專利名稱：一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進(jìn)型方法
一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進(jìn)型方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)元體外分離和培養(yǎng)方法。
研究背景神經(jīng)元，又稱神經(jīng)細(xì)胞，是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元是具有長(zhǎng)突起的細(xì)胞，它由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成。在長(zhǎng)的軸突上套有一層鞘，組成神經(jīng)纖維，它的末端的細(xì)小分支叫做神經(jīng)末梢。細(xì)胞體位于腦、脊髓和神經(jīng)節(jié)中，細(xì)胞突起可延伸至全身各器官和組織中。細(xì)胞體是細(xì)胞含核的部分，其形狀大小有很大差別，直徑約4 120微米。核大而圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)少，核仁明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有斑塊狀的核外染色質(zhì)(舊稱尼爾小體)，還有許多神經(jīng)元纖維。細(xì)胞突起是由細(xì)胞體延伸出來(lái)的細(xì)長(zhǎng)部分，又可分為樹突和軸突。每個(gè)神經(jīng)元可以有一或多個(gè)樹突，可以接受刺激并將興奮傳入細(xì)胞體。每個(gè)神經(jīng)元只有一個(gè)軸突，可以把興奮從胞體傳送到另一個(gè)神經(jīng)元或其他組織，如肌肉或腺體。
在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)歷了細(xì)胞數(shù)量和體積的增長(zhǎng)及細(xì)胞連接形成改變過(guò)程。分化的神經(jīng)元一經(jīng)產(chǎn)生，便不可能再進(jìn)行分裂，神經(jīng)元的正常分化過(guò)程一旦受損，即有可能影響突觸聯(lián)系的正常建立等一系列過(guò)程。對(duì)神經(jīng)元損傷的機(jī)制及其防治， 一直是人們感興趣的問(wèn)題。隨著對(duì)神經(jīng)元功能的了解，它已逐漸成為神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但由于在體內(nèi)神經(jīng)元與其它神經(jīng)細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞混雜存在，妨礙了其生物學(xué)功能的研究及應(yīng)用。因此需要對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)并純化，才能深入了解其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。
由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞，動(dòng)物出生后很少分裂增殖，相對(duì)于其它細(xì)胞而言，神經(jīng)元在體外更難以 存活和生長(zhǎng)，其胞體伸出許多又長(zhǎng)又細(xì)的突起，在取材過(guò)程中容易損傷其突起。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育較早。出生后，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育基本完成， 很多神經(jīng)元此時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)出突起，取材于該時(shí)期的腦組織對(duì)神經(jīng)元的損傷較大。胚胎時(shí)期的神經(jīng)元分化程度較低，體外生存能力強(qiáng)，該時(shí)期神經(jīng)元之間的聯(lián)系較少，取材過(guò)程中造成的不可逆?zhèn)^小，易于成功培養(yǎng)。
體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營(yíng)養(yǎng)條件均較為特殊。目前神經(jīng)元的培養(yǎng)分為有血清培養(yǎng)和無(wú)血清培養(yǎng)，有血清培養(yǎng)提供細(xì)胞培養(yǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞增殖和 DNA的合成，但也為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等其它神經(jīng)細(xì)胞提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，但也使得培養(yǎng)的神經(jīng)元很難分離開。無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)不利于有絲分裂細(xì)胞的生長(zhǎng)，可防止非神經(jīng)元過(guò)度增殖，可提高培養(yǎng)的神經(jīng)元純度。采用無(wú)血清培養(yǎng)能通過(guò)添加某些成分， 而且可選擇性地促進(jìn)和控制神經(jīng)元的生長(zhǎng)。
