免疫病的藥物組合物、優(yōu)選疫苗中的用途。
38.獲自屬于鴨科、優(yōu)選獲自番鴨種的禽類(lèi)細(xì)胞的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系用于產(chǎn)生前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。
39.包括編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系用于產(chǎn)生前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。
40.以登錄號(hào)08060502保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的T3-17490番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系或其衍生物用于產(chǎn)生前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。
41.以登錄號(hào)08060501保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的T6-17490番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系或其衍生物用于產(chǎn)生前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。
42.包括ElA核酸序列和編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系用于產(chǎn)生前述權(quán)利要求I到32中任一項(xiàng)的野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生和純化野生型、減毒和/或重組正痘病毒的方法。本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明方法獲得的純化的野生型、減毒和/或重組正痘病毒和用于治療和/或預(yù)防癌癥、傳染病和/或自身免疫病的包括所述純化正痘病毒的藥物組合物(優(yōu)選疫苗)及其用途。本發(fā)明還涉及獲自屬于鴨科的禽類(lèi)細(xì)胞的永生化禽類(lèi)細(xì)胞系(具體來(lái)說(shuō)是包括編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的核酸序列和任選存在的E1A核酸序列的番鴨永生化禽類(lèi)細(xì)胞系)根據(jù)本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生野生型、減毒和/或重組正痘病毒的用途。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102740881SQ201080031647
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者C·塞內(nèi), S·康普爾西, Y·科迪爾 申請(qǐng)人:特蘭斯吉恩股份有限公司