目前尚未見有關(guān)神經(jīng)元體外分離或培養(yǎng)方法的專利文獻(xiàn)公開，雖然神經(jīng)元采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，能夠在一定程度上達(dá)到培養(yǎng)的目的，但存在著與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等其它雜細(xì)胞很難分離以及體外培養(yǎng)存活困難等問(wèn)題，不能滿足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的要求。本室參照國(guó)內(nèi)外培養(yǎng)分離神經(jīng)元的方法。根據(jù)多年的實(shí)驗(yàn)研究，改進(jìn)了大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)方法，建立了一種穩(wěn)定、可靠的獲得神經(jīng)元的方法，為了解神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能，闡明其在腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用研究提供成功的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，改進(jìn)當(dāng)前體外分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，使之簡(jiǎn)單易行，培養(yǎng)獲得的神經(jīng)元生長(zhǎng)良好，純度高，產(chǎn)量大，可滿足神經(jīng)科學(xué)研究中細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。
采用以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。一種體外分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，含有大腦皮質(zhì)組織分離、組織細(xì)胞搗碎后胰酶消化、篩網(wǎng)過(guò)濾離心、細(xì)胞原代培養(yǎng)等4個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。此外還可包含神經(jīng)元鑒定的步驟。
大腦皮質(zhì)組織分離孕鼠頸椎脫白致死，無(wú)菌條件下取出胚胎，然后在無(wú)菌條件下取胎鼠兩側(cè)大腦半球放入培養(yǎng)皿中，剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜。
優(yōu)選方案為孕15-17天的大鼠頸椎脫臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪開腹部至兩側(cè)，無(wú)菌條件下取出串珠狀胚胎，放入盛有IXPBS的培養(yǎng)皿中，然后在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)冰床上取胎鼠兩側(cè)大腦半球放入盛有IXPBS的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷夾取動(dòng)物雙側(cè)大腦皮質(zhì)置于盛有IXPBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，仔細(xì)剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜，再將大腦皮質(zhì)移至另一個(gè)盛有IXPBS的培養(yǎng)皿內(nèi)。
需要注意的是解剖過(guò)程一定要全程在冰上進(jìn)行。目的在于從你處死母鼠后，胎鼠的大腦的溫度要最快的降低到O度，有助于提高神經(jīng)元的存活率。另外，在解剖過(guò)程中，胎鼠直到皮層或海馬被剪碎的過(guò)程，有時(shí)候可能需要2小時(shí)，如果樣品多。一定要注意多準(zhǔn)備冰袋子。確保你的任何過(guò)程都在冰浴的培養(yǎng)液中進(jìn)行(消化步驟除外)。這樣可以大大提高神經(jīng)元細(xì)胞的存活率。在解剖大腦時(shí)候，有人用hank’s液，在其中解剖。但即使 是O度，神經(jīng)元還是在進(jìn)行著很大程度代謝。所以，hank’s液的無(wú)糖環(huán)境很不利。建議使用DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來(lái)浸泡解剖過(guò)程中的大腦，來(lái)供給大腦的代謝，血清可以抑制神經(jīng)凋亡。這其中還有一個(gè)問(wèn)題，就是DMEM培養(yǎng)液會(huì)在空氣中變堿性。國(guó)外有的實(shí)驗(yàn)室用L-15 培養(yǎng)液來(lái)浸泡解剖過(guò)程中的腦，因?yàn)長(zhǎng)-15不會(huì)再空氣中變堿性。
組織細(xì)胞搗碎后胰酶消化無(wú)菌條件下，搗碎腦組織呈糜狀，然后加入低濃度的胰酶，置37°C培養(yǎng)箱消化5-30分鐘。然后用神經(jīng)元培養(yǎng)首液終止消化，并繼續(xù)加入首液輕輕吹打，直至將組織全部吹散，形成細(xì)胞懸液。
優(yōu)選方案為無(wú)菌條件下，用眼科鑷夾碎腦組織呈糜狀，加入濃度O. 1-0. 125%胰酶2ml，37°C培養(yǎng)箱消化10分鐘。用神經(jīng)元培養(yǎng)首液終止消化后，繼續(xù)加入神經(jīng)元培養(yǎng)首液輕輕吹打，直至將組織全部吹散，形成細(xì)胞懸液。
需要注意的是除了采用胰酶以外，還可以采用木瓜酶聯(lián)合DNA酶的方法進(jìn)行消化。木瓜酶是消化過(guò)后，存活率最高的酶。木瓜酶配成l_3mg/ml濃度進(jìn)行消化，同時(shí)加入濃度為l_3mg/ml的DNA酶，加入量各l_2ml，消化時(shí)間為20-30分鐘。DNA酶的作用是，消化掉破裂細(xì)胞的DNA，避免了釋放的DNA和蛋白纏結(jié)在組織塊表面而阻礙進(jìn)一步消化。木瓜酶和DNA酶在使用時(shí)需要現(xiàn)配現(xiàn)用。
本方案提到的神經(jīng)元培養(yǎng)首液配方為胎牛血清|ιο%_
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其包括以下步驟大腦皮質(zhì)組織分離；組織細(xì)胞搗碎后酶消化；篩網(wǎng)過(guò)濾并離心的步驟；以及細(xì)胞原代培養(yǎng)；其特征在于細(xì)胞原代培養(yǎng)的步驟為將已離心的上清液棄去，用2ml神經(jīng)元培養(yǎng)首液重懸放入培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為 5X 105個(gè)/ml，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的24孔或96孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)12小時(shí)后換液改用神經(jīng)元培養(yǎng)維持液，首次全量換液；以后每2天換維持液I次,每次半量換液；細(xì)胞生長(zhǎng)5天可進(jìn)行鑒定，6天后用于實(shí)驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于首次全量換液體積為24孔板每次500 μ I/孔或96孔板100 μ I/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于所述大腦皮質(zhì)組織分離步驟為將孕15-17天的大鼠頸椎脫臼致死，75%乙醇腹部消毒，剪刀剪開腹部至兩側(cè)，無(wú)菌條件下取出串珠狀胚胎，放入盛有IXPBS的培養(yǎng)皿中，然后在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)冰床上取胎鼠兩側(cè)大腦半球放入盛有IXPBS的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷夾取動(dòng)物雙側(cè)大腦皮質(zhì)置于盛有 IXPBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，仔細(xì)剝離并去除皮層血管組織和軟腦膜，再將大腦皮質(zhì)移至另一個(gè)盛有IXPBS的培養(yǎng)皿內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于所述組織細(xì)胞搗碎后酶消化步驟為無(wú)菌條件下，用眼科鑷夾碎腦組織呈糜狀，加入濃度O. 1-0. 125%胰酶2ml，37°C培養(yǎng)箱消化10分鐘；用神經(jīng)元培養(yǎng)首液終止消化后，繼續(xù)加入神經(jīng)元培養(yǎng)首液輕輕吹打，直至將組織全部吹散，形成細(xì)胞懸液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于組織細(xì)胞搗碎后酶消化的步驟，采用木瓜酶聯(lián)合DNA酶的方法進(jìn)行消化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于組織細(xì)胞搗碎后酶消化的步驟加入的木瓜酶濃度為l_3mg/ml，加入量為l_2ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于組織細(xì)胞搗碎后酶消化的步驟加入的DNA酶濃度為l-3mg/ml，加入量為l_2ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法，其特征在于組織細(xì)胞搗碎后酶消化的步驟消化時(shí)間為20-30分鐘。
全文摘要
一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進(jìn)型方法，含有大腦皮質(zhì)組織分離、組織細(xì)胞搗碎后胰酶消化、篩網(wǎng)過(guò)濾離心、細(xì)胞原代培養(yǎng)等4個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。此外還可包含神經(jīng)元鑒定的步驟。本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，改進(jìn)當(dāng)前體外分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，使之簡(jiǎn)單易行，培養(yǎng)獲得的神經(jīng)元生長(zhǎng)良好，純度高，產(chǎn)量大，可滿足神經(jīng)科學(xué)研究中細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。
文檔編號(hào)C12N5/0793GK102994451SQ20121056551
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者黃柏勝, 鄔力祥, 羅奇志, 韓仰, 羅潔 申請(qǐng)人:黃柏勝